间充质干细胞非分化性增殖的研究进展

间充质干细胞系多潜能干细胞,其多向分化能力具有广泛的临床应用前景.非分化性增殖即指在增殖的同时保持其多向分化潜能.目前,间充质干细胞在增殖过程中仍存在增殖潜力和多向分化潜力逐渐丧失的问题,而人血清、生长因子、细胞外基质培养基、生物反应器和中药等逐渐成为此类研究的热点.下面从间充质干细胞非分化性增殖的意义、问题、方法等就间充质干细胞非分化性增殖的研究进展作一综述.     

SD大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养鉴定及骨向诱导分化研究

目的：建立骨髓间充质干细胞（MSCs）体外分离培养体系,并进行骨向分化诱导以探讨大鼠MSCs的体外培养方法及向成骨细胞分化的条件。方法：采用全骨髓贴壁筛选培养法分离成年SD大鼠MSCs,经条件培养液诱导培养后,进行细胞形态学观察、绘制细胞生长曲线、免疫细胞化学检测及碱性磷酸酶活性、钙结节的形成测定。结果：SD大鼠MSCs在体外分离培养扩增形态呈长梭形,细胞生长曲线呈S形。诱导条件下,细胞碱性磷酸酶活性明显增高,并出现了矿化结节。结论：SD大鼠MSCs体外分离培养体系能够成功建立,培养出的细胞能向成骨细胞分化,可以作为骨组织工程的种子细胞。     

绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞的多向分化潜能研究

目的　研究绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外定向诱导下的多向分化潜能。 方法　取6周龄GFP转基因小鼠1只,用密度梯度离心法结合贴壁法体外培养获得GFP转基因小鼠骨髓MSCs有 限细胞系(GFP-MSCs)。取第3代GFP-MSCs进行体外多向分化诱导:成骨诱导后进行碱性磷酸酶增殖活性检测及 茜素红钙盐染色;成脂肪诱导20 d后进行油红O染色鉴定;成神经诱导6 h后用免疫组织化学方法检测神经元烯 醇化酶(NSE)的表达。结果　GFP-MSCs经成骨诱导后ALP表达较对照组明显升高,20 d后茜素红染色可见有橘红 色钙盐沉积;经成脂诱导后油红O染色阳性;经成神经诱导后,细胞形态由梭形转变为星状细胞,NSE染色呈强阳 性表达。结论　GFP转基因小鼠骨髓MSCs在体外诱导下具有多向分化能力,对GFP稳定表达无影响,可以作为研 究MSCs多向分化潜能机制的一个有效示踪工具。     

体外培养骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响因素研究

探讨影响骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的因素。在骨组织工程中，骨髓间充质干细胞的成骨细胞分化率影响着骨量的形成。本文从诱导条件、细胞密度、支架材料、培养环境等方而综述了影响旗向成骨细胞分化的诸多因素，以期为获得更大量的组织工程化骨提供参考依据。     

兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养、鉴定及向成骨细胞分化诱导

目的:探讨体外分离培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法,并观察其向成骨细胞分化的潜能。方法:采用贴壁分离法分离培养兔BMSCs,通过细胞形态学观察和细胞表面抗原检测对细胞进行鉴定,并向成骨细胞分化诱导培养,通过钙钻法检测碱性磷酸酶表达,茜素红染色观察钙结节形成能力。结果:分离培养3d,可见贴壁细胞呈三角形、成纤维形或多角形外观,培养10～12d细胞长满瓶底,传代后细胞增殖明显加快;使用条件培养基传代培养2周,细胞呈集落生长后开始形成钙结节,茜素红染色阳性。结论:全骨髓贴壁法是一种简单实用的分离培养方法,可获得纯度较高的兔BMSCs,经过诱导后可向成骨细胞分化。     

Beagle犬脂肪基质干细胞的培养及分化研究

目的：体外培养Beagle犬脂肪基质干细胞（dog adipose-derived stromal cells，dADSCs），定向诱导分化为脂肪、成骨细胞，为口腔组织工程提供种子细胞。方法：取Beagle犬皮下脂肪组织，剪碎，经Ⅰ型胶原酶消化培养犬脂肪基质干细胞，取第3代细胞鉴定其来源及干细胞标记并向脂肪、成骨细胞诱导分化。结果：该细胞波形丝蛋白表达阳性，角蛋白表达阴性，CD44表达阳性；成脂诱导后，经油红O染色可见细胞内脂滴的积累；成骨诱导后，ALP、钙结节、骨钙素、Ⅰ型胶原均阳性表达。结论：Beagle犬脂肪组织中存在着具有能分化为脂肪、成骨细胞的脂肪基质干细胞，此脂肪基质干细胞可作为口腔组织工程种子细胞来源。     

大鼠骨髓MSCs体外分离培养及多向分化的实验研究

目的：建立骨髓MSCs体外分离培养体系，并进行多向分化诱导，以证实其多向分化潜能，为MSCs进一步的临床应用研究提供实验依据。方法：用密度梯度离心法分离大鼠骨髓MSCs，并对其形态学特征进行观察。用诱导剂对MSCs向成骨细胞、神经元样细胞和成肌细胞进行诱导分化，并进行形态学观察和免疫细胞化学检测。结果：用密度梯度离心法成功分离获得了高纯度的骨髓MSCs，细胞增殖活性强。经骨向诱导后，ALP和矿化结节染色阳性；免疫细胞化学染色提示神经向诱导神经元特异性标志蛋白NSE和NF200，成肌细胞标志蛋白Deamin和Connexin-43阳性表达。结论：采用密度梯度离心法成功建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系；并能够向成骨细胞、神经元样细胞和成肌细胞分化。     

体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经胶质样细胞的实验研究

目的：观察体外以不同方法诱导的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)分化为神经胶质样细胞，探讨MSCs作为组织工程周围神经种子细胞的可行性。方法：以大鼠MSCs为研究对象，分化学诱导组，共培养诱导组，未经诱导的MSCs作为对照组。通过体外动态观察细胞形态，免疫细胞化学，western blot，RT-PCR等手段对各组诱导后的细胞进行鉴定。结果：形态学观察显示两种诱导过程中的部分MSCs细胞都出现明显的神经胶质细胞的形态，共培养诱导组的MSCs在诱导后仍可继续传代培养，对照组细胞形态无变化。细胞免疫组织化学染色，western blot和RT-PCR结果显示两个诱导组细胞都能够表达神经干细胞标志性抗体(Nestin)、神经胶质纤维酸性蛋白抗体(GFAP)和S-100抗体。结论：我们推断MSCs很有可能成为TEPN的理想种子细胞来源。     

Apical bud上皮诱导脂肪间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的研究

目的:通过体外及体内实验探讨大鼠切牙Apical bud上皮细胞诱导大鼠脂肪来源间充质干细胞向成牙本质细胞分化的能力。方法:分离培养大鼠脂肪间充质干细胞、Apical bud上皮细胞,制备Apical bud上皮条件诱导液并体外对ADSCs诱导7d,通过实时定量PCR方法检测成牙本质关键基因DMP-1及DSPP的表达。制备ADSCs及Apical bud上皮重组细胞团进行大鼠肾被膜下移植,8W后取材,分别采用HE染色、Masson三色法和免疫组化方法对移植生成物进行组织学检测。结果:Apical bud上皮诱导ADSCs后DMP-1及DSPP m R NA表达水平显著高于对照组。体内移植8W后H E染色可见管样牙本质和骨样牙本质样结构,Masson三色法可以观察到有绿色的牙本质样结构,免疫组化检测中CK14染色阳性,DSPP染色阳性。结论:Apical bud上皮细胞在体外能够诱导ADSCs向成牙本质细胞分化,且细胞重组在体内可以构建出牙本质样结构。     

不同来源间充质干细胞成骨分化时序性过程的比较研究

目的:比较骨髓间充质干细胞(BMSCs)和脂肪间充质干细胞(ADSCs)成骨分化时序性特点及其潜能的差异. 方法:分离提取同一SD大鼠的BMSCs和ADSCs两种细胞进行培养,通过免疫荧光染色和Von Kossa染色分别观察两种细胞经成骨诱导培养后的成骨分化蛋白I型胶原(Col1α1)的分泌和矿化结节沉积. 利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR) 方法检测两种细胞成骨分化相关基因的表达情况. 结果: 免疫荧光染色结果显示第7 d时ADSCs的Col1α1表达强度较BMSCs弱,但在14 d和21 d时两者差异并不明显.Von Kossa染色显示21 d时两者均呈现出较好的矿化能力. RT-qPCR结果显示ADSCs成骨相关基因表达水平在早中期(7、14 d)低于BMSCs(P <0.05),而在晚期(21、28 d)无显著性差异(P>0.05).结论:ADSCs在早期成骨分化水平低于BMSCs,但在晚期接近BMSCs,显示出良好的成骨分化潜能,在骨组织工程中将有广泛的应用前景.     

牙本质支架体外诱导兔骨髓干细胞分化

目的：探讨将人牙本质作为组织工程支架的可行性,采用不同的方式处理牙本质片,观察牙本质片处理后诱导兔骨髓基质干细胞贴壁附着生长的规律及成骨分化潜能。方法：将兔的骨髓基质干细胞分别接种于经机械去除前期牙本质加EDTA-柠檬酸脱矿处理（A组）,标准根管预备-EDTA处理（B组）的牙本质片上,体外培养1周,扫描电镜观察细胞与牙本质片的附着情况,碱性磷酸酶、茜素红及Vonkossa染色观察兔骨髓基质干细胞成骨分化。结果：兔骨髓基质细胞附着在2种方式处理的牙本质片上生长良好,贴附紧密。B组牙本质片上细胞碱性磷酸酶表达阳性率高达80％,茜素红、Vonkossa染色观察到钙结节数量多于A组。结论：经标准根管预备一EDTA处理的人牙本质能有效促进骨髓基质干细胞增殖及成骨分化,可能成为一种理想的成骨生物支架,并为牙体牙髓疾病的治疗提供了新的思路。广西科学研究与技术开发计划项目（桂科攻1012400lA一42）     

富血小板血浆对人脂肪间充质干细胞增殖及成骨分化能力的影响

目的：探讨富血小板血浆（PRP）对人脂肪间充质干细胞（hADSCs）增殖、分化及成骨能力的影响。方法：脂肪组织体外分离获得hADSCs,2次离心制备PRP,氯化钙加人凝血酶激活PRP。倒置相差显微镜观察成骨诱导实验中PRP对细胞增殖、分化状况的影响,钙-钴法检测PRP作用下hADSCs矿化结节形成,碱性磷酸酶（ALP）检测PRP对细胞活性及分化能力的影响。CCK-8法检测成骨诱导组和非成骨诱导组加PRP培养后2、4、6、8、16d细胞活性变化。结果：成骨诱导实验中50%PRP30μL组细胞密集、数量最多,且有剂量依赖性;钙-钴法检测见PRP原液组细胞染色最深,且有浓度依赖性;碱性磷酸酶显色见PRP原液组细胞活性最强,染色最深。CCK-8检测显示无论有无成骨诱导,各浓度PRP均可促进细胞增殖,且有浓度依赖性。结论：适宜浓度的PRP可明显促进hADSCs增殖,并有浓度及剂量依赖性。     

人牙周膜干细胞的初步鉴定及体外成骨诱导

目的：体外培养、鉴定人牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）并定向诱导分化为成骨细胞,探讨人PDLSCs的多向分化潜能：方法：体外分离、培养人牙周膜细胞,待细胞达一定量后用有限稀释法进行克隆化培养,筛选鉴定牙周膜干细胞（PDLSC）,矿化诱导培养21d后检测钙结节形成情况、ALP活性,免疫细胞化学检测骨涎蛋白（BSP）、Ⅰ型胶原表达,RT—PCR检测ALP、BSP mRNA表达。结果：人PDLSCs体外诱导培养21d后可见钙结节形成,成骨细胞相关蛋白及mRNA均阳性表达。结论：人PDLSCs在体外诱导条件下具有成骨潜能。     

流体剪切力作用下人脂肪基质细胞体外成骨分化的实验研究

目的:分离人体脂肪基质细胞(hADSCs)并研究流体剪切应力对其成骨分化的影响。方法:将脂肪抽吸术获取的人体脂肪进行分离,应用强度为3 dyne/cm²的流体剪切力刺激30 min后观察细胞形态;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖能力, 绘制细胞生长曲线;碱性磷酸酶(ALP)及茜素红染色对其成骨分化进行鉴定。结果:胶原酶消化后的脂肪基质细胞呈梭形, 经流体剪切力作用培养后,细胞体积明显增大,胞浆丰富并含有较多的细胞器,细胞排列方向与加力方向一致, 呈漩涡状生长,生长速度加快。此外,流体剪切力加载后脂肪基质细胞内碱性磷酸酶活性增高,茜素红染色表明聚集的细胞团中心能形成矿化结节。结论:脂肪基质细胞中的成体干细胞经过流体剪切力作用后可向成骨细胞分化并具有明显的成骨表型,可作为骨组织工程的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞成肌诱导分化的实验研究

目的:观察骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)经5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-Aza)诱导的成肌向分化潜能。方法:分离纯化4周龄SD大鼠的MSCs,以5-Aza诱导,通过细胞形态、免疫组织化学染色观察诱导后不同时相点的细胞。结果:经5-Aza诱导后14d,细胞表达结蛋白(desmin)。细胞形态和排列方式发生明显变化,可见有肌管样细胞出现。结论:MSCs经5-Aza诱导后可以向骨骼肌成肌细胞定向分化。     

三七总皂苷对兔BMSCs的成骨分化及TGF-β1表达的影响

目的:观察三七总皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)对兔骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)成骨分化及TGF-β1在基因水平表达变化的影响。方法:体外分离培养兔BMSCs,观察不同浓度PNS(50、100、200 mg/L)对兔BMSCs的影响,采用MTT法检测细胞增殖,茜素红染色观察钙结节形成,qRT-PCR检测TGF-β1表达水平。结果:各浓度PNS培养下的细胞增殖无明显差异(P>0.05);100、200 mg/L PNS组的钙结节数量和TGF-β1的表达水平均高于阴性组(P<0.05)。结论:PNS可促进兔BMSCs的成骨分化并刺激其分泌TGF-β1,但无明显促细胞增殖作用。     

脂肪干细胞在骨组织工程中的研究现状及应用前景

随着骨组织工程研究的不断发展进步,各类种子细胞和支架材料层出不穷,在很大程度上促进了骨组织缺损修复再生技术的成熟。其中,脂肪干细胞凭借其自身的诸多优势,受到越来越广泛的关注,成为骨组织工程研究的热点种子细胞。本文就脂肪干细胞在骨组织工程中的应用作一综述,关注培养模型、支架材料及生长因子等问题,以归纳目前脂肪干细胞在骨组织工程中的研究现状并对其应用前景进行展望。     

釉基质蛋白对大鼠脂肪源性干细胞体外成骨分化能力的实验研究

目的 :通过配制不同浓度的釉基质蛋白(enamel matrix proteins,EMPs)培养液,体外培养SD大鼠脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),初步探究EMPs对ADSCs体外增殖活性及成骨分化能力的影响。方法:酶消化法获得大鼠脂肪间充质细胞,通过流式细胞仪技术分离、筛选干细胞,多向诱导分化对所得细胞进行鉴定;乙酸法制备EMPs干粉并通过蛋白免疫印记技术鉴定其成分,配制不同浓度的诱导液以备用;采用MTT法检测EMPs对ADSCs增殖活性的影响,并用实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹的方法检测EMPs诱导ADSCs成骨分化标志物的m RNA及蛋白表达变化情况。结果 :釉基质蛋白(EMPs)对大鼠脂肪源性干细胞(ADSCs)的增殖具有明显的促进作用(P<0.05),并呈现剂量和时间依赖性;EMPs培养ADSCs 14 d后,成骨分化标志物Runx-2、Osteocalcin(OCN)、Collagen(Col-I)在m RNA和蛋白水平表达均增加,并且与EMPs成正比(P<0.05)。结论 :釉基质蛋白可作为一种成骨诱导剂,能有效增强大鼠脂肪源性干细胞体外增殖活性并诱导其成骨分化。