CCL18通过与Nir1结合促进胶质瘤细胞侵袭的研究

背景与目的：Nir1是CCL18的跨膜受体,CCL18能与之特异性结合而促进乳腺癌细胞的侵袭与转移,但其在胶质瘤细胞中的作用尚不清楚。该文旨探讨Nir1在胶质瘤侵袭中的作用及分子机制。方法：应用蛋白［质］印迹法(Western blot)检测Nir1在不同胶质瘤细胞系中的表达;利用siRNA技术抑制U251细胞中Nir1的表达;采用Western blot检测转染后Nir1蛋白的表达和转染前后U251细胞中Akt磷酸化的情况;使用体外侵袭实验检测转染后细胞的运动和侵袭能力;采用F-actin聚合实验检测F-actin的聚合能力。结果：Nir1在各胶质瘤细胞中均呈高表达;小RNA干扰技术沉默Nir1基因后,U251细胞中Nir1的蛋白表达量明显下降,侵袭并穿透Matrigel胶的细胞数目明显比对照组少(P=0.00);在CCL18刺激后细胞内的F-actin聚合量比对照组减少;Akt磷酸化试验结果显示,对照组细胞在CCL18的刺激下Akt更易发生磷酸化,实验组细胞无论是否存在CCL18,Akt磷酸化都受到抑制。结论：在胶质瘤细胞中存在Nir1蛋白高表达,通过与细胞膜上CCL18特异性结合来调节胶质瘤细胞的F-actin聚合和Akt的磷酸化进而调控胶质瘤细胞的运动和侵袭能力。     

同源异型盒基因HOXA5对胃癌细胞BGC823侵袭能力的影响

目的 检测人胃癌组织中HOXA5基因的表达情况,观察干扰HOXA5基因的表达之后,胃癌细胞BGC823的迁移和侵袭能力的变化,为阐明HOXA5在胃癌向远处转移的分子机制中提供新的思路.方法 通过实时定量PCR(qRT-PCR)、Western blot以及免疫组织化学等技术,检测胃癌组织中HOXA5基因的表达.应用细胞转染的方法 将HOXA5基因的过表达质粒转入胃癌细胞BGC823中,经qRT-PCR和Western blot验证HOXA5表达上调之后,利用Transwell侵袭实验检测BGC823细胞侵袭能力的变化.结果 在收集的69例新鲜的胃癌组织以及相对应的癌旁组织中,免疫组织化学显示相比于癌旁组织的表达情况,胃癌组织中只有26例HOXA5的表达高于癌旁组织,比例为37.7％;qRT-PCR、Western blot检测发现相对于癌旁组织,胃癌组织中HOXA5的表达水平显著下调(mRNA水平下调3倍,蛋白水平下调2倍,差异具有统计学意义,P<0.05).BGC823细胞转染了过表达质粒之后,HOXA5的表达能够被上调.过表达了HOXA5基因的BGC823细胞的侵袭能力下降.结论 在胃癌组织中HOXA5的表达下调,而在胃癌细胞BGC823中增强HOXA5的表达能够降低细胞的侵袭能力,说明HOXA5在胃癌的发生发展和侵袭、转移中发挥着抑癌基因的作用,可作为一个新的治疗靶点.     

microRNA-10a对胃癌细胞系BGC823迁移和侵袭能力的影响

目的：研究人微小RNA-10a（microRNA-10a,miR-10a）对胃癌细胞系BGC823迁移和侵袭能力的影响。方法：利用Transwell小室对胃癌细胞系BGC823进行侵袭筛选,获得高侵袭能力的BGC823-P3亚系;通过miRNA芯片差异分析发现miR-10a在高侵袭能力BGC823-P3细胞的表达显著高于BGC823细胞。通过化学方法合成成熟型的人miR-10a,以脂质体包裹合成的miR-10a（25、50、100、150nmol/L）转染BGC823细胞,并设空白转染、无关序列转染对照组;Real-timePCR分别检测以上各组细胞miR-10a的表达。采用细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测miR-10a对细胞增殖的影响,流式分析检测miR-10a对细胞凋亡的影响,Transwell小室检测miR-10a对细胞的迁移和侵袭能力的影响。结果：化学合成的成熟型miR-10a转染后,BGC823细胞miR-10a表达的提高以100nmol/LmiR-10a转染组最佳,较无关序列转染组提高了2.06倍。miR-10a（100nmol/L）的转染对胃癌细胞系BGC823的增殖和凋亡无明显影响,但对BGC823的迁移和侵袭能力有明显的促进作用,促进率分别为（88.34&#177;0.61）%和（56.02&#177;3.13）%。结论：转染成熟型人miR-10a能使胃癌细胞系BGC823中miR-10a的表达提高,并能显著促进胃癌细胞系BGC823的迁移和侵袭。     

过表达KLF4通过Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞EMT和细胞周期的实验研究

目的:探讨过表达KLF4通过Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞上皮-间质转化和细胞周期的作用机制。方法:将课题组前期已成功转染过表达KLF4的BGC-823细胞分为KLF4过表达载体组(BGC823-OE组)、空病毒载体组(BGC823-NC组)和未经处理的BGC-823细胞组（BGC823-Ctrl组）。Western blot和qRT-PCR检测KLF4、EMT和Wnt信号通路相关蛋白和mRNA在三组细胞中的表达水平。CCK-8实验、划痕实验、Transwell迁移实验、平板克隆实验和流式细胞术观察各组细胞的增殖能力、迁移能力、克隆形成能力和细胞周期变化情况。结果:Western blot和qRT-PCR实验结果显示BGC823-OE组KLF4蛋白和mRNA表达水平明显升高。上皮-间质转化的上皮标志物E-cadherin蛋白和mRNA表达水平升高,间质标志物N-cadherin蛋白和mRNA表达水平降低。Wnt信号通路下游靶基因β-catenin和Cyclin D1的蛋白和mRNA表达水平降低。CCK-8增殖实验结果显示BGC823-OE组的增殖能力下降。划痕实验和Transwell迁移实验结果显示BGC823-OE组的迁移能力下降。平板克隆结果显示BGC823-OE组的克隆能力下降。流式细胞术结果显示BGC823-OE组G0/G1期比例增高,S期比例降低。结论:过表达KLF4可能通过Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞EMT及阻滞胃癌细胞的细胞周期。     

PKM2对人胃癌细胞HMGB1释放的影响

目的:探讨M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,PKM2)对胃癌细胞高迁移率族蛋白B-1(high mobility group box 1,HMGB1)释放的作用。方法:通过siRNA干扰抑制人胃癌BGC823细胞PKM2的表达,Western blot检测各组细胞PKM2蛋白的表达,以评价PKM2 siRNA的转染效率;CCK-8法检测各组细胞活力,分析干扰PKM2的表达对胃癌BGC823细胞增殖的影响;Western blot检测各组细胞HMGB1的表达以及ELISA检测各组细胞培养液HMGB1的水平,分析PKM2对胃癌BGC823细胞HMGB1的作用。结果:与空载体pU6组相比,PKM2 siRNA 组PKM2的表达显著降低(P＜0.01),表明siRNA有效地抑制胃癌BGC823细胞PKM2的表达;CCK-8结果显示,PKM2 siRNA 组细胞活力明显低于空载体pU6组(P＜0.001),表明干扰PKM2抑制胃癌BGC823细胞增殖;此外,PKM2 siRNA 组HMGB1的表达以及细胞外HMGB1的水平显著降低(P＜0.01),表明干扰PKM2抑制人胃癌BGC823细胞HMGB1的释放。结论:PKM2促进人胃癌BGC823细胞HMGB1的释放。     

小分子化合物O-565抑制胃癌细胞迁移侵袭及机制研究

目的:研究小分子化合物O-565对人胃癌细胞BGC823、MKN-45增殖、迁移和侵袭能力的影响及其作用机制。方法:应用MTT检测不同浓度小分子化合物O-565对胃癌细胞BGC823和MKN-45增殖能力的影响。分别用0、20、40、60μmol/L浓度的化合物O-565处理BGC823和MKN-45两种胃癌细胞,应用Transwell小室检测其对上述两种细胞迁移侵袭能力的抑制作用,Westernblot检测化合物对金属基质蛋白酶2(MMP-2)表达及丝切蛋白(Cofilin)磷酸化水平的影响。结果:化合物O-565对于BGC823和MKN-45两种胃癌细胞的增殖能力无明显影响,却能够以剂量依赖的方式抑制上述细胞的迁移和侵袭。Westernblot结果显示O-565能够下调胃癌细胞BGC823中MMP-2的表达及Cofilin的磷酸化水平。结论:化合物O-565可能通过下调细胞中MMP-2的表达及Cofilin的磷酸化水平,抑制BGC823、MKN-45胃癌细胞的迁移和侵袭。     

microRNA 10a对胃癌细胞系BGC823迁移和侵袭能力的影响

摘　要　目的:研究人微小RNA10a（microRNA10a，miR10a）对胃癌细胞系BGC823迁移和侵袭能力的影响。方法：利用Transwell小室对胃癌细胞系BGC823进行侵袭筛选，获得高侵袭能力的BGC823P3亚系；通过miRNA芯片差异分析发现miR10a在高侵袭能力BGC823P3细胞的表达显著高于BGC823细胞。通过化学方法合成成熟型的人miR10a，以脂质体包裹合成的miR10a（25、50、100、150 nmol/L）转染BGC823细胞，并设空白转染、无关序列转染对照组; Realtime PCR分别检测以上各组细胞miR10a的表达。采用细胞计数试剂盒8（Cell Counting Kit8，CCK8）检测miR10a对细胞增殖的影响，流式分析检测miR10a对细胞凋亡的影响，Transwell小室检测miR10a对细胞的迁移和侵袭能力的影响。结果：化学合成的成熟型miR－10a转染后，BGC823细胞miR10a表达的提高以100 nmol/L miR10a转染组最佳，较无关序列转染组提高了2.06倍。 miR10a（１００ nmol/L）的转染对胃癌细胞系BGC823的增殖和凋亡无明显影响，但对BGC823的迁移和侵袭能力有明显的促进作用，促进率分别为（88.34± 0.61）% 和（56.02±3.13）%。结论：转染成熟型人miR－10a能使胃癌细胞系BGC823中miR10a的表达提高，并能显著促进胃癌细胞系BGC823的迁移和侵袭。     

siRNA干扰Chk1抑制人胃癌BGC823细胞增殖的实验研究

背景与目的：细胞周期检测点激酶1（checkpoint kinase1,Chk1）与肿瘤的关系及其在肿瘤发生、发展及治疗中的作用是目前研究的热点。为探索Chk1在人类肿瘤细胞中对生长增殖活性和细胞周期的调控作用,本研究旨在观察siRNA干扰Chk1基因对人胃癌BGC823细胞生长及周期的影响。方法：采用RNAi技术抑制BGC823细胞中Chk1表达,采用Western blot检测转染前后Chk1蛋白表达情况,实验分为未转染组、脂质体组和Chk1siRNA转染组三组。然后采用MTT法和流式细胞术分析Chk1基因沉默对人胃癌BGC823细胞生长及周期的影响。结果：Western blot检测结果显示,Chk1siRNA转染24h后,BGC823细胞中Chk1蛋白相对灰度值为0.11&#177;0.08,明显弱于未转染对照组的0.66&#177;0.21和脂质体转染组的0.70&#177;0.25（P〈0.05）,而未转染对照组和脂质体转染组之间比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。转染Chk1siRNA的BGC823细胞其Chk1蛋白表达量下降了83.1%。MTT法检测结果显示,Chk1蛋白表达缺失可导致BGC823细胞增殖活性下降,其增殖抑制率为48.1%（P〈0.05）。FCM法检测结果显示,Chk1基因沉默后细胞周期在G0/G1期发生停滞,未转染组24和48h后细胞在G0/G1期为48.3%和50.2%,转染Chk1siRNA组细胞在转染24和48h后G0/G1期增加至63.9%和66.1%,增殖指数（PI）由51.7%（24h）和49.8%（48h）减少至36.2%（24h）和34.4%（48h）。结论：Chk1siRNA转染可明显抑制人胃癌细胞增殖,且其抑制增殖作用与诱导G0/G1期阻滞有关。     

下调热休克蛋白 27 表达对胃癌细胞侵袭转移能力的影响

目的：下调胃癌细胞HSP27的表达水平,观察胃癌细胞侵袭转移能力的变化.方法：利用Western blot方法选取HSP27高表达的胃癌细胞系,采用siRNA技术下调HSP27的表达,通过Transwell小室和划痕实验观察细胞系侵袭转移能力的变化.结果：Western blot实验结果显示,BGC823细胞和MKN28细胞中HSP27的呈高表达状态.转染HSP27-siRNA后,BGC823细胞和MKN28细胞中HSP27在蛋白水平和mRNA水平表达量均有显著地下降,验证转染成功.Transwell小室和划痕实验发现,转染HSP27-siRNA后BGC823和MKN28细胞的侵袭转移能力显著低于阴性对照组.结论：HSP27与胃癌细胞的侵袭转移能力密切相关,抑制HSP27的表达能够使胃癌细胞的侵袭转移能力明显下降.     

过表达P27Kip1对胃癌细胞P27蛋白及其磷酸化产物表达分布的影响

研究胃癌BGC823细胞系中过表达P27蛋白时,P27及其磷酸化蛋白在细胞中的分布。方法：将外源性P27Kip1基因转染人胃癌细胞系BGC823,应用流式细胞分析术检测转染组和对照组的细胞周期和细胞凋亡,采用Western blot和免疫荧光方法,检测P27蛋白和磷酸化P27蛋白（p-P27）在二组细胞中的表达和分布。结果：转染组细胞G1期细胞数较对照组明显增加（62.783% vs. 41.933%,P<0.001）;转染组细胞凋亡指数（AI）显著高于对照组（26.3 vs. 3.6,P<0.001）。转染组P27蛋白和p-P27表达均高于对照组。对照组P27蛋白主要在胞核内表达,p-P27主要在胞浆内表达;转染组P27蛋白主要在胞核内分布,p-P27蛋白在胞浆、胞核内均有分布表达,但主要分布在胞核内。结论：P27蛋白过表达能够使细胞周期停滞于G1期,诱导细胞凋亡。推测胞核内P27蛋白水平和p-P27的核浆比值可能是评价肿瘤增殖活性的重要指标。     

miR-106a靶向调控TIMP2对人胃癌细胞增殖、转移及EMT的影响

目的 探讨微小RNA-106a(miR-106a)在人胃癌组织中的表达及其与癌细胞增殖、转移的关系。方法 收集人胃癌和配对癌旁福尔马林固定-石蜡包埋样本共50对,Real-time PCR法检测miR-106a在人胃癌组织中的表达;培养人低分化胃癌细胞系SGC-7901、BGC-823、MKN-45和永生化人胃黏膜上皮细胞GES-1,Real-time PCR法检测miR-106a在人胃癌细胞中的表达;MTT法检测细胞增殖,Transwell法检测细胞迁移和侵袭,生物信息学和双荧光素酶法鉴定miR-106a靶基因,Western blot检测靶蛋白TIMP2、MMP2、MMP9、E-cadherin、N-cadherin表达。结果 Real-time PCR检测显示,与癌旁组织比较,miR-106a在人胃癌组织中高表达,差异有统计学意义(P＜0.001);与GES-1细胞比较,miR-106a在人胃癌细胞SGC-7901、BGC-823、MKN-45中普遍高表达,差异有统计学意义(P＜0.001)。MTT检测显示抑制miR-106a后胃癌细胞SGC-7901、BGC-823增殖能力下降(P＜0.01)。Transwell显示胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭能力下降(P＜0.001)。双荧光素酶法显示TIMP2野生型报告基因与miR-106a mimic共转后,其荧光素酶活性较miR-106a NC组明显下降(P＜0.001),但TIMP2突变型报告基因无明显变化。Western blot显示抑制miR-106a后TIMP2表达升高,MMP2、MMP9表达下降,E-cadherin表达升高,N-cadherin表达下降。结论 miR-106a在人胃癌中的高表达可能通过靶向TIMP2而影响癌细胞的增殖、转移和上皮-间质转化。     

β-榄香烯对胃癌细胞Akt通路活化和凋亡相关蛋白表达的影响

目的：旨在探讨β-榄香烯对人胃癌BGC823细胞Akt通路的活化和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和PARP表达的影响。方法：实验分为对照组和β-榄香烯处理组,采用四甲基偶氮唑盐（MTT）试验法检测β-榄香烯对人胃癌BGC823细胞的药物敏感性,采用Western blot检测蛋白表达,应用SPSS（13.0软件包）进行统计学分析。结果：β-榄香烯处理胃癌BGC823细胞24h的IC50为46.56μg/ml,选用50μg/ml和200μg/ml的β-榄香烯处理24h,BGC823细胞凋亡率分别为12.33%和42.59%,与对照组相比有统计学差异（P〈0.05）。与对照组相比,β-榄香烯处理组Bcl-2与Bax的比值显著下调、伴有PARP裂解。进一步检测发现β-榄香烯处理组明显下调了Akt的磷酸化水平,从而有效抑制Akt信号转导通路。结论：β-榄香烯可以通过抑制Akt信号通路的活化、下调Bcl-2与Bax的比值和诱导PARP裂解,进而抑制胃癌细胞增殖和诱导细胞凋亡。     

剪接因子SF3b6通过MAPK信号通路促进胃癌细胞的增殖和迁移

目的:探讨剪接因子3b亚基6(splicing factor 3b subunit6,SF3b6)对胃癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等的影响及其作用机制.方法:通过组织芯片检测SF3b6在胃癌和癌旁组织中的表达,采用WB和qPCR检测SF3b6在正常永生化胃上皮细胞(GES-1)和胃癌细胞系(HGC27、AGS、BGC8...     

miR-6775-3p在乳腺癌细胞中的表达及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响

背景与目的：微小RNA（microRNA,miRNA）与肿瘤的发生、发展过程密切相关。探讨miR-6775-3p在乳腺癌细胞系中的表达及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响。方法：通过实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR）检测4种乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-453、MDA-MB-468和BT-549中miR-6775-3p的表达水平,选取miR-6775-3p表达水平最低的乳腺癌细胞系过表达miR-6775-3p后,采用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）法检测细胞的增殖情况,同时采用transwell迁移和侵袭实验分别检测细胞迁移和侵袭能力的变化。通过RTFQ-PCR和蛋白［质］印迹法（Western blot）检测miR-6775-3p过表达的乳腺癌细胞系中细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶4（cyclin-dependent protein kinase 4,CDK4）和CDK6,以及侵袭转移标志物基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）17和MMP24 mRNA以及蛋白的表达变化。结果：RTFQ-PCR结果显示,乳腺癌细胞系MDA-MB-453中miR-6775-3p的表达最低,在MDA-MB-453细胞中转染miR-6775-3p mimics后,miR-6775-3p的表达水平明显升高（P<0.001）。CCK-8实验结果显示,MDA-MB-453细胞过表达miR-6775-3p后,细胞的增殖能力明显降低（P<0.01）。Transwell迁移和侵袭实验结果显示,MDA-MB-453细胞过表达miR-6775-3p后,细胞的迁移（P<0.001）和侵袭能力（P<0.01）明显降低。RTFQ-PCR和Western blot实验结果显示,CDK4、CDK6及MMP17、MMP24的mRNA表达和蛋白水平均显著降低（P<0.01）。结论：miR-6775-3p可能抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。     

Vav3对人胃癌细胞株BGC823血管生成基因的调节作用及意义

背景与目的：研究发现Vav3基因在多种恶性肿瘤中表达异常,但Vav3与胃癌血管生成的关系尚不明确。本研究通过抑制内源性Vav3,观察其对胃癌细胞血管生成基因表达的影响,并探讨其机制和意义。方法：荧光定量RT-PCR及蛋白质印迹法(Western blot)检测人胃癌细胞株BGC823、胃上皮细胞株GES-1中Vav3的表达;合成针对Vav3的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA),并转染胃癌细胞株BGC823;MTT法检测转染前后胃癌细胞的活性;检测转染前后BGC823血管生成相关基因血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)、VEGF-C、VEGF-D、血管生成素-2(angiogenin-2,Ang-2)、血管生成抑制蛋白-1(vasohibin-1)表达的变化。结果：Vav3在胃癌BGC823细胞中的表达明显高于胃上皮细胞株GES-1(P<0.01);Vav3-siRNA转染BGC823细胞后,Vav3表达明显受到抑制(P均<0.01);MTT结果显示Vav3-siRNA转染后,BGC823活性明显降低(P<0.05);转染后B G C 8 2 3 中VEGF-C和Ang-2表达均较转染前降低(P均<0 . 0 5 ) , 而vasohibin-1表达则升高(P均<0.05)。结论：Vav3对部分胃癌细胞血管生成相关基因有调控作用,并可能通过这种作用促进肿瘤血管生成。     

PRMT5在胃癌中的表达及其对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移能力的影响

背景与目的:蛋白精氨酸甲基转移酶5(protein arginine methyltransferase 5,PRMT5)是一种能调控细胞周期的酶,对细胞分裂周期有影响,可以通过调控细胞分裂周期影响细胞的增殖与凋亡。探讨PRMT5在胃癌中的表达及对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移能力的影响。方法:采用蛋白质印迹法(Western blot)检测2016年5月-2019年1月在海南省肿瘤医院确诊为胃癌并进行手术治疗的患者的胃癌组织及其癌旁组织(距离癌组织>5 cm)标本(共88例)中的PRMT5的表达,分析PRMT5相对表达量与胃癌临床特征的关系;用PRMT5小干扰RNA(PRMT5-siRNA)和阴性对照(siRNA-NC)转染人胃癌细胞系SGC-7901,以未转染的SGC-7901细胞作为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和Western blot检测转染后细胞中PRMT5 mRNA表达和蛋白水平;采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖;采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞凋亡;采用划痕实验检测细胞迁移能力;采用Transwell细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力;采用Western blot检测cleaved caspase 3、磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)和磷酸化AKT(phosphorylated-AKT,p-AKT)蛋白表达。结果:PRMT5在胃癌组织中的表达高于癌旁组织(P<0.01);PRMT5表达水平与胃癌的病理学分级、分期、淋巴结转移有关(P均<0.05);转染后siRNA-NC组和对照组PRMT5 mRNA和蛋白表达量、胃癌细胞的增殖率、凋亡率、cleaved caspase 3、PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达量、划痕愈合率、细胞侵袭数差异均无统计学意义(P>0.05),转染后siRNA-NC组和对照组PRMT5 mRNA和蛋白表达量、胃癌细胞增殖率、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表达量、划痕愈合率、细胞侵袭数均高于PRMT5-siRNA组,而凋亡率、cleaved caspase 3低于PRMT5-siRNA组(P均<0.05)。结论:PRMT5在胃癌组织中表达明显升高,其表达水平与胃癌的发生、发展、转移恶化密切相关,下调PRMT5的表达可明显减弱胃癌细胞的增殖、迁移能力,同时促进胃癌细胞的凋亡。