RNA干扰双泛素对舌鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响

目的 应用RNA干扰技术抑制人舌鳞状细胞癌细胞株Tca8113中双泛素(diubiquitin)的表达,探讨双泛素表达下调对舌鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响.方法 构建针对双泛素特异性小干扰RNA( small interfering RNA,siRNA)真核表达载体pU-双泛素-siRNA,将其转染至Tca8113细胞,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法检测转染后的Tca8113细胞中双泛素的表达.通过流式细胞仪分析siRNA对舌鳞状细胞癌细胞周期的影响,并通过细胞侵袭能力实验观察siRNA对Tca8113细胞恶性生物学行为的变化.结果 siRNA干扰Tca8113细胞后,双泛素的表达无论是在mRNA水平还是在蛋白质水平均显著下降[mRNA:实验组(0.36±0.03)、空白对照组(0.92±0.07)、空载体组(0.95±0.05);蛋白:实验组(0.39±0.04)、空白对照组(0.64±0.05)、空载体组(0.69±0.05)](P＜0.05),细胞周期被阻滞在G1期,细胞生长缓慢,体外侵袭能力下降(P＜0.05).结论 通过RNAi技术阻断双泛素的表达,可抑制Tca8113细胞的生长、增殖、侵袭,提示双泛素在舌鳞状细胞癌的发生、发展过程中起重要作用.     

采用RNA干扰技术沉默survivin基因对口腔鳞状细胞癌细胞凋亡的影响

目的 应用RNA干扰（RNAi）技术抑制口腔鳞状细胞癌细胞株HSC-3细胞凋亡抑制因子survivin基因的表达，促进HSC-3细胞的凋亡。方法 合成针对survivin基因的小干扰RNA（siRNA），转染对数生长期的HSC-3细胞。采用半定量逆转录聚合酶链反应检测HSC-3细胞中survivin mRNA的表达，MTT法测定细胞活性，tunnel分析和流式细胞术检测HSC-3细胞的凋亡，并设阴性对照组和空白对照组。结果 转染siRNA组survivin mRNA的表达明显低于阴性对照组和空白对照组；MTT法测定细胞活性，阴性对照组和空白对照组没有明显差别，但siRNA组的细胞活性明显下降；tunnel分析显示，转染siRNA组的凋亡细胞明显多于阴性对照组和空白对照组；流式细胞术分析，转染siRNA组的凋亡率（24.99％±1.33％）明显高于阴性对照组（1.24％±0.13％）和空白对照组（0.10％±0.02％）。结论 采用siRNA沉默survivin基因能促进口腔鳞状细胞癌细胞的凋亡，survivin siRNA基因治疗有可能成为口腔鳞状细胞癌治疗的新技术。     

短发卡RNA介导的表皮生长因子受体基因沉默对舌鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡的影响

目的 研究短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)介导的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因沉默对舌鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响,为治疗舌鳞状细胞癌提供依据.方法 构建靶向人EGFR的shRNA真核表达载体并瞬时转染人舌鳞状细胞癌细胞株Tca8113细胞,用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法检测转染前后EGFR的mRNA和蛋白的变化,用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞增殖活性,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 转染后Tca8113细胞的EGFR mRNA和蛋白的表达(0.217±0.047)和(0.324±0.059)均明显下调(P＜0.05),细胞增殖活性(0.340±0.009)明显降低(P＜0.05),细胞凋亡率(39.4±7.7)%显著增高(P＜0.05).结论 shRNA介导的EGFR基因沉默可抑制舌鳞状细胞癌细胞增殖并诱导其凋亡.     

RNA干扰XBP1基因表达对口腔鳞状细胞癌生物学特性的影响研究

目的:检测口腔鳞状细胞癌组织中X盒结合蛋白1(XBP1)的表达及观察抑制其表达后对人口腔鳞状细胞癌Tca8113增殖凋亡的影响,并探讨其机制。方法:RT-PCR检测42例口腔鳞状细胞癌及癌旁组织中XBP1基因的mRNA表达;NC-siRNA和XBP1-siRNA转染至Tca8113细胞内,不经任何处理的细胞作为空白对照组,48 h后,CCK8实验、流式细胞仪分别检测XBP1基因转染对细胞增殖、凋亡的影响;Western blot检测Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达的变化。结果:口腔鳞状细胞癌中XBP1基因的mRNA表达显著高于癌旁组织(P<0.01);转染XBP1-siRNA能够显著降低XBP1的蛋白表达,降低细胞的存活率,促进细胞的凋亡,上调Cleaved caspase3蛋白表达,下调β-catenin、Cyclin D1蛋白表达(P<0.01)。结论:RNA干扰沉默XBP1基因表达可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路降低Tca8113增殖及诱导细胞凋亡。     

微小核糖核酸-21对人舌鳞状细胞癌细胞系生物学特性的影响

目的研究微小核糖核酸-21（miR-21）对人舌鳞状细胞癌细胞系生物学特性的影响。方法将2’O-Me修饰的正义和反义miR-21寡核苷酸序列通过脂质体转染技术转染到舌鳞状细胞癌细胞Tca8113及其高转移株内,采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测转染后miR-21在细胞中的表达变化,通过甲基噻唑基四唑（MTT）法、流式细胞术、Annexin Ⅴ细胞早期凋亡检测、划痕实验及Transwell实验分别检测细胞增殖能力、细胞周期、细胞早期凋亡情况、细胞迁移及侵袭能力的变化。结果靶向miR-21的反义寡核苷酸可以有效地抑制Tca8113及其高转移株细胞的增殖,促进细胞凋亡,并抑制细胞的迁移和侵袭能力。结论细胞内转染反义miR-21寡核苷酸序列后,可以降低舌鳞状细胞癌细胞中miR-21的表达,并对舌鳞状细胞癌细胞的生物学行为产生影响。     

NAF1基因对舌鳞状细胞癌细胞增殖转移能力的影响

目的使用小干扰RNA（si RNA）干扰舌鳞状细胞癌Tca8113细胞中营养缺乏自噬因子1（NAF1）的表达,观察对NAF1基因的沉默效果,并测定沉默后Tca8113细胞生长增殖侵袭能力的变化。方法建立小干扰RNA（si-NAF1）组、阴性对照（si-NC）组、对照（vector）组。采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法和Western blotting法检测NAF1、细胞周期素D1（cyclin D1）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）的表达。MTT实验检测细胞增殖能力,平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,Transwell法观察各组细胞侵袭能力变化。结果与vector组相比,NAF1-si RNA干预Tca8113细胞后,si-NAF1组NAF1的m RNA和蛋白表达水平都明显降低（χ^2=25.65,t=-17.1,P〈0.05）,cyclin D1、MMP-2蛋白表达水平降低（tcyclin D1=-14.7,tMMP -2=-9.6,P〈0.05）,细胞增殖能力明显降低（t=-36.77,P〈0.05）,克隆形成能力明显减弱（t=-12.33,P〈0.05）,侵袭能力明显降低,si-NAF1组穿过Transwell膜的细胞少于vector组。结论通过si RNA技术降低NAF1表达可能通过降低cyclin D1水平抑制舌鳞状细胞癌Tca8113细胞的增殖能力,通过影响MMP-2蛋白表达水平,抑制Tca8113细胞的侵袭能力。     

沉默长链非编码RNA HOTAIR对舌鳞状细胞癌细胞放射敏感性的影响

目的:研究下调长链非编码RNA HOTAIR的表达水平对舌鳞状细胞癌细胞株CAL-27和SCC-9放射敏感性的影响。方法:设计3条干扰HOTAIR的序列,通过慢病毒载体转染至CAL-27和SCC-9中,运用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)验证干扰效率。将细胞分为空白组(CAL-27、SCC-9)、实验组(si-HOTAIR CAL-27、si-HOTAIR SCC-9)、阴性对照组(si-NC CAL-27、si-NC SCC-9),再将以上细胞给予8 Gy电子线照射,MTT法检测各组细胞增殖,划痕实验检测各组细胞迁移,流式细胞实验检测各组细胞凋亡情况。结果:在3条慢病毒载体中,si-2及si-3可下调HOTAIR在CAL-27和SCC-9中的表达(P<0.05),且si-3干扰效率最高(P<0.05),在接受8 Gy电子线照射后,与对照组(si-NC CAL-27、si-NC SCC-9)相比,实验组(si-HOTAIR CAL-27、si-HOTAIR SCC-9)的增殖能力明显减弱(P<0.05);细胞凋亡率增加[(23.87±1.97)%vs.(46...     

小干扰RNA沉默Dicer酶对人舌鳞癌细胞Tca-8113的增殖和细胞周期的影响

目的研究沉默Dicer酶的表达对人舌鳞癌细胞Tea-8113的增殖和细胞周期的影响。方法实验组转染靶向Dicer酶的siRNA序列；时照组转染尤义序列siRNA；空白组细胞未做转染？采用RNA于扰技术沉默Tea-8113中Dicer酶的表达，通过荧光定量聚合酶链反应、蛋白质印迹法及免疫组织化学技术，检测Tea-8113转染小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）后Dicer酶的mRNA和蛋白质水平的表达情况；应用噻唑蓝比色法及流式细胞术榆测细胞增殖及细胞周期的变化。结果Tea-8113细胞转染siRNA24h后，实验组Dicer酶mRNA表达量是空白组的0．39倍．表达水平下降，实验组与空白组或对照组比较，表达水平都有所下降，差异有统计学意义（P〈0．05）、转染48h后实验组蛋白质表达较空白组下调53．67％。Dicer酶表达下凋后，Tca-8113细胞增殖加速，G1期细胞百分率减少，S期和G2期细胞百分率增多。结论沉默Dicer酶的表达可加快细胞周期从G1期向S期和G2期进展．促进Tea-8113细胞的生长。     

体外沉默Rce1对舌鳞状细胞癌细胞侵袭和迁移能力的影响

目的 通过RNA干扰技术沉默Rce1基因,探讨Rce1对舌癌细胞侵袭和迁移能力的影响。方法 体外培养舌鳞状细胞癌Cal-27和SCC-4细胞,设计合成Rce1基因的小干扰RNA（siRNA）,采用脂质体载体瞬时转染沉默Rce1基因。根据转染的siRNA不同,将实验组分为Rce1-siRNA-1组、Rce1-siRNA-2组、Rce1-siRNA-3组,脂质体载体分别转染相对应序列的siRNA。脂质体转染siCON作为阴性对照组,不转染siRNA作为空白对照组。采用实时定量聚合酶链反应检测各组Rce1、RhoA以及K-Ras基因的表达,蛋白质印迹法（Western blot）检测Rce1、RhoA、K-Ras、金属基质蛋白酶（MMP）-2及MMP-9的表达,采用体外侵袭实验检测Cal-27和SCC-4的侵袭能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果 实时定量聚合酶链反应及Western blot检测结果显示,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组的Rce1基因及蛋白表达均下调（P<0.05）,RhoA、K-Ras基因及蛋白表达无统计学差异（P>0.05）,MMP-2、MMP-9表达下降（P<0.05）。体外侵袭实验表明,与对照组相比,实验组在聚碳酯膜上的细胞总数明显减少（P<0.05）。细胞划痕实验表明,实验组划痕处细胞闭合时间明显长于对照组（P<0.05）。结论 体外沉默Rce1可以有效下调其在舌癌细胞Cal-27和SCC-4中的表达水平,降低迁移和侵袭能力。     

血管内皮生长因子小干扰RNA抑制人舌鳞状细胞癌细胞移植瘤生长及血管生成的实验

目的 观察小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达对人舌癌Tca8113细胞移植瘤的治疗作用.方法 构建Tea8113细胞裸鼠皮下移植瘤模型,随机分成4组,A组、B组为实验组,C组:以空载体注射为治疗对照组,D组:未治疗为空白对照组,每组5只.脂质体法将两对VEGF siRNA真核表达载体(PU-VEGF-siRNAl、PU-VEGF-siRNA2)作瘤体内及瘤周注射,1次/3 d,共10次后处死裸鼠;测量瘤体积及瘤重;反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blotting和免疫组化法分别检测瘤组织VEGF-mRNA及VEGF蛋白表达,并检测瘤内微血管密度;流式细胞仪检测肿瘤细胞悬液的细胞周期比例,Tunel法检测组织细胞凋亡.结果 B组瘤体积(0.402±0.158)cm3、瘤重量(2.12±0.58)g,均低于C、D组,细胞G1期比例为(40.26±1.42)%,较C、D组增加,B组瘤组织VEGF mRNA(0.752±0.048)和蛋白表达(1.12±0.15),组织切片VEGF阳性细胞表达率(12.56±1.30)%、平均灰度值(164.2±15.42)及微血管密度(3.50±1.58)个,均低于C、D组(P<0.05),凋亡细胞增加(P<0.01).结论 siRNA能在体内抑制舌癌VEGF表达,减少肿瘤血管生成,延缓肿瘤生长.不同的干扰片段体内作用效果存在差异.     

放疗对舌鳞癌Tca 8113细胞多药耐药蛋白及耐药性的影响

目的：探讨放疗对舌鳞癌Tca 8113细胞和耐药的Tca 8113／CBDEA细胞耐药性的影响。方法：应用免疫组化SP法检测放疗对P-糖蛋白（P-glycoprotein,P—gP）、多药耐药相关蛋白1（muhidrug resistance associate protein 1,MRP1）和谷胱甘肽硫-转移酶π（glutathione S—tranferase π,GST-π）表达的影响和检测放疗对细胞内阿霉素浓度的影响。结果：Tca 8113／CBDEA细胞在放疗后4hP—gP,MRP1,GST-π耐药蛋白表达无明显上升,24h耐药蛋白的表达明显升高（P〈0．01）,Tca8113细胞的耐药蛋白表达在4h和24h时均有明显上升（P〈0．01）。放疗以后肿瘤细胞内阿霉素（ADM）浓度有明显下降。结论：放疗可引起舌鳞癌细胞的耐药。提醒我们对舌癌患者进行放疗和化疗的方案设计时应考虑此点。     

抑癌基因Lkb1超表达载体构建及其在人舌鳞癌细胞SCC-15中的生物活性分析

目的:了解抑癌基因LKB1对人舌鳞癌细胞的影响,初步探讨其相关通路机制。方法:构建LKB1真核表达载体,通过脂质体转染人舌鳞癌细胞系(SCC-15),利用RT-PCR、Western blot 和流式细胞术来检测SCC-15中基因表达和细胞周期凋亡的变化。结果:LKB1在SCC-15细胞中mRNA水平上成功过表达约300倍,蛋白表达水平也显著上调;同时发现LKB1超表达对细胞周期起阻滞作用,并可上调p53、PTEN和TGF-β,同时下调VEGF的表达,差异均有统计学意义。结论:成功构建了LKB1真核表达载体,该基因在SCC-15细胞中超表达对细胞周期起阻滞作用,调控p53、PTEN、TGF-β和VEGF基因表达,可能参与调控p53和TGF-β等多种信号通路,为进一步研究 LKB1 基因在恶性舌鳞癌发病的机制和临床治疗的作用提供了重要实验依据。     

HMGB 1在舌鳞状上皮癌中的表达及临床意义

目的:探讨舌鳞癌中高迁移率族蛋白1(HMGB1)的表达及其对淋巴结转移和疾病转归的关系。方法:收集51例有完整临床及随访资料的舌鳞癌石蜡标本,采用免疫组织化学染色法观察HMGB1在不同分类的口腔鳞癌组织中的表达,并分析HMGB1与肿瘤分化程度、淋巴结转移及患者预后之间的关系。结果:HMGB1在舌鳞癌组织中呈高表达,阳性率92.2%;HMGB1表达与肿瘤分化程度在统计学上无显著相关性;有淋巴结转移的高表达率为81.2% ,无淋巴结转移的高表达率为32.6%,其差异具有统计学意义(P＜0.05)。高表达HMGB1的舌鳞癌患者较低表达者转归差,其生存率较低(P＜0.05)。结论:舌鳞癌组织中HMGB1与淋巴结转移及转归密切相关; HMG1的表达在一定程度上可用作反映舌鳞癌预后的重要生物学指标。     

干扰素γ对舌鳞癌细胞增殖影响的研究

目的：观察干扰素γ对舌鳞癌细胞增殖的影响。方法：采用不同浓度的干扰素γ对舌鳞癌细胞处理,观察肿瘤细胞的增殖情况;基因芯片分析干扰素γ处理后基因表达的变化,并采用实时定量PCR验证;western blot检测AKT信号通路的表达情况。结果：采用不同浓度的干扰素γ处理CAL27细胞后,肿瘤细胞的生长明显加快,肿瘤生长72、96h后,细胞数量有显著性差异（P〈0.05）。基因芯片结果显示PIK3C2A的表达提高2.5倍以上。western blot结果证实干扰素γ处理细胞后,AKT信号通路被激活。结论：干扰素γ处理舌鳞癌细胞后能加快肿瘤细胞的生长,激活AKT信号通路,其不适用直接对舌鳞癌进行治疗。     

肿瘤相关成纤维细胞促进舌鳞癌细胞上皮间质转化

目的：检测舌鳞癌组织中肿瘤相关成纤维细胞是否诱导舌癌细胞的上皮间质转化。方法：通过体外原代培养舌鳞癌组织肿瘤相关成纤维细胞的培养上清作用于舌鳞癌细胞系Tca8113,通过检测细胞形态确认肿瘤细胞是否发生上皮间质转化。利用实时定量PCR及免疫印迹检测舌鳞癌细胞上皮标志及间质标志物表达。利用TGF-β/Smad信号通路阻断剂探究TGF-β在此过程的作用。结果：肿瘤相关成纤维细胞促进Tca8113的上皮间质转化。利用实时定量PCR检测及免疫印迹发现肿瘤相关成纤维细胞可以明显促进Tca8113细胞的Vimentin的表达。SB431542,TGF-β/Smad信号通路特异性阻断剂可明显阻断肿瘤相关成纤维细胞条件培养基对Tca8113上皮间质转化的诱导作用。结论：舌鳞癌组织中的肿瘤成纤维细胞可通过诱导舌鳞癌细胞的上皮间质转化促进舌鳞癌细胞的迁移及侵袭,可能在肿瘤发展过程发挥重要作用。     

舌鳞状细胞癌淋巴结转移与长链非编码RNA HOTAIR的关系探讨

目的:研究HOTAIR在舌鳞状细胞癌中的表达,并探究HOTAIR与舌鳞状细胞癌淋巴结转移的关系。方法:对19例舌鳞状细胞癌患者的癌组织以及其对应的19例癌旁组织进行实时荧光定量PCR检测,检测HOTAIR在癌组织、癌旁组织的相对表达量,把结果与患者的TNM分期进行关联比较,并进一步通过构建沉默HOTAIR表达的CAL27、SCC9细胞系,检测肿瘤细胞侵袭、迁移能力的改变。结果:19对舌鳞状细胞癌组织中,26.3%显示出HOTAI的高表达(P=0.016 9<0.05),且高表达者均为具有淋巴结转移的患者,而在无淋巴结转移的癌组织中HOTAIR呈现低表达(P<0.001),通过RNA干扰技术降低HOTAIR在CAL27及SCC9细胞系中的表达水平,结果发现细胞侵袭(P<0.001)和迁移能力(P<0.001)受到了抑制。结论:长链非编码RNA HOTAIR在舌鳞状细胞癌淋巴结转移过程中可能发挥促进因子的作用。     

二维及三维培养对人舌鳞状细胞癌TCA8113细胞株生物学特性的影响

目的: 比较二维及三维方式培养的人舌鳞状细胞癌(简称鳞癌)TCA8113细胞株对细胞的增殖、组织形态及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性的影响,为体外舌鳞癌的研究提供培养方法。方法: 倒置显微镜和苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色观察二维及三维培养的人舌鳞癌TCA8113细胞的形态;噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法观察两种培养体系中细胞的增殖;酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测两种培养体系中LDH活性的改变。结果: 倒置显微镜和HE染色观察到三维培养体系中TCA8113细胞成团生长;与二维培养体系比较,三维培养体系中细胞较长时间保持良好的增殖状态,LDH的活性较二维培养的细胞活性显著增高。结论: TCA8113细胞藻酸盐凝胶三维培养体系较二维培养体系能更好地体现细胞的生物学特性。     

粘着斑激酶对Tca8113舌鳞癌细胞生物学特性的影响

目的研究粘着斑激酶（FAK）在Tca8113舌鳞癌细胞中的表达及对其生长、粘附、侵袭转移能力的影响。方法采用FAK寡核苷酸转染的方法处理Tca8113舌鳞癌细胞,采用逆转录- 聚合酶链反应（RT- PCR）测定FAKmRNA水平的变化,间接免疫荧光方法检测胞浆FAK蛋白的表达,以Transwell小室和冲刷实验的方法计数细胞,测定细胞的粘附和侵袭能力的变化,MTT法检测细胞的生长抑制情况。结果反义FAK寡核苷酸转染后,Tca8113细胞侵袭、粘附、趋化运动能力均显著降低。转染48 h后,FAKmRNA和蛋白水平明显下降（P<0.05）。结论FAK对Tca8113细胞的增殖、存活、粘附及侵袭具有重要作用。     

口腔鳞癌细胞分泌的胞外体对其生物学行为的影响

目的:研究口腔鳞状细胞癌细胞细胞株(OSC-4)分泌的胞外体对细胞生物学行为的影响。方法:培养 OSC-4,从其上清培养液中分离提纯胞外体(exosome, EXO),CD9标记,将提取的胞外体作用于OSC-4,MTT检测胞外体对 OSC-4增殖能力的影响,细胞划痕实验检测胞外体对OSC-4迁移能力的影响,transwill小室侵袭实验检测胞外体对OSC-4侵袭能力的影响。结果:细胞上清液提取物免疫金标结果可见金标记的CD9,即分离提纯物为胞外体;MTT检测结果显示胞外体作用后的OSC-4的增殖能力增强(P＜0.05),细胞划痕实验结果显示其迁移能力增强和transwill小室侵袭实验结果显示其侵袭能力也增强(P＜0.05)。结论:OSC-4分泌的胞外体可以促进口腔鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移、浸润能力。