运用3'RACE验证LongSAGE文库构建后白念珠菌不同菌相的差异表达基因

目的鉴定从LongSAGE文库筛选到的白念珠菌不同菌相表达基因差异表达标签JMD8和JSW10所代表基因.方法诱导白念珠菌菌丝相的表达后,运用3'RACE技术扩增白念珠菌差异表达基因标签基因片段,纯化回收后,T/A连接,经氯化钙法转化大肠杆菌, X-gal/IPTG诱导表达,在阳性菌株中抽提质粒后酶切、测序.结果两个片段均能在GenBank中找到同源序列,Score值小于40,Evalue小于0.5.结论鉴定了白念珠菌LongSAGE标签JMD8和JSW10代表的基因分别为EFT2和SHMI I.     

运用3′RACE验证LongSAGE文库构建后白念珠菌不同菌相的差异表达基因

目的　鉴定从LongSAGE文库筛选到的白念珠菌不同菌相表达基因差异表达标签JMD8和JSW10所代表基因。方法　诱导白念珠菌菌丝相的表达后,运用3′RACE技术扩增白念珠菌差异表达基因标签基因片段,纯化回收后,T/A连接,经氯化钙法转化大肠杆菌,X gal/IPTG诱导表达,在阳性菌株中抽提质粒后酶切、测序。结果　两个片段均能在GenBank中找到同源序列,Score值小于40 ,Evalue小于0 5。结论　鉴定了白念珠菌LongSAGE标签JMD8和JSW 10代表的基因分别为EFT2和SHMII。     

利用SAGE标签产生长片段cDNA应用于白念珠菌基因识别

目的鉴定本实验室建立的白念珠菌LongSAGE文库。方法运用利用SAGE标签产生长片段cDNA应用于基因识别(GLGI)技术将白念珠菌的酵母相和菌丝相17bp的LongSAGE标签扩增至相应的3′cDNA端,获得数百个碱基片段,并进行序列分析。结果20个标签中有15个获得稳定有效的扩增,长度在200～1000bp之间,获得的长片段进行序列分析后,有超过95%的碱基与已知基因相同,并且包括原来17bp的SAGE标签,表明获得的序列为此已知基因。结论研究表明,用SAGE标签作为引物,可有效地识别基因。利用SAGEGLGI技术可以用来说明更多的白念珠菌的表达基因序列和其它真核生物的基因组。     

87例无菌体液中的假丝酵母菌的分布及耐药情况分析

目的 了解无菌体液中假丝酵母菌的分布及耐药情况.方法 收集我院2008年1月至2010年12月三年里用法国梅里埃ATB FUNGUS真菌鉴定板与科玛嘉念珠菌显色鉴定培养基联合分离出来假丝酵母菌87例,用ROSCO纸片法测定其耐药性.结果:白假丝酵母菌最多占总分离株的52%、热带假丝酵母菌占23%、光滑假丝酵母菌占12.6%、近平滑假丝酵母菌占6%,可柔假丝酵母菌2%、其它假丝酵母菌共占4.4%.结果 无菌体液中假丝酵母菌对氟胞嘧啶的耐药率达到83.5%,其它药物的耐药性也比相关报导有上升趋势.结论 真菌药品单一,应做好假丝酵母菌的药物敏感实验,指导临床合理用药.     

220例妊娠期妇女外阴阴道假丝酵母菌菌种分析

目的:了解本地区妊娠期妇女外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)的致病菌种及检出率.方法:随机对220例门诊妊娠期妇女阴道分泌物进行假丝酵母菌涂片、培养及菌种鉴定.结果:妊娠期妇女外阴阴道假丝酵母菌的检出率为30.91%,以白假丝酵母菌为主,占79.59%,其次是光滑假丝酵母菌占18.37%,克柔假丝酵母菌占2.04%.结论:妊娠期妇女外阴阴道假丝酵母菌的检出率较非孕妇女高,以白假丝酵母菌为主,光滑假丝酵母菌是非白假丝酵母菌的主要菌种,其发病机制涉及多方面的因素.     

消炎痛对鼠白假丝酵母菌阴道炎模型中菌丝生长及IL12、TGF-β1表达的影响

目的 以小鼠为模型,探讨雌激素诱发白假丝酵母菌性阴道炎的免疫学发病机制,观察阴道内应用消炎痛对白假丝酵母菌性阴道炎的治疗效果,并分析其作用机制.方法 设雌激素化小鼠白假丝酵母菌性阴道炎模型组(EI)和模型用药(消炎痛)组(Indo),另设单一白假丝酵母菌感染组(I)、单一雌激素化组(E)和空白对照组(C).在接种后4、7、14 d动态观察小鼠阴道灌洗液中白假丝酵母菌菌丝生长情况,并进行阴道组织病理学观察.分别采用免疫组织化学法及酶联免疫吸附(ELISA)法检测小鼠阴道组织TGF-II、IL-2水平.结果 Indo组小鼠未见菌丝,仅见孢子,EI组见大量菌丝生长.雌激素可上调小鼠阴道组织TGF-βl表达及下调IL-2水平(E组比C组,均P<0.05),EI组和I组的TGF-βl水平显著高于C组(均P<0.01),而白假丝酵母菌感染后IL-2水平未见升高(均P>0.05).与EI组比较,Indo组在第4、7天阴道组织TGF-βl水平明显降低(均P<0.01),IL-2水平明显增高(分别为P<0.05,P<0.01).结论 雌激素能降低小鼠阴道局部免疫能力.白假丝酵母菌感染时小鼠阴道缺乏防护性的细胞免疫反应;消炎痛具有既能抑制白假丝酵母菌菌丝生长,又能调节阴道局部抗白假丝酵母菌感染免疫功能的双重作用,有望成为一种治疗白假丝酵母菌性阴道炎的新靶向药物.     

高效提取二相性白假丝酵母菌总RNA实验研究

目的:探讨高效、简便提取白假丝酵母菌孢子相及菌丝相细胞总RNA的方法.方法:采用液氮法、超声法及玻璃珠(直径0.55 cm)法提取白假丝酵母菌的孢子相和菌丝相细胞总RNA,紫外分光光度计检测所提取的二相性白假丝酵母菌总RNA的OD260及OD280,琼脂糖凝胶电泳检测所提取的二相性白假丝酵母菌总RNA的完整性.结果:液氮法、超声法及玻璃珠法提取白假丝酵母菌孢子相总RNA的浓度分别为(1.021±0.145)g/L、(0.923±0.031) g/L、(1.121±0.175) g/L,纯度分别为1.697±0.087、1.474±0.064、1.897±0.047;液氮法、超声法及玻璃珠法提取白假丝酵母菌菌丝相总RNA的浓度分别为(0.357±0.260) g/L、(0.287±0.023)g/L、(0.523±0.056) g/L,纯度分别为1.548±0.047、1.474±0.064、1.874±0.064;电泳结果显示,应用玻璃珠法提取的孢子相和菌丝相总RNA 28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA三条带均明显显示,而采用液氮法、超声法提取的总RNA三条带不明显.结论:RNAiso Plus试剂联合直径为0.55 cm的玻璃珠法提取的白假丝酵母菌孢子相及菌丝相细胞的总RNA浓度及纯度均较液氮法和超声法好,值得推广.     

pvdQ基因在铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌形态抑制作用中的功能

目的拟研究长链高丝氨酸内酯降解基因pvdQ在铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌形态抑制作用中的功能。方法通过乙酸锂转化法构建CAI-4HWP1-LacZ菌株,使用X-gal平板显色法检测3-oxo-C12-HSL对白假丝酵母菌形态转换的影响;观察与铜绿假单胞菌pvdQ高表达株、野生株PAO1共同培养时,白假丝酵母菌的形态变化,了解pvdQ基因在铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌形态抑制作用中的功能。结果 400μg 3-oxo-C12-HSL即可完全抑制白假丝酵母菌的形态转换。铜绿假单胞菌pvdQ高表达株和野生株PAO1均可抑制白假丝酵母菌菌丝形成。pvdQ高表达株对白假丝酵母菌的形态抑制作用较野生株PAO1减弱。结论铜绿假单胞菌通过分泌信号分子3-oxo-C12-HSL,可抑制白假丝酵母菌形态转换。随着pvdQ表达增加,铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌的形态抑制作用减弱,即pvdQ基因在铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌形态抑制作用中起负性调节作用。其作用机制可能与pvdQ基因对3-oxo-C12-HSL的水解作用有关。     

急性心肌梗死大鼠心肌基因表达谱构建、鉴定及功能基因的研究

目的:构建急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)大鼠缺血心肌基因表达谱,对筛选出的目标基因进行功能研究.方法:结扎Wistar大鼠冠状动脉左前降支建立AMI模型,饲养7d处死,提取正常和缺血心肌总RNA,应用长标签基因表达系列分析(long serial analysis of gene expression, LongSAGE)方法,构建AMI后大鼠缺血心肌基因差异表达谱,运用荧光定量PCR技术验证差异基因表达谱的可靠性,同时应用该技术定量两个功能基因的表达.生化法检测功能基因所表达的蛋白酶活性.结果:在建立的AMI后缺血心肌和正常心肌组织LongSAGE标签库中,共获得标签15966个,对照NCBI网站BLAST结果,发现新核苷酸序列标签7665个.与正常组比较,142个基因在AMI大鼠心肌组织中的表达差异有统计学意义(P<0.05),这些差异基因主要与氧化磷酸化、三磷酸腺苷(ATP)合成、糖异生等能量代谢通路相关.荧光定量PCR的鉴定结果与LongSAGE差异表达结果基本一致.筛选能量代谢相关基因COX5a、ATP5e作为研究目标,荧光定量PCR结果提示2个基因在RNA水平表达下调;与之平行对应的功能蛋白酶的活性也相应降低.结论:AMI可引起多基因表达异常,能量代谢作用通路相关基因的异常表达可能是造成AMI心肌损伤的重要分子机制之一,干预COX5a和ATP5e等功能基因的表达可能是AMI能量代谢治疗的新靶点.     

基因表达连续分析标签数据库的实时定量多聚酶链反应验证

目的 采用实时定量多聚酶链反应(PCR)技术验证不同丰度和匹配度的基因表达序列标签,尝试用该技术补充和完善高通量基因表达谱的结果.方法 根据各基因序列全长设计引物,选择9个单匹配标签,6个多匹配标签,1个美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库更新后无匹配标签和2个无匹配基因进行实时定量PCR验证.结果 挑选的所有基因均得到特异性扩增.基因表达量分析结果显示,基因表达连续分析(SAGE)文库中9个单匹配标签表达趋势和定量结果一致,且具有显著性差别;6个多匹配标签中有3个标签表达趋势和定量结果一致,且具有显著性差别;1个NCBI数据库更新后无匹配标签表达趋势和定量结果相反;2个无匹配基因表达量数据提示两组间没有显著性差别.结论 实时定量PCR技术是验证SAGE等高通量数据的可靠工具之一.SAGE文库标签匹配度可影响数据的可信度.     

垂体腺瘤组织和瘤周正常垂体组织基因表达系列分析文库的构建和初步分析

目的探讨垂体腺瘤组织和瘤周正常垂体组织中基因表达特点及差异。方法采用基因表达系列分析方法(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)分别构建垂体腺瘤组织和瘤周正常垂体组织的SAGE文库,在两个SAGE库中各挑取40个阳性克隆测序,用SAGE2000软件对序列文件进行分析并与美国国立卫生研究院的SAGEmap进行数据比较,从而了解不同组织基因表达情况。结果在瘤周正常垂体组织的40个序列文件中提取到655个基因标签,可确认代表43个不同的基因;垂体腺瘤组织的40个序列文件中提取到737个基因标签,可确认代表53个不同的基因,这些基因标签中有13个是以往未报道的新的基因标签。瘤周正常垂体组织和垂体腺瘤组织中与垂体激素分泌及能量代谢有关的一些基因表达水平较高。两种组织中均有生长因子和细胞因子的表达,其中包括与免疫系统有关的细胞因子。但是,瘤周正常垂体组织和垂体腺瘤组织基因表达又存在明显差异,分别有31个和5个基因标签仅在特定组织中检测到。结论瘤周正常垂体组织和垂体腺瘤组织中都存在与垂体激素分泌及能量代谢有关的一些基因的高表达以及生长因子和细胞因子的表达,同时两种组织基因表达又存在明显差异。用SAGE方法既能较完整地获得基因表达丰度的量化信息,又可以发现新基因。     

不同菌相白念珠菌对巨噬细胞凋亡的影响

目的：观察不同菌相白念珠菌诱导巨噬细胞凋亡情况,为疾病的预防和治疗提供思路.方法：用佛波醇酯刺激THP-1细胞分化为巨噬细胞,用酵母相、菌丝相及用胃蛋白酶抑制剂（pepstatin,PEP）预处理的白念珠菌分别作用巨噬细胞1、2、4、8 h;另设空白对照组,AnnexinV-FITC染色后流式细胞仪检测细胞的凋亡率.结果：酵母相、菌丝相、PEP作用组的白念珠菌分别感染巨噬细胞1、2、4、8 h的细胞凋亡率均较空白对照组升高（P〈0.05~P〈0.01）;各作用组均随时间的延长凋亡率不断升高（P〈0.01）;酵母相组和菌丝相白念珠菌组不同时间细胞凋亡率均较PEP作用组明显增加（P〈0.01）,并且菌丝相组细胞凋亡率明显高于酵母相组（P〈0.01）.结论：白念珠菌可诱导巨噬细胞凋亡,其作用与其菌相及其分泌型天冬氨酸蛋白酶有关.     

白色念珠菌二相性与口腔致病性关系的实验研究

目的　探讨白色念珠菌二相性与口腔致病性的关系。方法　分别将孢子相、菌丝相白色念珠菌与人口腔颊粘膜细胞 (BEC)进行粘附试验 ,比较二相性白色念珠菌对BEC的粘附率 ;用兔抗人sIgA血清中和人唾液中sIgA ,12 5Ⅰ sIgA放射免疫分析法检测唾液中sIgA的浓度 ,比较含sIgA及不含sIgA的唾液对二相性白色念珠菌粘附BEC的影响。 结果　菌丝相白色念珠菌对BEC的粘附率显著高于孢子相 (P <0 .0 0 1) ;含sIgA的唾液抑制孢子相及菌丝相白色念珠菌粘附BEC的能力强于不含sIgA的唾液 (P <0 .0 0 5 ) ,且唾液中sIgA抑制孢子相白色念珠菌粘附BEC的能力强于抑制菌丝相白色念珠菌粘附BEC的能力 (P <0 .0 5 )。结论　菌丝相白色念珠菌的口腔致病性强于孢子相     

阴道白念珠菌毒力因子表达水平及与耐药的相关性

目的 了解复发性念珠菌性阴道炎（RVVC）患者与阴道白念珠菌定植者的阴道白念珠菌的生物膜、水解酶和菌丝壁蛋白1(HWP1)基因等毒力因子的体外表达水平及其耐药性,初步探究白念珠菌致病性和耐药性与毒力因子之间的关系,为进一步探明白念珠菌引起的RVVC的致病和耐药机制提供资料。方法 前瞻性收集分离来源于成年女性RVVC患者和阴道白念珠菌定植者的100株阴道白念珠菌,采用酵母样真菌药物敏感性试剂盒检测对5种常用抗真菌药物的敏感性,采用结晶紫染色法检测其生物膜形成能力,采用牛血清白蛋白平板、卵黄琼脂平板和三丁酸甘油脂平板检测阴道白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶（SAP）、磷脂酶（PL）和脂肪酶（Lip）的活性,采用实时荧光PCR检测HWP1基因的表达。结果 5种常用抗真菌药物中至少1种耐药的白念珠菌RVVC患者来源有13株,阴道定植者来源有10株;RVVC患者来源菌株的生物膜、3种分泌型水解酶和HWP1基因体外表达水平均高于阴道定植者来源菌株（均P<0.05）,两组在生物膜形成强弱、3种水解酶表达高低等定性角度,差异均有统计学意义（均P<0.05）;耐药性菌株生物膜表达水平高于非耐药性...     

The Gene Expression Patterns of Peripheral Blood Mononuclear Cells in Patients with Systemic Lupus Erythematosus

This study examined the gene expression patterns of peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) in patients with systemic lupus erythematosus(SLE) by using serial analysis of gene ex-pression(SAGE) technology.Following the construction of serial analysis of gene expression(SAGE) library of PBMCs collected from 3 cases of familial SLE patients,a large scale of tag sequencing was performed.The data extracted from sequencing files was analyzed with SAGE 2000 V 4.5 software.The top 30 expressed genes of SLE patients were uploaded to http://david.niaid.nih.gov/david/ease.htm and the functional classification of genes was obtained.The differences among those expressed gene were analyzed by Chi-square tests.The results showed that a total of 1286 unique SAGE tags were identified from 1814 individual SAGE tags.Among the 1286 unique tags,86.8% had single copy,and only 0.2% tags had more than 20 copies.And 68.4% of the tags matched known expressed sequences,41.1% of which matched more than one known expressed sequence.About 31.6% of the tags had no match and could represent potentially novel genes.Ap-proximately one third of the top 30 genes were ribosomal protein,and the rest were genes related to metabolism or with unknown functions.Eight tags were found to express differentially in SAGE li-brary of SLE patients.This study draws a profile of gene expression patterns of PBMCs in patients with SLE.Comparison of SAGE database from PBMCs between normal individuals and SLE pa-tients will help us to better understand the pathogenesis of SLE.     

7种假丝酵母菌耐药相关基因GeXP检测方法的建立

目的：利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,建立一种可同时检测7种假丝酵母菌耐药相关基因RNA表达水平的方法。方法：设计7种（MDR1、FlU1、CDR1、CDR2、ADH1、ERG3、ERG11）已知与白假丝酵母耐药相关基因的特异性引物及假丝酵母ITS基因参照引物,优化多重反应体系及反应条件,用热带假丝酵母标准株来验证多重反应体系的特异性,通过比较标准株和临床敏感株,剂量依赖株及耐药株各基因表达峰图,分析不同菌株各基因表达差异。结果：经过优化反应条件,可同时扩增出假丝酵母耐药相关的7种基因特异片段,耐药株和剂量依赖株的ERG11、CDR2、CDR1、MDR1和ERG3基因的相对表达量与敏感株相比均有不同程度的增高。结论：建立了多重基因表达检测体系,GeXP多重基因表达检测方法具有高通量、特异性强、灵敏度高和快速等优点。     

基因芯片在白念珠菌耐药基因研究中的应用

近年来,临床上白念珠菌耐药现象日趋增多,利用基因芯片来绘制基因表达图谱是目前研究白念珠菌酎药基因最常用的手段.通过基因芯片对菌株在不同药物处理或经不同途径产生耐药表型后大量差异表达基因进行分析,可用来寻找耐药相关基因,并阐明其功能,更有助于多基因协同作用机制的深入研究.