大鼠肝细胞原代培养技术因素的探讨

目的:探讨影响大鼠肝细胞原代培养的技术因素。方法:以Seglen原位两步灌流法分离培养大鼠肝细胞为基础,分离培养大鼠肝细胞。结果:活细胞分离存活率>85%,12~16小时肝细胞贴壁生长良好。结论:为进一步开展肝细胞培养奠定良好基础。     

大鼠肝细胞的原代培养

目的探索肝细胞的分离和原代培养条件.方法两步灌流法分离SD大鼠肝细胞,并将其培养在Hepatozyme-SFM培养基中,用MTT试验和尿素合成功能检测了解培养中的肝细胞的生物学活性.结果分离肝细胞的即时存活率为88%±2%,产量为(39±12)×106/g克肝脏;培养于体外的肝细胞维持形态稳定和尿素合成等功能达1周.结论应用两步灌流法可取得较好的肝细胞分离效果,应用Hepatozyme-SFM培养基能使肝细胞体外维持生物学功能达1周.     

环磷酰胺对大鼠肝细胞的毒性

目的：探讨环磷酰胺对大鼠原代培养肝细胞的毒性作用.方法：采用“二步灌流法”制备大鼠原代肝细胞,分别给予10、20、40、80及160 μmol/L的环磷酰胺干预24h,溶剂对照组不予环磷酰胺干预.噻唑蓝（ MTT）法观察环磷酰胺对肝细胞的毒性,测定各组培养基上清液生化和细胞内氧化及抗氧化指标.结果：不同浓度的环磷酰胺对大鼠原代培养肝细胞均具有明显的毒性.与溶剂对照组比较,环磷酰胺干预的各实验组肝细胞培养上清液丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶均升高;细胞冻融液丙二醛含量均升高,超氧化物歧化酶及谷胱甘肽过氧化物酶活性均降低（均P ＜0.05）.结论：成功建立了环磷酰胺致大鼠原代培养肝细胞脂质过氧化模型.     

大鼠原代肝细胞的形态和功能

目的 :对分离培养的原代大鼠肝细胞进行形态学观察和功能研究 ,探讨其短期培养内的最佳功能状态 ,以便更好地用于肝细胞移植或生物人工肝 .方法 :采用Seglen胶原酶二步灌流法灌注SD雄性大鼠肝脏 ,获取的肝细胞在含有多种辅助因子的Williams’E培养基中进行培养 .台盼蓝排斥法计算细胞产量和细胞活率 ;光镜下直接或HE染色后动态观察细胞形态学改变 ,透射电镜观察其超微结构 ;并收集不同时期培养上清检测其细胞分泌等功能 .结果 :每只大鼠肝平均可获取 1 .2 1× 1 0 8个肝细胞 ,平均活力为 93.6 % .光镜下可见肝细胞呈多角形生长 ,有双核 ,连接成片状或岛状 .电镜下可见内质网、车轮状线粒体、糖原颗粒、细胞连接及胆小管 .肝细胞功能检测显示LDH漏出量、白蛋白分泌及尿素合成功能在 1wk内出现波动性变化 ,第 3日LDH漏出量最低 ,白蛋白分泌及尿素合成功能较好 .结论 :离体培养的 3d原代肝细胞具有较好的功能 ,可能为肝细胞移植和生物人工肝应用的最佳时机     

一种SD大鼠肝细胞原代培养的改良方法

目的 建立一种改良的大鼠肝细胞原代培养方法.方法取6到7周龄SD 大鼠（约200g）,3%戊巴比妥钠麻醉,采用Seglen两步胶原酶灌流法分离肝细胞,Percoll密度梯度离心纯化肝细胞,种植在预先用gelatin处理的培养皿内.结果 分离所得肝细胞成活率达95%以上.24h后用相差显微镜观察细胞贴壁良好,细胞形态规则;48h后细胞开始伸展.结论 使用改良的方法获得的细胞成活率高,贴壁牵,适合常见的药理毒理实验.     

葡聚糖对实验性肝细胞损伤的保护作用及其机制研究

为了证实葡聚糖是否对急性肝细胞损伤有明显的保护作用,本实验采用离体肝细胞原代培养技术,观察了葡聚糖对硫代乙酰胺（ＴＡＡ）所致急性肝细胞损伤的保护作用,并在细胞水平上对其抗损伤机理作了初步探讨。１材料和方法１．１实验动物ＳＤ乳鼠,鼠龄２～３天,江苏省实验动物中心提供。１．２主要试剂胰蛋白酶,ＲＰＭＩ－１６４０为Ｓｉｇｍａ公司产品;葡聚糖由美国东田纳西州大学惠赠。ＴＡＡ由上海化学试剂采购站提供;辅酶１为中国科学院东方仪器设备公司生化部提供;超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、ＮＯ试剂盒为建成生物工程研究所提供…     

1,2-二氯乙烷对大鼠肝细胞内游离钙离子浓度的影响

目的了解1，2-二氯乙烷染毒24h对大鼠肝细胞的损伤及其机理。方法运用显微荧光术测定了大鼠肝细胞内游离钙离子浓度，同时，测定了大鼠肝细胞培养上清液乳酸脱氢酶（LDH）活力作为大鼠肝细胞受损的指标。结果所有剂量组的1，2-二氯乙烷的大鼠肝细胞内游离钙离子浓度与对照组比较差异均无显著性（P〉0．05）；LDH活力仅在浓度为5mmol／L的1，2-二氯乙烷染毒组与对照组比较差异也无显著性（P〉0．05）；而1，2-二氯乙烷其他染毒组（即浓度为10mmol／L和20mmol／L）与对照组比较差异均有显著性（P〈0．01）。结论较高浓度（10mmol／L和20mmol／L）的1，2-二氯乙烷能损伤大鼠肝细胞，损伤的途径不是通过破坏肝细胞内钙稳态机制。     

C市枯水期饮用水中有机污染物分析及对肝细胞DNA损伤的研究

目的　了解城市饮用水环境中有机污染物状况及其对肝细胞的遗传毒性。方法　用气 质联用仪毛细管色谱柱分离分析技术 (GC MS)定性分析C市以嘉陵江和长江为水源的A、B、C、D、E 5个水厂枯水期的水源水与出厂水中有机提取物并用单细胞凝胶电泳实验检测了其对原代大鼠肝细胞DNA的损伤 ,观察比较DNA迁移长度与拖尾细胞百分率。结果　定性分析共检出有机物 98种 ,其中水源水为 60种 ,出厂水为 5 8种 ,污染物主要包括 :酯类、酮类、酚类、杂环和苯及其衍生物等。水源水样品中以长江为水源的C、D、E厂在 2 5 0ml时肝细胞DNA迁移长度和细胞拖尾百分率与对照相差显著 (P <0 .0 1) ,以嘉陵江为水源的A、B厂在 5 0ml即可相差显著 (P <0 .0 1)。而全部出厂水样品诱导的DNA损伤在 5 0ml均与对照相差显著 (P <0 .0 1)。结论　C市主城区各水厂水源水与出厂水均已受到有机物的污染 ,嘉陵江的污染重于长江。且各水样的有机提取物在一定范围内均可诱导原代大鼠肝细胞DNA损伤 ,出厂水引起的DNA迁移长度大于水源水 ,提示氯化消毒可以使有机提取物的DNA损伤作用增强     

黄芪多糖对环磷酰胺致大鼠毒性的保护作用

目的:研究黄芪多糖(APS)对大鼠原代培养肝细胞抗氧化能力的影响作用。方法:采用"二步灌流法"制备大鼠原代肝细胞,给予40μmol/L的环磷酰胺造成脂质过氧化模型,然后给予三剂量(50、100及150μmol/L)的黄芪多糖,对照组给予相同体积的PBS,继续培养24 h,测定培养基上清生化、细胞内氧化及抗氧化指标,并评价黄芪多糖对环磷酰胺致毒性的保护作用。结果:相对于对照组,黄芪多糖各剂量组转氨酶(ALT,AST)及丙二醛(MDA)含量均明显下降(P<0.05),超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性均明显升高(P<0.05),且呈剂量依赖效应。结论:黄芪多糖对环磷酰胺引起的大鼠肝细胞脂质过氧化有一定的抑制作用。     

一种小鼠原代肝细胞培养方法

目的寻求一种简易、廉价的原代小鼠肝细胞培养方法。方法采用Ⅳ型胶原酶消化法制备游离肝细胞悬液,以低血清进行肝细胞单层培养。结果通过多次探索、观察,比较成功地进行了原代肝细胞培养。结论此方法适合一般实验室开展肝细胞培养。     

附子石油醚、氯仿提取物对虚寒模型大鼠肝组织LDH、SDH活性的影响

目的:研究附子石油醚提取物、附子氯仿提取物对虚寒模型大鼠肝组织乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)活性的影响。方法:用生石膏、龙胆草、黄柏、知母水煎液造虚寒型大鼠模型,再用附子石油醚提取物、附子氯仿提取物治疗,用分光光度计法测定肝组织中LDH、SDH的活力。结果:与空白对照组比较,虚寒模型组大鼠肝组织LDH活力明显升高(P<0.05),SDH活力明显降低(P<0.05);附子氯仿提取物可显著降低肝组织LDH活力(P<0.01),附子石油醚提取物、附子氯仿提取物可显著升高肝组织SDH活力(P<0.01)。结论:附子石油醚提取物、附子氯仿提取物可拮抗虚寒型大鼠肝组织LDH活力的升高、SDH活力的下降,从而改善大鼠的能量代谢。     

一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法

为寻求一种简易、价廉的原代小鼠肝细胞培养方法 ,采用非灌注法、冰浴操作处理肝组织块及改良低血清培养基进行了原代鼠肝组织块和鼠肝细胞单层培养。通过光镜观察细胞形态、电镜观察超微结构及检测培养上清白蛋白水平证实培养细胞为肝细胞。持续培养结果显示原代培养第 6～ 12 d左右为肝细胞功能最佳观察和实验阶段。     

鼠胚心肌细胞体外培养模型的建立

目的建立经济适用的小鼠胚胎心肌细胞的分离、培养和鉴定方法。方法取不同胚龄小鼠心脏,采用不同方法进行消化、接种、体外增生、鉴定。结果用0.125%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液,短时间、分步消化孕12 d鼠胚的心脏。将获得的细胞悬液接种于胎牛血清包被的培养皿中,采用pH值为7.2~7.4的HAM’S F12加20%胎牛血清培养液进行培养,所获得的细胞经PAS反应及免疫组化鉴定显示约80%的细胞为心肌细胞。结论建立的鼠胚心肌细胞培养模型可进行胚胎心脏发育毒性的体外研究。     

通脑灵对原代培养大鼠大脑皮层神经细胞缺氧/缺糖损伤的保护作用

目的:研究缺氧/缺糖对皮层神经细胞的损伤及通脑灵颗粒剂对其保护作用。方法:取体外原代培养8d的大鼠大脑皮层神经细胞,换以低糖无血清培养基,并置于95%N2和5%CO2的缺氧罐中5h造成神经细胞缺氧。用神经细胞存活率及神经细胞线粒体活性来评价神经细胞活力;用乳酸脱氢酶(LDH)漏出量作为评价损伤的指标。结果:原代培养皮层神经细胞缺氧5h,再给氧24h后,神经细胞存活率及线粒体活性明显降低,LDH释放量显著增加。通脑灵颗粒剂可显著对抗缺氧/缺糖对皮层神经细胞的损伤,剂量依赖地抑制LDH释放量的增加。结论:通脑灵颗粒剂对皮层神经细胞缺氧/缺糖损伤具有保护作用。     

改良的小鼠原代肝细胞分离纯化方法

目的:建立一种简便、经济、高效的小鼠肝细胞分离和纯化方法。方法:对传统的两步原位胶原酶灌流法进行改进,缩短消化时间和改变灌注方式;分离的小鼠肝细胞,采用低速离心(300 r/min,1min,3～5次)纯化,台盼兰染色检测活率,糖原染色鉴定肝细胞,并与单密度梯度离心纯化法进行比较。结果:原代肝细胞经低速离心纯化后,活率达到90%左右,纯度达95%以上,与密度梯度离心法效果相近。结论:建立了一种新的小鼠原代肝细胞的分离纯化方法。     

艾纳香二氢黄酮对脂质过氧化损伤大鼠原代培养肝细胞的保护作用

研究 5种艾纳香二氢黄酮类化合物对过氧化损伤的原代培养肝细胞的保护作用。胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞。以 CCl4或 Fe SO4 Cys损伤原代培养肝细胞 ,1× 10 - 4 和 1× 10 - 5 mol/ L 的 5种艾纳香二氢黄酮均能明显抑制受损伤细胞的转氨酶逸出、MDA产生及 GSH耗竭。其中以 2 ,5 -二羟基艾纳香二氢黄酮的作用最强 ,在 CCl4所致肝细胞损伤实验中 ,其抑制 MDA产生的 ED5 0 约为 2 .6× 10 - 6 mol/ L ,保护 GSH的 ED5 0 约为 1.0 8× 10 - 5 mol/ L ,抑制 AL T逸出细胞的 ED5 0 约为 9.39× 10 - 6 mol/ L     

肝细胞刺激因子对环磷酰胺致小鼠肝细胞损伤的保护作用

目的 研究环磷酰胺(CTX)对肝细胞的损伤及肝细胞刺激因子(HSS)对该损伤的保护作用。方法 应用原代小鼠肝细胞混悬培养，检测肝细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性和肝细胞谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量变化。结果 CTX可使LDH漏出增多，同时肝细胞GSH含量减少，MDA含量增加，HSS可部分逆转上述变化。结论 CTX可致肝细胞损伤，HSS降低肝细胞MDA含量可能是其保肝机制之一。     

青藤碱拮抗体外培养的乳鼠心肌细胞自由基损伤

目的研究青藤碱(Sin)对体外培养乳鼠心肌细胞自由基损伤的保护作用。方法应用O_2~-诱导培养乳鼠心肌细胞损伤模型,通过测定乳酸脱氢酶(LDH)活性、MTT代谢率、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量等指标,观察Sin对心肌细胞自由基损伤的保护作用。结果与损伤组比较,Sin保护组的LDH释放量显著减少(P＜0．01);MTT代谢率显著增高(P＜0．01);Sin明显抑制损伤率;SOD活性明显增高;MDA含量明显降低(P＜0．01)。结论Sin通过清除氧自由基保护O_2~-损伤的心肌细胞。