FimH重组蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中构建并表达3种FimH重组蛋白,并对FimH重组蛋白的培养条件进行优化,制备高纯度FimH重组蛋白。方法：采用原核表达载体pET28a构建出能表达FimH的重组质粒,并分别对诱导温度、IPTG浓度、诱导时间等条件进行优化,以提高重组蛋白的产量和增大其可溶性,最后以亲和层析分离纯化3种FimH重组蛋白。结果：成功构建出表达大肠杆菌（K12,BL21）和沙门氏菌（S．T．）FimH的原核表达载体pET28a—K12／BL21／S．T．,经酶切、测序和WesternBlot鉴定,目的蛋白表达正确。在适当浓度的IPTG诱导,15℃震荡培养20h,可使FimH的表达量达到最大,分离纯化的蛋白在SDS—PAGE中显示为一条带。结论：本研究构建以3种FimH为表面呈现系统的表达载体,3种FimH基因和预测蛋白结构略有差异。本研究为后续研究3种蛋白生物活性差异及其靶向M细胞的免疫佐剂活性提供物质基础。     

重组质粒pCIAP—P在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达研究

目的 证实重组质粒pCIA-P可编码表达具有变形链球菌S.mutans表面蛋白PAc抗原性的表达产物。方法 在选择合适的原核表达系统后,诱导外源基因表达出目的蛋白,通过蛋白质电泳技术及免疫印迹法检测表达蛋白,以观察pac基因重要抗原决定簇编码区DNA片段的原核细胞中的表达情况。结果 克隆片段在原核系统下可完成表达,表达产物保存了S.mutans表面抗原的免疫原性。结论 该实验为探索出一种简便快捷地检测与分析重组DNA疫苗表达产物的分子量及抗原性的方法提供了实验依据。     

不同浓度重组人骨形成蛋白2对人胎盘间充质干细胞增殖和碱性磷酸酶表达的影响

目的初步探讨重组人骨形成蛋白2(rhBMP-2)作用于人胎盘间充质干细胞(HPDMSCs)的适宜浓度范围。方法取健康产妇自愿捐赠的胎盘,采用胶原酶消化法分离HPDMSCs,体外培养扩增并鉴定。取第3代HPDMSCs,根据培养液中加入rhBMP-2浓度的不同分为对照组(rhBMP-2浓度为0)和实验A、B、C、D组(rhBMP-2浓度分别为50、100、150、200ng/ml)。在加药后4、8、12、16d采用CCK-8法检测各组细胞增殖的吸光度值A450,碱性磷酸酶(ALP)定量检测法检测酶表达的吸光度值A520。结果获得的HPDMSCs呈长梭形。CD29、CD44、CD105表达阳性,CD34、CD45、CD106、HLA-DR表达阴性。经鉴定,分离培养的细胞具有成骨和成脂的多向分化能力。CCK-8实验结果显示:A、B、C组A450与对照组相比,在所有时间点下差异均无统计学意义(P>0.05);D组A450低于其它组,差异在大部分时间点有统计学意义(P<0.05)。ALP检测结果显示:A、B、C、D组A520在所有时间点均高于对照组(P<0.01);B、C组在8、12、16d高于其它组(P<0.05);B、C组在所有时间点差异无统计学意义(P>0.05)。结论 rhBMP-2浓度在100～150ng/ml范围可有效诱导HPDMSCs成骨向分化,且对HPDMSCs增殖不产生明显影响。     

hOP-1成熟肽基因表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 :构建hOP - 1成熟肽基因表达载体 ,并在大肠杆菌中获得表达 ,为研究OP - 1的功能作用以及制备OP - 1抗体奠定基础。方法 :构建hOP - 1/pEH4表达载体 ,转化大肠杆菌DH5α ,温度诱导表达OP- 1,SDS -PAGE对表达产物进行检测 ,凝胶薄层扫描判定蛋白表达量。结果 :pEH4/OP - 1重组表达载体转化DH5α,经温度诱导后 ,SDS -PAGE显示Mr约为 14× 10 3 的新蛋白条带。薄层扫描测定 ,表达蛋白占菌体总蛋白量的 33%。结论 :构建的hOP - 1/pEH4表达载体 ,在大肠杆菌DH5α中获得OP - 1成功表达     

IPTG诱导变形链球菌葡糖基转移酶可溶性表达及活性初步测定

目的：提取变形链球菌GS5葡糖基转移酶GTF（glucosyltransferase）催化活性区（CAT）的基因,利用IPTG诱导后获得可溶性表达,并检测活性。方法：利用PCR技术克隆CAT的基因片段,通过蛋白重组融合表达技术使其在大肠杆菌BL21中表达,利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导含有质粒pET32-NusA-CAT的大肠杆菌,SDS-PAGE电泳进行检测;采用蒽酮硫酸法验证活性。结果：成功将CAT基因连入大肠杆菌BL21,获得可溶性的融合蛋白表达;并且融合蛋白具有生物学活性。结论：IPTG成功诱导克隆的变形链球菌葡糖基转移酶催化活性区基因并获得可溶性融合蛋白的表达,具有生物学活性。     

人β防御素3重组表达的优化

目的:通过对β防御素3(HBD3)重组表达实验方法的改进,获得大量有活性的重组人β防御素3(rhBD3),为抗菌肽rhBD3的获得提供新的实验依据。方法:将构建好的原核表达质粒pET32a/hBD3在E.coli BL21(DE3)中表达,筛选HBD3优化表达条件,并对其抗菌活性进行评价。结果:含有重组质粒的菌株经IPTG诱导后,表达产物经SDS-PAGE显示在约26 kD处看到预期的条带;对不同诱导时间、温度、IPTG浓度时融合蛋白表达率分析的结果表明:rhBD3在35℃、0.6 mmol/L IPTG、诱导6 h表达量分别达高峰。表达蛋白纯化后,带His-Tag的重组hBD3融合蛋白和酶切纯化的重组hBD3的体外抑菌试验结果显示,该蛋白对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有抗菌活性。结论:通过基因工程方法,在本实验设定的表达条件下,可以制备出大量具有抑菌活性的rhBD3,为今后rhBD3的研究应用提供实验基础。     

大鼠釉原蛋白基因表达的载体构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 观察釉原蛋白（ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ,Ａｍ）基因聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ,ＰＣＲ）产物在大肠杆菌中的表达。方法 利用谷胱苷肽巯基转移酶表达载体４Ｔ－２型（ｐｔａｃ ｇｌｕｔａｈｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ,ＰＧＥＸ－４Ｔ－２）载化大肠杆菌ＤＨ５α,通过异丙基硫代半乳糖苷（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ,ＩＰＴＧ）诱导,收菌。聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果 电泳分析表明,釉原蛋白基因ＰＣＲ产物在大肠杆菌中成功地获得了表达。结论 构建了ＰＧＥＸ－４Ｔ－２／Ａｍ融合表达载体,获得了融合表达的目的蛋白。     

小鼠重组PeriostinC端肽在大肠杆菌中的表达及其产的的活性检测

目的：利用大肠杆菌系统表达小鼠重组PeriostinC端肽。方法：将编码小鼠PeriostinC的基因自然克隆到大肠杆菌表达载体pRSET-B上,使其受控于T7启动子,构建成表达质粒pRS－B－Peri,以大肠杆菌E．coli BL219(DE3)为宿主菌。对工程菌用异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（sopropylthio－β－D－galacto-side,IPTG)诱导表达,表达产物纯化后进行复性处理,再通过观察成骨细胞的伸展性检测其生物活性。结果：经IPTG诱导5h,工程菌在SDS－PAGE上出现一条新蛋白带,相对分子质量（Mr）与预期的一致,约为36000,主要以包涵体形式存在。所得包涵体经纯化和复性处理,得到纯度高于95％的有良好活性的小鼠重组PeriosinC端肽。结论：小鼠重组PeriostinC端肽在大肠杆菌中得到表达并具有良好的生物学活性。     

大肠杆菌密度感应缺陷株中LuxS的表达及其对生物膜形成的影响

目的：研究在大肠杆菌密度感应缺陷株中表达LuxS蛋白对于生物膜形成相关基因的影响。方法：在大肠杆菌密度感应缺陷株MDA12中表达LuxS蛋白,继而通过Real-time PCR检测菌株间生物膜形成相关基因的表达差异。结果：野生株中生物膜形成相关基因motA、motB表达量约为MDA12的2～5倍,而表达了LuxS蛋白的MDA12中该基因的表达量则为6-8倍,且差异具有统计学意义。结论：大肠杆菌密度感应缺陷株内表达LuxS,可以恢复其密度感应系统继而恢复生物膜形成相关基因的表达。     

伴放线放线杆菌菌毛融合蛋白基因的克隆

目的　探讨克隆伴放线放线杆菌菌毛融合蛋白基因ltb-fap的方法。方法　采用PCR方法扩增伴放线放线杆菌菌毛相关蛋白(Fap)和大肠杆菌不耐热性肠毒素B亚单位(Ltb)的融合蛋白基因ltb-fap,NcoⅠ/EcoRⅠ双酶切载体pET28a(+)及ltb-fap基因,连接形成重组质粒pETltb-fap,转化至大肠杆菌DH5α,扩增后提取质粒pETltb-fap进行PCR鉴定、酶切鉴定和序列分析。结果　本实验扩增的ltb基因约为303 bp,fap基因约为228 bp,融合基因约为 531 bp。重组质粒含外源基因片段约为531 bp,酶切鉴定可得到一条约531 bp带,DNA测序结果表明与GenBank中的fap基因序列有97·4%的同源性。结论　成功克隆出融合蛋白基因ltb-fap,为进一步进行蛋白表达、制备抗体奠定基础。     

鼠MyoD原核表达载体的构建及其在大肠杆菌的表达

目的：对鼠肌肉转录调节因子MyoD基因扩增、鉴定，利用大肠杆菌表达其成熟肽。方法：MyoD cDNA基因原始质粒转化，提取质粒，酶切鉴定。然后将基因克隆人大肠杆菌非融合表达载体pBV220，受控于启动子PRPL，重组质粒pBV-my以大肠杆菌DH5α为宿主菌，在42℃进行温度诱导。结果：序列酶切鉴定完全正确；含重组质粒的工程菌经诱导后在SDS—PAGE上出现一条新生蛋白带，相对分子质量为55ku，与预期成熟肽相对分子质量大小一致，约占菌体总蛋白的30％。结论：成功地鉴定了MyoD cDNA序列，通过基因克隆构建了其原核表达载体pBV-my，并在大肠杆菌中得到了高效表达。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白B基因在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 :在大肠杆菌中表达变形链球菌葡聚糖结合蛋白B基因 (glucanbindingproteinB ,gbpB) ,并对重组蛋白进行初步纯化 ,为下一步制备多抗和进行相关的研究奠定基础。方法 :将克隆到的gbpB全长编码区基因克隆到表达载体 pPROEXTMHTb ,构建表达质粒 pPROEXTMHTb - gbpB ,以大肠杆菌E .coliBL2 1(DE3)为宿主菌进行诱导表达 ,表达产物经镍 -次氮基三乙酸 (Ni-NTA)柱进行亲和层析纯化。结果 :工程菌经IPTG诱导 3h后 ,在SDS -PAGE上出现一条新的蛋白条带 ,相对分子量 (Mr)为 4 .5～ 5 .0× 10 3 ,以可溶形式存在 ,经Ni-NTA柱纯化后获得纯度较高的重组葡聚糖结合蛋白B。结论 :获得Mr为 4 .5～ 5 .0× 10 3 的重组葡聚糖结合蛋白B     

Scanning and transmission electron microscopy of the phagocytosis of Treponema denticola and Escherichia coli by human neutrophils in vitro

Abstract – In the present in vitro study, scanning and transmission electron microscopy demonstrated that human neutrophils are able to phagocytize Treponema denticola cells. Two major modes of particle engulfment were detected, both of which seemed unaffected by opsonization or atmosphere (aerobic or anaerobic). The occasional finding of rather intact treponemes as long as 2 h after onset of the phagocytosis experiment, suggested that digestion could be a relatively slow process. Expulsion of digested material from the phagolysosomes to the extracellular space seemed to occur via channel-like structures in the neutrophil cytoplasm.     

rhBMP-7对大鼠成骨细胞增殖及分化能力的影响

目的研究重组人骨形态发生蛋白-7（recombinant human bone morphogenetic proteins,rhBMP-7）对大鼠成骨细胞增殖和分化能力的影响。方法从SD大鼠取材进行原代培养,经碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）和矿化结节检测鉴定为成骨细胞后传代至第3代,接种至96孔培养板。分为A、B、C、D、E、F共6组,每组3个复孔,rhBMP-7浓度分别为0．000、0．500、1．000、5．000、10．000、50．000mg/L。应用四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法及PNPP偶氮法,分析不同浓度rhBMP-7作用72h后对大鼠成骨细胞增殖和ALP活性的影响,应用单因素方差分析和LSD法统计数据。结果作用72h后,6种浓度rhBMP-7对大鼠成骨细胞ALP活性促进作用的差异有统计学意义（F=11．840,P=0．000）,B组成骨细胞ALP活性高于A组,但差异无统计学意义（P=0．078）,C、D、E、F组大鼠成骨细胞ALP活性均高于A组（P值均为0．000）,rhBMP-7浓度为50．000mg／L时对ALP活性的影响最明显（P=0．000）。作用72h后6种浓度rhBMP-7对大鼠成骨细胞增殖影响的差异有统计学意义（F=2．726,P=0．026）;rhBMP-7能促进大鼠成骨细胞的增殖和分化,同A组（rhBMP-7浓度为0．000mg／L）相比,当rhBMP-7浓度为50．000mg／L时并作用至第3天时,大鼠成骨细胞增殖最显著（P=0．000）。结论一定剂量的rhBMP-7明显促进了大鼠成骨细胞的增殖和分化。