造血干细胞和肝干细胞的分离和克隆特性

目的：预期的干细胞分离对理解控制它们增殖和分化的机制来说非常重要。方法和结果：使用9种单克隆抗体和荧光活化细胞筛选（FACS），在成年小鼠骨髓中成功的预先识别到造血干细胞（HSCs）。小鼠的HSCs惟有CD34阴性细胞丰富，c-Kit Sca-1谱系标记（CD34KSL）细胞代表0．004％的骨髓（BM）单克隆细胞。     

经冠状动脉移植自体BM-MNCs治疗猪急性心肌梗死的作用

目的探讨冠状动脉内移植自体骨髓单个核细胞（BM—MNCs）治疗猪急性心肌梗死的有效性。方法实验动物分为冠脉内移植MNCs组（n=6）及冠脉对照组（n=5）。冠脉内移植BM—MNCs后4周观察移植细胞归巢情况、小血管密度、心功能变化。结果冠脉内MNCs移植后4周,心肌细胞间可见发蓝色荧光的移植细胞,散在分布,心肌细胞间有较多新生毛细血管并可见新生的心肌样细胞。移植组小血管密度、左室射血分数（LVEF）及短轴缩短率（FS）明显高于对照组（P〈0．01）,左室舒张末期内径（LVEDd）低于对照组（P〈0．05）。结论经冠脉移植的BM—MNCs可归巢到宿主心肌,有促进缺血心肌血管新生、改善左室收缩功能、减轻心室重构的作用。     

不同来源的CD34^＋细胞归巢相关分子的表达

目的 研究不同来源CD34^＋细胞归巢相关分子（HRM）的表达情况。方法采用免疫磁珠法（MACS）分选不同来源的CD34^＋细胞，免疫荧光标记流式细胞仪测定HRM的表达。结果骨髓（BM）、动员后的外周血（mPB）及脐血（UCB）来源的CD34^＋细胞均高表达细胞黏附分子CD49d、CD49e、CD54、CD11a、CD62L、CD44、CD31。UCB来源的CD34^＋细胞表面表达的细胞黏附分子中，CD49e表达显著低于BM和mPB来源的CD34^＋细胞（P〈0．05），CD54表达显著低于mPB来源者（P〈0．05），CXCR4表达显著低于BM来源者（P〈0．05）。结论UCB来源的造血干／祖细胞归巢能力低可能是UCB移植造血重建延迟的原因之一。     

骨髓CD34^＋干细胞向内皮细胞转化的诱导方法

目的探讨骨髓CD34^＋细胞向血管内皮细胞转分化的诱导方法。方法采集犬骨髓,经免疫磁珠分离出内皮祖细胞,内皮细胞生长因子（VEGF）诱导分化为内皮细胞并扩增,倒置相差显微镜、免疫细胞化学和摄取DilAc—LDL试验鉴定。将所得细胞种植于人工血管,扫描电镜观察细胞形态,并与MNCs作对比。结果经流式细胞仪测定,分离后的细胞中CD34^＋细胞占78．46％±6．37％;CD34^＋细胞培养2周后细胞基本铺满培养瓶底面,细胞呈“鹅卵石”状排列,CD34^＋和Ⅷ因子免疫细胞化学染色均为阳性。扫描电镜下观察可见内皮细胞平铺于人工血管表面,有伪足伸出并长入血管内表面微孔内。结论通过免疫磁珠方法可分离得到高纯度的骨髓CD34^＋细胞,经体外培养VEGF诱导后可定向分化为内皮细胞。     

冠脉内移植自体骨髓单个核细胞对猪急性心肌梗死后心功能的影响

目的探讨冠脉内移植自体骨髓单个核细胞（BM—MNCs）对猪急性心肌梗死后心功能的影响。方法实验动物分为冠脉内移植BM—MNCs组（n=6）及冠脉对照组（n=5）,移植细胞数2×10^8。移植后4周观察心功能变化及冠脉侧支循环形成情况。结果冠脉内BM—MNCs移植后4周移植组左室射血分数[LVEF：（65．84±4．94）％]及短轴缩短率[FS：（43．21±5．49）％]明显高于对照组[LVEF：（47．21±6．32）％,FS：（27．31±4．07）％]（P〈0．01）,而左室舒张末压[LVDEP：（7．94±4．57）mmHg]明显低于对照组[（22．56±5．97）mmHg]（P〈0．01）,左室舒张末期内径[LVEDd：（27．27±2．38）mm]低于对照组[（37．82±6．96）mm]（P〈0．05）;移植组冠脉侧支循环形成较对照组明显;移植后1周血清bFGF及VEGF浓度明显高于对照组及术前水平（P〈0．01）。结论经冠脉移植BM—MNCs有助于改善左室收缩功能及舒张功能,有助于减轻心室重构。     

血管内皮生长因子对骨髓间充质干细胞分离培养的诱导分化作用

目的　结合骨髓间充质干细胞与血管内皮生长因子（VEGF）的优点,探讨VEGF对其体外诱导分化的作用。为缺血性疾病的治疗提供新思路。方法　成人新鲜骨髓,Percoll梯度分离法培养,单克隆培养法分离传代扩增骨髓基质细胞（MSCs）。在大肠杆菌DH5α中扩增和提取,纯化、克隆pcDNA3.0-VEGF165质粒。脂质体法转染MSCs。流式细胞术检测诱导前后MSCs免疫表型变化。一抗VEGF和CD31（1∶50）,FITC标记的VEGF二抗和cy3标记的CD31二抗与细胞共同孵育,甘油封片,在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞染色情况。结果　转染前表达CD44（75.86%）、CD31（5.63%）。转染后CD44表达明显下调（40.18%）,CD31则明显上调（56.20%）。FITC标记后VEGF抗体使细胞显现绿色荧光,cy3标记的CD31抗体使细胞显红色荧光。结论　转染VEGF后骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化且有分泌VEGF的功能,为干细胞植入及血管再生起到指导作用。     

Wistar大鼠骨髓间充质干细胞的培养、鉴定和标记

目的 建立Wistar大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分离、培养的方法,并进行鉴定、标记.方法 采用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠的MSCs.采用相差显微镜观察MSCs的形态学特征;流式细胞仪检测第3代细胞表面标志抗原CD29、CD44、CD34和CD45的表达率;电镜检查第3代MSCs超微结构.DAPI标记MSCs为下一步进行体内细胞移植示踪.结果 原代培养的MSCs于6～8 h后贴壁,6 d左右形成集落,14 d 左右可达到80%～90%融合.第3代细胞表面标记物CD29,CD44,CD34和CD45的阳性率分别为98.6 %,78.2%,0.0%,0.3%.超微结构清晰,可见细胞器,如线粒体、粗面内质网和高尔基复合体,细胞核呈圆形或不规则,可见较多微绒毛.DAPI可良好标记MSCs细胞核,呈蓝色荧光.结论 采用全骨髓贴壁培养的方法能够成功分离和培养大鼠的MSCs,在第3代可获得高纯度MSCs.DAPI可以作为一种示踪剂标记MSCs.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的体外分离、培养及鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）。方法全骨髓贴壁法体外分离、培养3月龄SD大鼠MSC,利用差速贴壁原理纯化MSC,并通过形态学观察、细胞表面抗原标志物、多细胞系诱导分化对其进行鉴定。结果P3代不表达抗原CD34和CD45,表达抗原CD29和CD44,符合MSC表面标志物特征。P3代MSC定向诱导后经ALP染色、矿化结节染色、油红O染色、Ⅱ型胶原荧光染色后鉴定具有骨向分化、脂向分化及软骨分化能力。结论全骨髓贴壁法能够建立稳定的MSC体外分离培养体系。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定

目的 探讨体外分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的生物学特性,对其表型和生长曲线进行初步鉴定.方法 采用全骨髓培养法提取培养MSCs,绘制原代及三代细胞生长曲线,利用免疫组化法检测表面标志物CD34、CD44;流式细胞分析法检测表面标志物CD90.结果 成功培养出MSCs,免疫组化CD44阳性表达,CD34阴性表达;流式细胞术CD90阳性表达.结论 该实验分离培养的细胞群与MSCs的生物学特性相吻合,说明MSCs易于体外分离、培养和扩增.     

小鼠内皮祖细胞的分离、培养与定向诱导分化

目的 建立一种稳定、高效,从小鼠骨髓中分离培养与定向诱导分化内皮祖细胞(EPCs)的方法。方法 从小鼠骨髓中密度梯度离心法分离单个核细胞,经差速贴壁结合特殊培养基扩增并向内皮细胞定向诱导分化EPCs。应用免疫荧光和流式细胞技术鉴定内皮细胞系列标志:CD34、CD31、Flk-1和祖细胞标志CD133。并通过检测其对FITC标记的UEA-1的吸附和内吞DiI-ac-LDL来进行细胞功能学的鉴定。对分化细胞行vWF、CD31 免疫组化染色鉴定,并与血管内皮细胞合成前列腺素能力进行比较。结果 经过梯度密度离心和贴壁法选择的细胞表达内皮细胞特异性抗原CD34、CD31、Flk-1,部分表达CD133。分离所得细胞经EBM-2专用培养基培养后,第4天可见集落形成,培养第9天流式细胞仪检测其CD34、CD133、CD31、Flk-1阳性率分别为(44±4)%、(18±3)%、(49±4)%和(79±6)%,细胞能特异性吸附FITC标记的荆豆凝集素并内吞DiI-ac-LDL,约3周左右可融合近80%,形成铺路石样内皮细胞特有形态。传代后vWF、CD31免疫组化染色阳性率分别为(66±5)%和(56±5)%。诱导后的内皮祖细胞的合成前列腺素能力与血管内皮细胞之间无显著差异。结论 从小鼠骨髓中分离培养与定向诱导分化EPCs的方法,效率高,稳定性和重复性好。     

经静脉移植自体骨髓单个核细胞治疗猪急性心肌梗死的实验研究

目的探讨静脉内移植自体骨髓单个核细胞(BM-MNCs)治疗猪急性心肌梗死的有效性和安全性。方法静脉内移植BM-MNCs后4周观察移植细胞归巢情况、小血管密度、心功能及冠脉侧支血管形成情况及可能发生的不良反应。结果静脉内MNCs移植后4周心肌细胞间可见少量发蓝色荧光的移植细胞,散在分布,心肌细胞间有较多新生毛细血管并可见新生的心肌样细胞;移植组小血管密度(68.25±9.54)条/mm~2明显高于对照组(35.14±7.06)条/mm~2(P<0.01),左心室射血分数(LVEF,62.75%±5.08%)、短轴缩短率(FS,40.28%±4.73%)也明显高于对照组LVEF(46.34%±5.94%)、FS(29.34%±3.86%)(均为P<0.05);移植组冠脉侧支循环形成较对照组明显;静脉内移植MNCs没有发现异常增生、钙化或肿瘤形成。结论经静脉移植的BM-MNCs可归巢到宿主心肌,有助于促进缺血心肌血管新生,改善左心室收缩功能的作用。     

冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子对骨髓间充质干细胞向心肌内归巢的影响

目的 探讨经冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对骨髓间充质干细胞（MSCs）心肌内归巢的影响.方法 杂种犬12只,体重20～25（22.4±1.8）kg,采用开胸结扎法建立急性心肌梗死模型.1周后将存活犬（n=ll）随机分为MSCs组（n=5）和bFGF＋MSCs组（n=6）.采用密度梯度离心与贴壁培养法在体外分离、培养MSCs,移植前对MSCs进行4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育标记.逆行灌注实验后1周,免疫荧光法比较两组梗死心肌内DAPI阳性细胞数,评价逆行灌注bFGF对MSCs归巢的影响.结果 采用密度梯度离心和贴壁培养法成功分离并富集MSCs,77.19％以上的细胞都处于G0/G1期,强表达CD44,阳性率为95.8％;MSCs体外DAPI标记率高,初始标记率达99.6％.免疫荧光显示,bFGF＋MSCs组DAPI阳性细胞数明显高于MSCs组[（325±106）/mm2比（186±67）/mm2,P＜0.05],联合组MSCs分布更为均匀;部分MSCs与心肌细胞共定位.结论 经冠状静脉逆行灌注bFGF能更有效地促进MSCs归巢至梗死心肌;同时,MSCs在心肌内的分布也更为均匀.     

脐血干细胞与骨髓干细胞联合移植治疗大鼠急性肝衰竭实验研究

目的：观察脐血干细胞和自体骨髓干细胞共同移植治疗D-半乳糖苷所致急性肝衰竭大鼠的疗效。方法采集大鼠脐血和骨髓中单个核细胞,以促肝细胞生长因子和干细胞因子培养3w,采用免疫细胞化学法检测白蛋白和甲胎蛋白表达情况;以D-半乳糖苷腹腔注射法建立大鼠急性肝衰竭模型,24 h后每日经鼠尾静脉分别注入脐血干细胞,或骨髓干细胞,或混合的脐血干细胞和骨髓干细胞,对照组注射等量生理盐水,治疗7d,观察4组大鼠存活率、肝功能和肝组织病理学变化。结果在促肝细胞生长因子及干细胞因子的诱导下,脐血干细胞和骨髓干细胞可以在体外扩增并分化为肝细胞;脐血干细胞移植、骨髓干细胞移植和联合细胞移植组大鼠9d 存活率分别为55.6%、50.0%和77.8%,均明显高于生理盐水对照组（16.7%,P〈0.01）;联合移植组存活率高于任何一种单纯干细胞移植（P〈0.01）。结论脐血干细胞和骨髓干细胞移植对大鼠急性肝损伤有一定的保护作用,两者联合移植有协同作用。     

骨髓间充质干细胞移植对心力衰竭大鼠心功能的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）对心衰大鼠心功能的影响及其机制。方法腹腔注射阿霉素（2mg／kg,每周1次,连续6周）至近交系F344大鼠体内,建立心衰大鼠模型。存活大鼠（32只）随机分为2组：心衰组（16只）和细胞移植组（16只）。分离纯化大鼠MSCs进行体外培养,予4,6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）进行标记;经股静脉注射MSCs或DMEM至心衰大鼠体内。细胞移植后4周,应用多导生理记录仪测量大鼠心功能;通过免疫组织荧光及化学染色,观察移植细胞存活情况,并计算血管数量;通过天狼猩红染色计算心肌胶原容积分数（CVF）和血管周围胶原面积（PVCA）。结果移植后4周,细胞移植组大鼠心肌组织见到DAPI标记的移植细胞存活,并表达心肌特异性抗原心肌肌球蛋白重链（β—MHC）。与心衰组相比,细胞移植组最大左室收缩末压（LVSP）、左室内压最大（最小）变化速率（LV＋dp／dtmax）均明显升高（P〈0．05）,而左室舒张末压（LVDP）明显下降（P〈0．05）;细胞移植组左室血管数量明显高于心衰组[（11．83±1．40）个比（7．78±1．39）个,P〈O．05],细胞移植组左心室内膜CVF及PVCA明显低于心衰组（4．53±1．98比7．79±1．99,10．91±2．31比14．17±2．49,P〈0．05）。结论MSCs移植可改善心衰大鼠心功能,其机制可能与MSCs归巢至心脏,分化为心肌样细胞,并且促进血管新生、抑制心肌纤维化有关。     

自体骨髓单个核细胞移植治疗肝硬化的临床评价

目的探讨肝动脉插管自体骨髓单个核细胞（BM—MNCs）移植治疗肝硬化的安全性、可行性及疗效。方法201例肝硬化患者,其中131例进行自体骨髓单个核细胞移植,70例作为对照组。骨穿采集自体骨髓体外分离纯化骨髓单个核细胞。经肝动脉插管将其移植入肝脏。分别于移植后4、8、12、24周观察血清白蛋白（ALB）、胆碱酯酶（CHE）、凝血酶原活动度（PTA）及总胆红素（TBil）变化情况,观察患者并发症及预后。结果移植组患者移植前血清ALB、CHE及PTA分别为29．33g／L、2387．4U／L和46．4％。移植后4周分别升至32．37g／L、2875．9U／L和53．54％,12周分别为32．95g／L、3190．6U／L和57．24％,24周则分别为32．22g／L、3066．5U／L和56．02％。患者移植后24、周内血清ALB、CHE和PTA水平较治疗前均显著升高,而对照组则无明显升高,两组比较差异有统计学意义。而血清TBil在移植后24周内改善情况与对照组相比差异无统计学意义。两组患者24周内主要并发症发生率及预后情况差异无统计学意义。移植后无严重不良事件发生。结论自体骨髓单个核细胞移植能改善肝硬化患者肝脏合成能力,并有良好的安全性。     

小鼠骨髓源性肥大细胞的培养及鉴定

目的：在体外利用小鼠骨髓干细胞诱导获得高纯度的肥大细胞。方法：从小鼠股骨获得骨髓细胞，放入含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，加入不同浓度的刺激因子，即IL-3和SCF各分别为10ng／ml、15ng／ml、20ng／ml，放入CO2培养箱中培养4周，用免疫组化观察CD117的表达，用流式细胞术检测CD117和FceR1α双阳性细胞的比例，用甲苯胺蓝染色法观察细胞的成熟度，并与较常用的肥大细胞系P815做比较。结果：培养获得的肥大细胞，其中IL-3和SCF分别为10ng／ml和15ng／ml时均可在4周后得到纯度大于95％的CD117和FcεRIα双阳性肥大细胞，而20ng／ml时FcεRIα的表达却有所降低，双阳性细胞仅达90％，而P815细胞系表达FcεRIα的比例很低。免疫组化发现培养获得的细胞大部分均表达CD117。甲苯胺蓝染色发现培养获得的细胞核被染成深蓝色，胞浆中布满大量紫红色的颗粒，呈现肥大细胞的典型特征。而P815却少见典型的紫红色异染颗粒。结论：用IL-3和SCF各10ng／ml可在体外成功培养获得高纯度的小鼠骨髓源性肥大细胞，且其在表型和成熟度方面均好于P815细胞系。     

Sox2、Klf4、Oct4、c—Myc基因重编程人皮肤成纤维细胞的实验研究

目的探讨利用Sox2、Klf4、Oct4、c—Myc基因能否将人皮肤成纤维细胞（HSF）编程为诱导性多潜能干细胞（iPS）。方法①利用组织块贴壁法原代分离培养HSF细胞。②包装生产携带Sox2、Klf4、Oct4、c—Myc基因的逆转录病毒上清液感染HSF细胞。③病毒感染后HSF细胞培养,镜下观察HSF细胞形态学变化。④应用细胞碱性磷酸酶（AP）染色检测细胞基因表达量和体内分化畸胎瘤实验对细胞生物学特性进行鉴定。结果原代HSF细胞编程后形态类似于胚胎干细胞,细胞AP染色阳性,内源多能基因Oct4、Sox2、Nanog、Rexl表达量增高,细胞体内可分化为畸胎瘤。结论利用Sox2、Klf4、Octd、c．Myc基因可将HSF细胞编程为iPS细胞。     

兔骨髓间充质干细胞移植后移植细胞凋亡的实验研究

目的利用TUNEL法检测5-氮胞苷体外诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）移植后的凋亡情况。方法5-氮胞苷体外诱导骨髓间充质干细胞MSCs向肌源性心肌细胞分化,通过免疫组化,鉴定诱导后的MSCs是否向类心肌细胞转化。建立兔心肌梗死模型,将细胞移植于心梗区域。移值2周后,利用TUNEL法检测植入细胞的凋亡率。结果移植2周后,可见DAPI标记带蓝色荧光的供体细胞核,分布比较广泛,形态呈椭圆形类似心肌细胞核,并与心肌纤维排列方向一致,证明移植细胞已存活。移值细胞表达troponinT,证明移植的MSCs分化为类心肌细胞。移植细胞均出现不同程度细胞凋亡。结论移植的MSCs细胞可在缺血的心肌组织存活,并分化为类心肌细胞,但移植细胞均出现不同程度凋亡。     

羟基喜树碱富集结肠肿瘤干细胞样群体的初步研究

背景:肿瘤干细胞是临床上肿瘤耐药的主要机制,识别并靶向肿瘤干细胞为肿瘤治疗的研究带来了新的思路。目的:探讨在体外以化疗药物富集结肠肿瘤干细胞样群体的可行性。方法:应用前期实验中以药物浓度递增诱导法建立的羟基喜树碱(HCPT)耐药人结肠癌细胞株SW1116/HCPT,免疫荧光标记干细胞表面抗原CD133,Hoechst33342/PI双染流式细胞仪检测、分选侧群(SP)细胞,实时PCR检测干细胞相关和多药耐药相关基因表达。结果:亲代细胞株SW1116中CD133阳性群体和SP群体分别仅占2%和1%,耐药细胞株SW1116/HCPT中则高达7%和61%,多药耐药基因MDR1抑制剂维拉帕米可使两组SP群体均下降至接近0水平。SW1116/HCPT细胞SP群体中干细胞相关基因CD133、Nanog和多药耐药相关基因MDR1、MRP1、MRP2、MRP6 mRNA表达水平较非SP群体显著上调(P0.05)。结论:HCPT药物浓度递增诱导法可成功富集结肠肿瘤干细胞样群体,其SP亚群中存在于细胞相关和多药耐药相关基因高表达。