端粒酶逆转录酶基因修饰人骨髓间质干细胞的实验

背景:人骨髓间充质干细胞经过有限次的细胞传代后,就会停止增殖,发生衰老和死亡。有研究表明,端粒与细胞寿命的控制密切相关,是否可通过外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达,诱导人骨髓间充质干细胞的端粒酶活性,维持端粒长度的稳定,从而延长人骨髓间充质干细胞的生命周期并保持其多潜能分化特性?目的:观察外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达对人骨髓间质干细胞端粒酶活性及细胞生命周期的影响。设计:重复测量实验。单位:郑州大学医学院干细胞研究中心。材料:实验于2003-10/2005-12在郑州大学医学院干细胞研究中心完成。人骨髓间质干细胞采自郑州大学第一附属医院及第三附属医院小儿外科和门诊20名健康志愿者。增强型绿色荧光蛋白-C1质粒和增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒由加拿大Dr.ChantalAutexier馈赠。DH5α菌株由郑州大学医学院重点分子医学实验室侯卫红博士馈赠。方法:无菌条件下,抽取健康志愿者胸骨骨髓2mL,经离心、洗涤及传代培养后备用。①阳离子脂质体转染及阳性克隆的筛选和扩增结果:将第5代人骨髓间充质干细胞接种至24孔培养板中,将携带有增强型绿色荧光蛋白报告基因和人端粒酶逆转录酶目的基因的质粒pEGFP-人端粒酶逆转录酶通过脂质体转染法转入人骨髓间充质干细胞中,转染共分4组:正常对照组、脂质体组、增强型绿色荧光蛋白-C1质粒组、增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒组,并用G418筛选法进行抗性克隆的筛选与扩增。②人骨髓间充质干细胞转染前后人端粒酶逆转录酶mRNA的表达及端粒酶活性的检测:通过RT-PCR和PCR-ELISA对选用转染增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒的第5代人骨髓间充质干细胞(以下简称为转H人骨髓间充质干细胞第5代)、转染增强型绿色荧光蛋白-C1质粒的第5代人骨髓间充质干细胞(以下简称为转C人骨髓间充质干细胞第5代)、未转染的第10代人骨髓间充质干细胞、K562细胞(阳性对照)转染前后人端粒酶逆转录酶mRNA的表达情况,对转H第5及30代人骨髓间充质干细胞、转C第5代人骨髓间充质干细胞及未转染的第10代人骨髓间充质干细胞端粒酶活性的影响进行检测。③转H人骨髓间充质干细胞染色体核型分析:采用胰蛋白酶-Giemsa染色法转H人骨髓间充质干细胞染色体核型分析。④转H人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞及RT-PCR鉴定:将转染细胞在重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子的联合诱导下向神经元样细胞定向诱导分化,并用RT-PCR进行鉴定(蛋白微管相关蛋白和神经丝亚单位M表达)。主要观察指标:①不同转染组阳离子脂质体转染及阳性克隆的筛选和扩增结果。②不同转染组人端粒酶逆转录酶mRNA的表达及端粒酶的活性。③转H人骨髓间充质干细胞染色体核型分析结果。④转H人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞及RT-PCR鉴定结果。结果:①随G418浓度的下降,正常对照组、脂质体组细胞全部死亡,从而得到稳定表达增强型绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞;经G418加压筛选后得到1个连续传到第35代且生长旺盛的抗性细胞克隆,倒置显微镜下观察与未转染人骨髓间充质干细胞相比无明显差异。②转C第5代人骨髓间充质干细胞和未转染第10代人骨髓间充质干细胞的人端粒酶逆转录酶mRNA表达阴性,而K562和转H第5代人骨髓间充质干细胞的人端粒酶逆转录酶mRNA表达阳性。③转H第5代人骨髓骨髓间充质干细胞组和转H第30代人骨髓间充质干细胞端粒酶为阳性。④转H人骨髓间充质干细胞第10,20,30代的染色体总数均为23对,且含2条X性染色体,仍为正常2倍体,染色体形态和数目均正常。⑤较多转H人骨髓间充质干细胞出现了典型的神经元样形态,且经RT-PCR检测表明,神经元特征性蛋白微管相关蛋白和神经丝亚单位M表达增强。结论:外源性人端粒酶逆转录酶基因可以在人骨髓间充质干细胞中获得异位表达,并能诱导人骨髓间充质干细胞的端粒酶活性。外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达不仅可以使人骨髓间质干细胞的寿命明显延长而且不影响其维持干细胞的多向分化潜能特性。     

骨髓间充质干细胞向内皮细胞的分化和临床应用

背景：目前国内外研究初步证明,骨髓间充质干细胞可以诱导分化为血管内皮细胞。目的：综述骨髓间充质干细胞向内皮细胞的分化和临床研究进展。方法：应用计算机检索2000/2011PubMed数据库相关文章,检索词为＂bonemarrowmesenchymalstemcell,endotheliacell,differentiation,tissueengineered＂,并限定文章语言种类为English。同时计算机检索2000/2011万方数据库相关文章,检索词为＂骨髓间充质干细胞,内皮细胞,分化,临床应用＂,并限定文章语言种类为中文。共检索到文献418篇,最终纳入符合标准的文献31篇。结果与结论：骨髓间充质干细胞具有自我更新和多向分化潜能,在一定的诱导条件下可以向血管内皮细胞分化。血管内皮细胞是组织工程化血管的重要组成成分。利用骨髓间充质干细胞进行血管内皮构建,既可促进组织工程化器官的血管再生,又为组织工程化器官提供血供,同时也为临床治疗缺血性疾病奠定了基础。     

骨髓间充质干细胞在医学领域中的研究与应用

目的:骨髓间充质干细胞主要存在于全身结缔组织和器官间质中,自我更新和增殖能力强,在适宜的微环境里具有多向分化潜能。文章就骨髓间充质干细胞的生物学特性及其在医学领域应用的最新进展做一综述。资料来源:应用计算机检索PUBMED2000-01/2006-12期间的相关文章,检索词为“mesenchymal stem cell”,并限定文章语言种类为English。同时计算机检索中国期刊全文数据库2000-01/2006-12期间的相关文章,检索词为“骨髓间充质干细胞”,并限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文。纳入标准:文章所述内容应与骨髓间充质干细胞的发展现状及其临床应用相关。排除标准:重复研究或较陈旧的文献。资料提炼:共收集到160篇相关文献,68文献符合纳入标准,排除的92篇文献为内容陈旧或重复。选取符合纳入标准的30篇文献进行分析,分别涉及骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定、在医学领域中的应用、当前存在的问题及展望。资料综合:骨髓间充质干细胞是一类具有分裂增殖和多向分化潜能的干细胞,在适宜的诱导条件下可定向分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、腱细胞、肌肉细胞和神经细胞等,且已在退行性及缺损性疾病、心血管疾病、肝移植、肺纤维化等疾病治疗方面取得良好效果。目前骨髓间充质干细胞在体内的细胞生物学和分子生物学作用机制仍不清楚,如何限定体内外诱导条件使其向所需细胞或组织定向分化以及移植时机、是否具有致瘤性等问题尚需深入研究。结论:骨髓间充质干细胞具有易获得、易培养、低免疫原性、易于外源基因的转入和表达等特性,已成为具有细胞治疗和基因治疗临床疾病潜在实用价值的有效载体。     

间充质干细胞的来源

目的:间充质干细胞具有强大的增殖能力和多向分化潜能,文章对其主要的来源途径予以综述。资料来源:应用计算机检索Medline1991-01/2006-01期间的相关文章,检索词为“mesenchyma stem cells,origin,research progress”,并限定文章语言种类为English。同时计算机检索中国期刊全文数据库1998-01/2006-10期间的相关文章,检索词为“间充质干细胞,来源,研究进展”,并限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文。纳入标准:①间充质干细胞的起源。②间充质干细胞研究进展、干细胞的分离及鉴定。排除标准:重复研究、个案报告或Meta分析类文章。资料提炼:共收集到96篇相关文献,40篇文献符合纳入标准,排除的56篇文献为内容陈旧或重复。符合纳入标准的40篇文献中,分别涉及骨髓、肌肉、脐血、胎盘、外周血、脂肪组织、血管及其他来源的间充质干细胞。资料综合:间充质干细胞是属于中胚层的一类多能干细胞,具有强大的增殖能力和多向分化潜能,动物模型试验和临床应用研究也取得了一定的效果。间充质干细胞来源广泛,易于获得,临床上为神经损伤及其他系统的损伤修复提供了更为广泛的途径。结论:间充质干细胞主要来源于骨髓、肌肉、脐血、外周血、胎盘等组织,具有广阔的应用前景。     

骨髓间充质干细胞体外培养及其归巢机制

背景: 骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能的特性,体外可多次传代培养,在特定的情况下,多种因子参与调控其到达损伤的组织器官进行修复重建.目的: 综述骨髓间充质干细胞归巢机制及其临床应用前景.方法: 应用计算机检索1999-01/2008-12 SCI数据库相关文章,检索词为"bone marrow mesenchymal stem cell,homing,clinical,therapy",并限定文章语言种类为English.共检索到文献66篇.结果与结论: 骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中除造血干细胞以外的另一类具有"无限"增殖和多向分化潜能的干细胞.在一定的诱导条件下,这类细胞可归巢到特定的组织并分化为相应组织细胞,发挥修复重建作用,此外,它还具有易提取、扩增能力强、不存在伦理问题和排斥反应等优点,由于这些优点,其将成为当今社会医学领域中很多难治之症的希望所在.     

端粒、端粒酶与干细胞

端粒、端粒酶与干细胞密切相关,在维持干细胞自我更新和增殖能力中起重要作用.端粒是真核细胞染色体末端的DNA重复序列和特异结合蛋白的复合体,富含鸟嘌呤,具有保护染色体的作用,端粒长度反映细胞的复制史及复制潜能.影响端粒长度的凶素包括:端粒结合蛋白、端粒帽蛋白、端粒酶及DNA复制酶等,其中端粒酶是最主要的因素.端粒酶位于端粒末端,作用是合成端粒DNA序列,以抵消或延缓端粒随细胞分裂的不断缩短.端粒酶活性的丧失及其增殖相关基因表达的改变是造成干细胞体外复制和扩增受限的主要原因.随着组织细胞工程学的兴起,体外定向诱导干细胞分化为各种所需组织细胞已经成为研究的焦点,因此诱导和增加端粒酶的活性,维持干细胞分化、自我更新和增殖能力,延长干细胞的寿命具有重要意义.     

骨髓间充质干细胞在骨及软骨组织工程中的应用

目的:总结近年来骨髓间充质干细胞在骨及软骨组织工程中应用的文献,阐明骨髓间充质干细胞在骨及软骨组织工程中的应用前景。资料来源:应用计算机检索Medline1996-01/2004-12文章,检索词为“Bonemarrowmesenchymalstemcells,Bonetissueengineering,Cartilagetissueengineering”限定文章语言种类为English。资料选择:纳入标准:骨髓间充质干细胞在骨及软骨组织工程中应用的文献。排除标准:①较陈旧的文献。②重复研究。资料提炼:共收集到190篇与骨髓间充质干细胞和骨及软骨组织工程有关的文献,其中30篇符合纳入标准。资料综合:①骨髓间充质干细胞的成骨分化:骨髓间充质干细胞具有在一定的环境下向成骨细胞和软骨细胞分化的能力。②骨髓间充质干细胞在骨和软骨组织工程中的应用:研究表明,骨髓间充质干细胞复合适宜载体可用来修复骨缺损,但因骨缺损的多样性和载体材料本身的特点,目前尚未找到理想的骨组织工程支架材料,还未探明骨髓间充质干细胞与支架材料复合的最佳浓度和最佳时间;骨髓间充质干细胞体外诱导性培养和体内关节软骨的修复均能有效地生成软骨,但只能达到组织形态及生化成分上类似,不能实现与原有软骨相同的再生。③骨髓间充质干细胞的软骨分化潜能:骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,适宜条件下还能向软骨方向分化,但其增殖和定向软骨分化需适宜生长因子调控。结论:骨髓间充质干细胞完全具备理想的骨软骨组织工程种子细胞的特点,在骨软骨组织工程方面是非常有应用前景的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞移植治疗骨性关节炎软骨缺损

学术背景:由骨性关节炎所造成的关节软骨缺损,如果采用传统治疗方法常难以自行完善修复。近年研究发现骨髓间充质干细胞具有较强的自我更新能力和多向分化潜能,在特定的诱导条件下可分化为软骨细胞。目的:总结骨髓间充质干细胞移植治疗骨性关节炎软骨缺损的研究进展。检索策略:由该论文的研究人员应用计算机检索Pubmed数据库2000-01/2006-12的相关文献,检索词"Mesenchymal stem cells,Osteoarthritis,Cartilage defect,Chondrocyte",并限定文章语言种类为English。共检索到57篇文献,对资料进行初审,纳入标准:①与骨髓间充质干细胞修复骨性关节炎软骨缺损密切相关。②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章。排除标准:重复性研究。文献评价:文献的来源主要是骨髓间充质干细胞修复骨性关节炎软骨缺损方面的随机对照试验。所选用的33篇文献中,5篇为综述,其余均为临床或基础实验研究。资料综合:①骨性关节炎的发病率随着老年人口的增长而呈不断上升趋势,因此需要一种有效的促进软骨修复的治疗方法。②骨髓间充质干细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能,在合适细胞因子调控下可分化为软骨细胞。③研究表明,骨髓间充质干细胞复合适当支架可以修复软骨缺损;其在体外诱导培养以及体内移植均能生成软骨,组织形态和化学成分与关节透明软骨接近。④关于骨髓间充质干细胞在软骨修复方面的研究虽已取得较大进展,但仍存在许多问题,如种子细胞的保存;细胞体外培养中分化增殖的调控机制不十分清楚;产生的软骨组织的生物力学性能不太满意;新生软骨中后期是否发生退化;修复组织内细胞分子生物学特性等。结论:骨髓间充质干细胞作为理想的种子细胞,为修复骨性关节炎软骨缺损提供机会窗口,开启了临床应用干细胞治疗的时代,这将为解决骨性关节炎软骨缺损后难以治愈带来曙光。     

骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死的作用及近况

目的:文章就骨髓间充质干细胞治疗脑梗死的应用研究进展及其治疗作用机制进行综述。资料来源:应用汁算机检索Medline1999-01/2006-11骨髓间充质干细胞相关细胞修复的文献,检索词"mesenchymal stemcells,cerebral ischemia,stroke"并限定文献语言种类为English。资料选择:对资料进行初审,选择包含骨髓间充质干细胞治疗脑缺血的基础研究文章,排除重复研究、综述类文献。资料提炼:纳人35篇符合标准的文献,对骨髓间质干细胞在脑梗死中的应用及其修复机制进行归纳。资料综合:①骨髓间充质干细胞具有高度的自我复制能力和多向分化潜能,可分化成多种细胞。骨髓间充质干细胞移植是近年来医学领域的研究热点,被用于脑梗死动物模型的治疗。②骨髓间充质干细胞对脑梗死动物模型具有较好的治疗作用。③骨髓间充质干细胞能够激活内源性的修复机制。④骨髓间充质干细胞移植后能够分泌大量营养因子从而发挥其神经保护和营养支持作用。结论:骨髓间充质干细胞对脑梗死具有较好的治疗作用,主要通过其移植后分泌大量营养因子从而发挥对脑梗死的治疗作用。     

骨髓间充质干细胞移植在股骨头坏死修复中的应用

目的:综述骨髓间充质干细胞在治疗股骨头坏死的修复作用及价值。资料来源:应用计算机检索Medline 2001-01/2006-12有关骨髓间充质干细胞和股骨头坏死的文献,检索词“bone mesenchymal stem cell,femoral head,osteonecrosis,medical treatment”,并限定文章语言种类为English。同期检索中国期刊全文数据库2001-01/2006-12有关文献,检索词“骨髓间充质干细胞,股骨头坏死,成骨作用”,限定文章语言种类为中文。资料选择:对检索到的资料进行初审,选取针对性强的文献,并查看每篇文献后的引文,以近5年且发表在较权威杂志者优先。资料提炼:共检索到234篇相关文献,92篇文章符合要求,排除142篇重复性文章,纳入30篇。资料综合:骨髓间充质干细胞是存在于骨髓组织中的多种干细胞的混和体,其具有多向分化潜能,在特定条件下能分化为成骨细胞,可作为细胞移植治疗股骨头坏死。许多基础与前期临床实验清楚地表明,骨髓间充质干细胞移植治疗股骨头坏死有很大的临床应用潜力,在不同条件下的临床试验已经开展。结论:在适宜的条件下,骨髓间充质干细胞经诱导可在体内、体外分化为成骨细胞,将其注入坏死的股骨头内、产生的细胞可在坏死部位存活,明显修复坏死的股骨头。