人胰腺癌CD133＋／ABCG2＋肿瘤细胞亚群筛选及耐药性研究

目的：本研究筛选胰腺癌患者肿瘤组织中筛选CD133＋/ABCG2＋肿瘤细胞亚群。发现该亚群细胞高表达干细胞的生物标志Nanog,Oct4、SoX2等。方法：该亚群细胞在体外增殖和克隆形成能力明显增强,对于常用化疗药物顺铂和吉西他滨具有耐药性。少量该亚群细胞即可在免疫缺陷小鼠体内形成肿瘤。通过检测该亚群细胞中ABCG2基因启动子区域的CpG岛（ CpG islands） DNA甲基化修饰状态。结果：表明该亚群细胞中ABCG2基因启动子区域的CpG岛处于去甲基化状态。本实验结果提示胰腺癌患者肿瘤组织中筛选CD133＋/ABCG2＋肿瘤细胞亚群,并利用该群细胞在体外建立了肿瘤耐药性研究模型。结论：对于胰腺癌CD133＋/ABCG2＋细胞研究可为开发胰腺癌个体化治疗和新型化疗药物的设计和研发提供理论依据。     

Oct4和Nanog基因沉默对胰腺癌干细胞耐药性的影响

目的观察通过RNA干扰同时沉默Oct4和Nanog基斟对胰腺癌干细胞（PCSCs）化疗药物耐药性的影响,探索提高胰腺癌化疗效果的新方法。方法通过流式细胞仪从人胰腺癌细胞系PANC—1中分离出CD44＋CD24＋ESA＋的PCSCs,体外建株,通过构建特异性慢病毒shRNA—Oct4／Nanog载体同时沉默PCSCs的Oct4和Nanog基因,分选出基因沉默的PCSCs（PCSCs—shOct4＋shNanog）,通过CCK8细胞活性检测法观察其对化疗药物吉西他滨敏感性的变化,Real—TimeRT—PCR和Westernblotting检测耐药相关基因ABCG2的表达。结果CD44＋CD24＋ESA＋的PCSCs高度表达Oct4和Nanog基因,在体外表现为对吉西他滨的耐药性增强。Oct4和Nanog基因同时被沉默后PCSCs干性特征出现抑制,ABCG2表达下降,耐药性降低,差异均以统计学意义（P〈0．05）。结论Oct4和Nanog基因在保持PCSCs肿瘤干性特性方面发挥重要作用,沉默二者表达后PCSCs的耐药性受到抑制。     

基于ABCG2的卵巢癌干样细胞分选及体外生物学研究

目的探讨卵巢癌干样细胞（OCSCs）的生物学特点,分析OCSCs与卵巢癌细胞三磷酸腺苷结合盒跨膜转运蛋白G超家族成员2（ABCG2）表达的相关性,阐述两者与卵巢癌化疗抗药的关系。方法采用ABCG2特异性抑制剂FTC作为侧群法流式细胞分选对照组的抑制剂,分选并检测卵巢癌细胞株中侧群（SP）细胞比例。体外克隆形成实验和体外分化实验研究细胞增殖、分化等生物学特点。噻唑蓝法检测卵巢癌SP细胞与非侧群（NSP）细胞对常用卵巢癌化疗药物的敏感性,并检测卵巢癌细胞株ABCG2+细胞比例。结果卵巢癌细胞中存在SP细胞,分选纯度达95%左右,其中SP细胞比例在0.19%~4.88%。SP细胞具有体外分化能力,且体外克隆形成能力明显高于NSP细胞。卵巢癌SP细胞显示抗药性,顺铂、紫杉醇、吉西他滨及多柔比星对SP细胞的半数抑制浓度明显高于NSP细胞（均P＜0.05）。卵巢癌细胞中SP细胞比例与ABCG2+细胞比例呈正相关。结论OCSCs具有较强的增殖和体外分化、克隆形成能力,对化疗药物抗药性强。OCSCs比例与耐药蛋白ABCG2存在正相关性,或为卵巢癌治疗中逆转耐药提供新的靶点。     

顺铂耐药卵巢癌细胞化疗敏感性实验

【目的】研究顺铂（DDP）、洛铂（LBP）、紫杉醇（PTX）、吉西他滨（GEM）对卵巢癌SKOV3细胞及顺铂耐药SKOV3/DDP细胞增殖的影响。【方法】培养基中不含药物的处理组为对照组,加入不同浓度化疗药物的处理组为实验组。在相差显微镜下观察细胞形态变化;用MTT法测定单药应用、双药联合使用对两种细胞生长的影响;流式细胞仪分析细胞周期和凋亡率的变化。【结果】SKOV3∕DDP细胞耐药指数为7.10±2.19。紫杉醇、洛铂、吉西他滨对两种细胞的抑制率无明显差别。洛铂、紫杉醇、吉西他滨两药联合组与相应单一用药组相比,能显著抑制肿瘤细胞的生长,其中吉西他滨＋洛铂及紫杉醇＋洛铂组抑制率明显增高。相同浓度顺铂作用48h后,SKOV3/DDP细胞的凋亡率低于SKOV3细胞。洛铂、紫杉醇、吉西他滨作用两种细胞48h后,细胞凋亡率差异无统计学意义。顺铂、洛铂与紫杉醇、吉西他滨主要作用于不同的细胞周期。【结论】SKOV3/DDP细胞对紫杉醇、洛铂、吉西他滨无交叉耐药。联合用药有高效协同抑制细胞生长作用,临床治疗卵巢癌顺铂耐药患者可考虑选择吉西他滨＋洛铂、紫杉醇＋洛铂联合化疗。     

多西环素增加卵巢癌细胞HO8910对顺铂化疗敏感性

目的探讨多西环素对卵巢癌的抗肿瘤作用及可能机制。方法采用MTT方法检测多西环素单独作用及与顺铂联合用药时对卵巢癌细胞HO8910增殖的影响;采用RT-RCR检测卵巢癌细胞HO8910中CXCR4mRNA的表达;采用蛋白质免疫印迹法检测多西环素作用后卵巢癌细胞HO8910中CXCR4表达的改变。结果较低浓度多西环素(10μg/mL)作用48h后即可抑制卵巢癌细胞HO8910的增殖活力(P<0.01),当其浓度为50μg/mL时抑制率达(70±2)%。多西环素与顺铂联合用药后对癌细胞的抑制效应大于同一浓度顺铂单独作用时,可提高癌细胞对顺铂的化疗敏感性。多西环素抑制卵巢癌细胞HO8910中CXCR4的表达。结论多西环素对卵巢癌细胞HO8910有明确的抑制增殖作用,能增加癌细胞对顺铂化疗的敏感性。SDF-1/CXCR4通路可能参与其中。     

妇科肿瘤

缺氧诱导因子-1α及血管生长因子与晚期卵巢浆液性癌腹膜播散和预后相关性分析；PTEN蛋白在卵巢子宫内膜异位囊肿及卵巢子宫内膜样癌组织中的表达及临床意义；1，25（OH）2D3联合顺铂对卵巢癌细胞株HO8910增殖及Skp2／P27蛋白表达的影响；紫杉醇与奥沙利铂联合化疗治疗晚期卵巢上皮性癌的临床观察；卵巢透明细胞癌70例临床分析     

小片段RNA干扰提高人卵巢癌耐药细胞对化疗药物的敏感性研究

目的采用针对多药耐药基因MDR1的小片段RNA(siRNA)转染人卵巢癌耐药细胞株,了解转染后能否提高细胞对化疗药物的敏感性。方法用脂质体将合成针对MDR1的siRNA转染具有MDR1高表达的人卵巢癌泰素耐药细胞株OVCAR8/TR,并用ATP生物发光法检测转染前、后细胞对顺铂、5-氟脲嘧啶、阿霉素和泰素4种化疗药物敏感性的变化。结果OVCAR8/TR细胞对顺铂、阿霉素和泰素均耐药,转染后细胞能够明显提高通过P-gp转运药物泰素和阿霉素的敏感性,泰素对细胞的抑制率由转染前的26%提高到78%,阿霉素对细胞的抑制率则由转染前的37%提高到58%,对顺铂的耐药性则没有改变。单用脂质体转染组的药敏结果与未转染组差异无统计学意义。结论siRNA干扰能够逆转人卵巢癌化疗药物的多药耐药,提高对化疗药物的敏感性。     

MicroRNA-218、microRNA-193b在宫颈癌组织中的表达及与化疗耐药性的关系

目的 探讨microRNA-218(miR-218)、microRNA-193b(miR-193b)在宫颈癌组织中的表达及其与化疗耐药性的关系。方法 选取2018年1月—2023年1月成都医学院第一附属医院收治的101例行手术治疗的宫颈癌患者。患者均行紫杉醇、顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶、卡铂药物敏感性试验，采用实时荧光定量聚合酶链反应检测miR-218、miR-193b表达情况。比较癌组织、癌旁组织中miR-218、miR-193b表达情况，统计化疗药物耐药情况，分析宫颈癌组织中miR-218、miR-193b的表达与化疗耐药性的关系。结果 癌组织中miR-218相对表达量低于癌旁组织（P <0.05）,miR-193b相对表达量高于癌旁组织（P <0.05）。宫颈癌患者行体外化疗药物紫杉醇、顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶、卡铂的耐药率分别为38.61%、46.53%、48.51%、26.73%和40.59%。宫颈鳞癌与宫颈腺癌患者对体外化疗药物紫杉醇、顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶、卡铂耐药率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。耐药患者癌组织中miR-218相对表达量...     

MRP1及TopoⅡ的表达与肺癌耐药性的关系

目的探讨肺癌耐药机制及明确耐药基因与化疗药物耐药性的相关性研究。方法应用MTT法对顺铂（Cisplatin）,吉西他滨（Gemcitabine）,长春瑞滨（Vinorelbine）,紫杉醇（Paclitaxel）,畀环磷酰胺（Iphospamide）5种化疗药物针对肺癌细胞悬液进行药敏检测;应用免疫组化进行MRP,（多药耐药相关蛋白1）及TopoII（拓扑异构酶Ⅱ）表达的检测,并将其表达情况与对应的化疗耐药性进行相关分析。结果①MRP．、TopoⅡ在肺癌中总的阳性表达率分别为：72．5％、50．0％。鳞癌和腺癌MRP1、TopoⅡ相比的表达差异无统计学意义（P〉0．05）,但鳞癌或腺癌和小细胞肺癌在MRP1、TopoⅡ表达相比差异有统计学意义（P〈0．05）;②MRP,的表达与顺铂、吉西他滨、长春瑞滨的耐药性均呈显著的正相关（P〈0．05）,其表达与紫杉醇、异环磷酰胺的耐药性差异无统计学意义（P〉0．05）;TopoⅡ的表达与顺铂、吉西他滨、紫杉醇、异环磷酰胺的耐药性均呈显著的正相关（P〈0．05）,其表达与长春瑞滨的耐药性差异无统计学意义（P〉0．05）。结论①MRP1较高表达及TopoⅡ的较低表达共同介导参与了肺癌耐药的机制,且与检测的化疗药物有不同程度的相关性。②应用肿瘤细胞体外培养、进行体外药敏检测,并明确耐药基因的表达情况,对于识别可能的耐药个体,选择合理有效的化疗药物,可能将会最大限度地避免无效化疗和提高化疗疗效。     

雷帕霉素增强Ishikawa细胞化疗敏感性实验研究

目的:研究雷帕霉素(RA)单独或联合阿霉素、顺铂及紫杉醇对子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的影响,为临床应用RA治疗子宫内膜癌提供理论依据。方法:应用10μmol/L RA与各1/2的半数抑制浓度(IC50)量的阿霉素、顺铂及紫杉醇联合,细胞克隆形成法和流式法检测细胞存活率和凋亡率;RT-PCR法检测RA、阿霉素、顺铂及紫杉醇对细胞哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)mRNA表达影响;Western blot法检测10μmol/L RA作用6,12,24h后细胞Bcl-2蛋白表达水平。结果:RA联合化疗可显著提高各组化疗药的作用效果,降低细胞存活率,诱导细胞凋亡,与单纯化疗组相比有统计学差异(P<0.05);RA可显著降低宫颈癌细胞mTOR基因mRNA水平,抑制Bcl-2蛋白表达。结论:RA通过抑制mTOR通路,降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达,提高化疗药物对子宫内膜癌细胞的杀伤作用。     

Lewis y抗原及α1，2-岩藻糖转移酶基因在卵巢癌细胞系中的表达

 目的探讨卵巢癌细胞系中Lewis y 抗原及α1,2-岩藻糖转移酶（α1,2-FT）基因FUT1表达变化对卵巢癌细胞增殖、耐
药和转移的影响。方法采用免疫细胞化学法、免疫细胞荧光法测定, 基因FUT1转染前后的人卵巢癌细胞系RMG-I
和RMG-I-H、人卵巢癌高转移细胞系HO8910PM 及亲本细胞系HO8910、人卵巢癌耐药细胞系COC1/DDP 及亲本细胞系COC1
中Lewis y 抗原的表达。利用RT-PCR 法及real-time PCR法检测上述6 种细胞中FUT1基因表达的变化。结果经免疫化学方
法和免疫细胞荧光法分析,在RMG-I-H、HO8910PM 及COC1/DDP 细胞系中Lewis y 表达强度分别为（53.90±4.33）,（37.31±
0.19）和（28.52 ±1.45）,与相应的亲本细胞系RMG-I（32.18±0.64）、HO8910（14.96±0.61）及COC1（19.26±0.83）比较均明显升高
（ P均<0.05）。与RMG-I相比,RMG-I-H 中的FUT1基因表达上调3.07倍,与HO8910 相比,HO8910PM中的基因表达上调
2.13 倍,与COC1相比,COC1/DDP 中的α1,2-FT 基因表达上调2.42 倍（P 均<0.05）。结论人卵巢癌细胞表面Lewis y 抗原与
卵巢癌细胞的增殖、耐药及转移等生物学行为密切相关。     

三氧化二砷对卵巢癌细胞抑制作用及机制的研究

目的：探讨三氧化二砷（As2O3）对卵巢癌细胞HO-8910体外生长的影响及其相关机制.方法：用倒置显微镜对细胞进行观察,用免疫细胞化学染色法检测p53基因表达.结果：（1）三氧化二砷作用浓度在0～12.0 μmol/L时,随着剂量的增加对卵巢癌细胞抑制作用增强.（2）卵巢癌细胞p53基因表达增强.结论：较高浓度三氧化二砷对卵巢癌细胞株HO-8910细胞有生长抑制作用并呈剂量-时间依赖效应 As2O3作用引起卵巢癌细胞HO-8910细胞凋亡的机制与p53基因表达增强有关.     

microRNA对人视网膜母细胞瘤肿瘤干细胞多药耐药性的影响

目的通过对人视网膜母细胞瘤（RB）肿瘤干细胞（CSCs）多药耐药性的研究,探讨microRNA对肿瘤干细胞多药耐药性的影响。方法通过流式细胞仪分选Y79细胞中的ABCG2（＋）与ABCG2（-）细胞,作为ABCG2（＋）组与ABCG2（-）组;采用MTT比色实验比较ABCG2（＋）组与ABCG2（-）组对抗肿瘤药物长春新碱、依托泊苷和卡铂的敏感性,得到候选microRNA。从标本库中选择RB组织切片,行LNA-原位杂交,并根据耐药性分为高耐药性组与低耐药性组,通过Real time PCR观察候选microRNA在两组中表达差异。结果 1分选阳性率：ABCG2（＋）分选后（91.7%）显著高于分选前（5.7%）,差异有统计学意义（P〈0.05）。2两组耐药性比较：从各个浓度水平上比较,ABCG2（＋）细胞的耐药性明显高于ABCG2（-）细胞,差异有统计学意义（P〈0.05）。3分选细胞的凋亡率和细胞内药物蓄积比较：ABCG2（＋）组的凋亡率明显低于ABCG2（-）组,差异有统计学意义（P〈0.05）;ABCG2（＋）组的药物蓄积明显低于ABCG2（-）组,差异有统计学意义（P〈0.05）。4候选microRNA在不同耐药性RB切片中的表达：高耐药组的microRNA表达率（39.3%）明显高于低耐药组的microRNA表达率低（5.2%）,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 ABCG2（＋）是Y79细胞系中的耐药细胞群,microRNA与肿瘤干细胞的侵袭性和耐药性密切相关,调控microRNA可以抑制肿瘤干细胞的耐药性,提高其对化疗的敏感性。     

理冲生髓饮有效组分对卵巢癌干细胞调控相关基因及顺铂耐药性的影响及其作用机制研究

背景　本课题组前期对理冲生髓饮有效组分进行了抗卵巢癌的研究,结果表明中药复方可以抑制卵巢癌细胞增殖,诱导癌细胞凋亡,减少癌细胞黏附,抑制血管新生,由此提出理冲生髓饮有效组分可以逆转卵巢癌干细胞耐药这一假说。目的　探讨理冲生髓饮有效组分对卵巢癌干细胞调控相关基因及顺铂耐药性影响及其作用机制。方法　2017年10月—2018年4月,选取BALB/C裸鼠48只,构建卵巢癌SKOV3荷瘤鼠模型,将裸鼠分为空白组（给予0.9%氯化钠溶液,12只）、顺铂组（给予顺铂,12只）、中药组（给予理冲生髓饮有效组分混合物,12只）、中药+顺铂组（除给予理冲生髓饮有效组分混合物外同时给予顺铂,12只）。于造模第8天开始给药,共给药18 d。最终空白组死亡4只裸鼠,顺铂组死亡3只裸鼠,中药组死亡1只裸鼠,中药+顺铂组死亡1只裸鼠。绘制各组肿瘤生长曲线。给药结束后处死裸鼠,制备肿瘤组织,HE染色观察肿瘤病理学特征,免疫荧光染色观察肿瘤CD44+、CD117+、CD44、CD117、CD133细胞情况,PCR检测肿瘤Nanog、Oct4、ABCC1 mRNA表达水平,免疫组化法检测肿瘤Nanog、Oct4、ABCC1表达水平。结果　各组在给药第1~7天肿瘤生长速度均逐渐增快;在给药第7~10天中药组和中药+顺铂组肿瘤生长速度明显变慢,而空白组和顺铂组肿瘤生长速度较快;中药组和中药+顺铂组肿瘤在第13天生长体积达到高峰,之后逐渐下降,而空白组和顺铂组肿瘤生长速度仍逐渐增快。顺铂组肿瘤细胞数目明显减少,体积缩小,核分裂象可见,可见大量肿瘤细胞凋亡,间质纤维组织明显增生;中药组肿瘤细胞数目减少,肿瘤组织呈较明显的片状坏死,间质中纤维组织和纤维细胞增生;中药+顺铂组肿瘤细胞数目明显减少,可见大量肿瘤细胞凋亡,间质纤维组织明显增生。肿瘤中可见少量CD44+、CD117+、CD133、CD44、CD117细胞。顺铂组、中药组、中药+顺铂组肿瘤Nanog、Oct4 mRNA表达水平高于空白组（P<0.05）;中药组肿瘤Nanog mRNA表达水平高于顺铂组、中药+顺铂组（P<0.05）;中药+顺铂组肿瘤ABCC1 mRNA表达水平低于空白组、顺铂组、中药组（P<0.05）。顺铂组、中药+顺铂组肿瘤Nanog表达水平低于空白组（P<0.05）;中药组肿瘤Oct4表达水平低于空白组、顺铂组（P<0.05）;中药组、中药+顺铂组肿瘤ABCC1表达水平低于空白组、顺铂组（P<0.05）。结论　理冲生髓饮有效组分可通过下调ABCC1及其mRNA表达水平,增高肿瘤细胞中药物浓度,还可通过影响卵巢癌干细胞特性和顺铂敏感性,从而逆转卵巢癌对顺铂的耐药性。     

声敏剂血卟啉对COC1／DDP细胞顺铂敏感性的影响及机制探讨

目的探讨声敏剂血卟啉对COC1／DDP细胞顺铂敏感性的影响及其机制。方法将人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1／DDP分为A、B、C、D4组（分别为对照组、单纯顺铂组、血卟啉＋超声组、顺铂＋血卟啉＋超声组）,观察各组处理后癌细胞的增殖、细胞克隆形成情况,联合用药效果及bcl-2和bax表达的变化。结果D组COC1／DDP细胞增殖抑制明显,细胞凋亡率升高,均与其他组差异有统计学意义（P〈0．05）,bcl-2蛋白阳性表达率在C、D组显著降低（P〈0．05）,A、B组差异无统计学意义（P〉0．05）。bax蛋白阳性表达率在各组表达差异无统计学意义（P〉0．05）。结论声动力疗法联合顺铂能有效地增强对耐药卵巢癌细胞的杀伤能力,减少癌细胞的生成。     

上皮性卵巢癌细胞RhoA蛋白表达水平及意义

目的探讨小分子G蛋白RhoA在上皮性卵巢癌细胞及正常卵巢细胞中的表达水平及RhoA与上皮性卵巢癌侵袭力的相关性。方法上皮性卵巢癌细胞HO8910PM、HO8910及正常卵巢上皮细胞HOSEA中RhoA蛋白表达水平采用免疫细胞化学法检测;Transwell小室体外侵袭试验测定3种细胞的体外侵袭能力。结果HO8910PM细胞中RhoA蛋白表达水平最高,HO8910次之,HOSEA最低（F=35.73,p〈0.01）;3种细胞的侵袭能力以HO8910PM最强,HO8910较弱,HOSEA无侵袭能力（F=105.80,p〈0.01）。RhoA蛋白表达水平与细胞侵袭能力呈正相关（r=0.89、0.84,p〈0.05）。结论RhoA蛋白的表达与上皮性卵巢癌细胞的体外侵袭能力密切相关。RhoA蛋白可能作为重要因子参与上皮性卵巢癌的侵袭转移过程。     

Enrichment of breast cancer stem cells using a keratinocyte serum-free medium

Background  Keratinocyte serum-free medium (K-SFM) is a defined medium used to support the growth of primary keratinocytes and embryonic stem cell. The aim of this research was to optimize enrichment of breast cancer stem cells (CSCs) using K-SFM.

Methods  A K-SFM was used to enrich CSCs from two breast cancer cell lines and a primary culture of breast cancer. RPMI-1640 supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) was used as a control. CSCs were identified with flow cytometry using CD44⁺/CD24^– as molecular markers. The expression of a variety of CSC markers (Oct-4, ABCG2, Nanog, N-cadherin, and E-cadherin) was analyzed with real-time PCR.

Results  Much higher percentage of CSCs was achieved with K-SFM: 17.3% for MCF-7 cells, 17.4% for SKBR-3, and 20.0% for primary breast cancer culture. Less than 1% CSC was achieved using RPMI-1640 supplemented with 10% FCS. In comparison to the CSCs obtained with RPMI-1640, CSCs in the K-SFM expressed higher levels of Oct-4, ABCG2, Nanog and N-cadherin, and lower level of E-cadherin.

Conclusion  K-SFM is an optimal culture medium to maintain and to enrich breast CSCs.

     

RNA干扰survivin对卵巢癌HO-8910PM细胞周期的影响

目的 探讨RNA干扰survivin基因对卵巢癌HO-8910PM细胞周期的影响.方法 实验分3个组：siR-NA组,采用脂质体法将靶向survivin siRNA荧光真核表达质粒载体pGPU6-GFP-survivin-shRNA转染卵巢癌HO-8910PM细胞;空白对照组,单纯细胞培养;阴性对照组,用表达与survivin序列无同源性的siRNA片段质粒pGPU6-GFP-NC转染细胞.于转染后48 h和72 h,用PI单染法流式细胞术检测各组HO-8910PM细胞周期的变化以及Western blot检测survivin蛋白的表达情况.结果 PI单染流式细胞仪检测细胞周期结果表明,与空白对照组和阴性对照组相比较,2个时间点siRNA组转染后的G0/G1期细胞比例明显增加,而G2/M期细胞比例均下降（P＜ 0.05）;Western blot结果证实,siRNA组的HO-8910PM细胞survivin蛋白的表达量明显下调.结论 导入survivin基因特异性的siRNA可导致卵巢癌HO-8910PM细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞增殖受阻,且细胞sur-vivin蛋白表达量下降.