PI3K/AKT/mTOR/p70S6K通路在人舌鳞癌细胞耐药中的作用

目的:通过抑制舌鳞癌细胞中PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信号通路的表达,检测细胞凋亡与自噬的变化,探讨舌鳞癌耐药的机制。方法:以舌鳞癌细胞Cal27与舌鳞癌耐顺铂细胞Cal27/CDDP为研究对象。分别用PI3K/AKT抑制剂LY294002、mTOR抑制剂Rapamycin、p70S6K抑制剂LY2584702作用该通路各个环节。Western blot检测通路抑制剂作用后相关蛋白的变化。Cyto-ID荧光染色检测自噬体的形成。流式细胞术检测细胞凋亡水平。结果:Western blot结果显示加入抑制剂后舌鳞癌细胞Beclin1表达分别高于对照组,LC3II与LC3I以及Bax与Bcl-2的比值均升高,该通路的p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K等蛋白均有下降(P<0.05)。流式结果显示加入抑制剂后的舌鳞癌细胞凋亡率分别较对照组升高(P<0.05)。Cyto-ID荧光染色后结果显示加入抑制剂后的舌鳞癌细胞自噬小体的数目明显高于对照组(P<0.05)。对比两组细胞显示加入抑制剂后的Cal27细胞发生凋亡与自噬的水平高于Cal27/CDDP(P<0.05)。结论:抑制PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信号通路可诱导舌鳞癌细胞Cal27与舌鳞癌耐顺铂细胞Cal27/CDDP发生凋亡与自噬,激活的PI3K/AKT/mTOR/p70S6K通路抑制细胞凋亡与自噬是Cal27/CDDP细胞产生顺铂耐药的原因之一。     

PI3K/AKT信号通路对体外人牙髓细胞增殖和成牙本质向分化能力的影响

目的 研究PI3K/AKT信号通路对人牙髓细胞（hDPC）体外增殖作用和成牙本质向分化能力的影响.方法 体外培养hDPC,采用PI3K通路抑制剂LY294002（LY）处理hDPC,CCK8法检测细胞增殖情况,Western blot蛋白印记检测PI3K/AKT通路下游蛋白AKT、磷酸化AKT（p-AKT）水平在6、12、24、48、72 h的改变,检测成牙本质向分化指标DSPP的蛋白水平变化;设立空白对照组、矿化诱导组、LY组、矿化诱导＋LY组共4组,成牙本质向矿化诱导14 d,茜素红染色检测矿化结节形成情况.结果 CCK8结果显示,LY294002在24、48和72 h可抑制hDPC的增殖（24 h：Z=-0.358,P＜ 0.05;48 h：t=11.674,P＜ 0.05;72 h：t=10.832,P＜ 0.05）;Western blot显示,LY294002抑制PI3K/AKT通路下游蛋白p-AKT活性,在24 h时作用最明显,成牙本质向分化指标DSPP蛋白水平降低;茜素红染色结果显示,矿化结节的数量B组最多、C组最少.结论 PI3K/AKT信号通路可促进hDPC的增殖和成牙本质向分化能力.     

大鼠牙本质基质蛋白1对人牙髓细胞增殖和ALP活性的影响

目的 :探讨大鼠牙本质基质蛋白 1(DMP1)对体外培养的人牙髓细胞增殖和ALP活性的影响。方法 :利用MTT法研究牙髓细胞的细胞增殖情况 ,碱性磷酸酶检测试剂盒检测牙髓细胞内ALP活性。结果 :DMP1在细胞培养 3d和 5d时 ,5 μg/mL组可促进人牙髓细胞增殖 (P <0 .0 5 )。细胞培养 3d时 ,仅5 μg/mL组可促进人牙髓细胞ALP活性 (P <0 .0 5 ) ;培养 5d时 1μg/mL和 5 μg/mL均可促进人牙髓细胞ALP活性 (P <0 .0 5 ) ;培养 7d时促进作用进一步加强 (P <0 .0 5 )。结论 :DMP1在一定浓度下可促进牙髓细胞的增殖 ;DMP1对牙髓细胞ALP活性的促进作用呈浓度依赖性 ,高浓度DMP1可以促进人牙髓细胞ALP活性 ,随着时间的延长 ,促进ALP活性的作用也增强。     

骨形态发生蛋白7在高糖环境下对成骨细胞分化的影响

目的:研究对于重组人骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein7,BMP7)在持续稳定高糖环境下对成骨细胞生物学性能及成骨活性的影响。方法:细胞取小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14(MC3T3-E1Subclone 14,MC3T3),分为4组:正常生理糖浓度组(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)为对照组,生理糖浓度+BMP7组高糖组(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L,BMP7浓度为100 μg/L)(葡萄糖浓度为25 mmol/L),高糖+BMP7组(葡萄糖浓度为25 mmol/L,BMP7浓度为100 μg/L)。甲基噻唑基四唑(MTT)法检测不同条件培养后1 d、3 d、5 d、7 d后的细胞增殖情况,成骨诱导检测细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性。罗丹明-鬼笔环肽染色后以激光共聚焦显微镜观察MC3T3细胞骨架于BMP7作用24h后的形态变化,荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)检测BMP7作用48 h后成骨基因特异性转录因子2(Runx2),骨钙素(osteocalcin,OCN)、碱性磷酸酶(ALP)的mRNA表达。结果:MTT实验显示25 mmol/L葡萄糖可抑制MC3T3增殖(P<0.05),加入BMP7后可提高细胞增值率(P<0.05)。并可上调高糖导致的ALP活性下降。细胞骨架观察结果显示,对照组细胞骨架成束状铺开,交织成网,较为均匀。高糖组细胞微丝解聚成团状,模糊不清。RT-qPCR结果显示BMP7可促进MC3T3细胞的ALP、OCN及Runx2(P<0.05)的表达。结论:持续稳定高糖环境能够抑制成骨细胞的增殖及ALP活性,影响细胞骨架结构,抑制成骨基因表达,添加BMP7可以在不同程度上反转该趋势,但仍较正常水平低。     

PI3K/Akt信号通路抑制剂在舌鳞癌细胞系增殖和凋亡中的作用

目的:探讨PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002对舌鳞癌细胞系Tca8113增殖和凋亡的影响及其相关机制。方法:LY294002处理Tca8113细胞,MTT法观察对细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot及ELISA分析LY294002作用前后p-Akt及Akt蛋白的表达。结果:随LY294002浓度(0、10、25、50、75μmol/L)的增加及作用时间(24、48 h)的延长,实验组Tca8113细胞的增殖抑制率逐渐增大,LY294002抑制作用与浓度及作用时间呈正相关LY294002干预细胞24 h后,细胞凋亡率显著高于未干预组,p-Akt蛋白表达明显降低,而总Akt表达无显著改变。结论:LY294002可诱导Tca8113细胞凋亡,其作用机制与抑制PI3K/Akt信号通路的效应分子p-Akt的活化有关。     

EMPs对人牙髓干细胞增殖分化影响的实验研究

目的：将人牙髓干细胞（human Dental Pulp Stem Cells,hDPSCs）与釉基质蛋白（Enamel Matrix Proteins,EMPs）按一定浓度结合,测定牙本质涎磷蛋白（dentin sialoprotein,DSPP）、波形蛋白（vimentin）、碱性磷酸酶（alkaline phophatase,ALP）的表达,阐述EMPs对人牙髓干细胞增殖分化的影响.方法：分别将浓度为100 μg/mL、200μg/mL的EMPs加入培养中的人牙髓干细胞中,分别于3d、5d、7d、9d、11d对细胞进行免疫组化染色,检测细胞爬片DSPP、vimentin、ALP的表达.结果：未经EMPs诱导的人牙髓干细胞DSPP少量细胞阳性表达,vimentin表达阴性,ALP表现低活性.经200 μg/mL的EMPs诱导5d后,人牙髓干细胞DSPP、vimentin染色呈阳性表达,ALP活性明显增加.结论：EMPs对人牙髓干细胞增殖及分化具有促进作用,200 μg/mL的浓度效果最为显著.     

脂多糖诱导牙髓细胞DNA双链断裂的研究

目的:探讨低剂量条件下脂多糖诱导牙髓细胞DNA损伤方法,为研究脂多糖诱导牙髓细胞DNA双链断裂及DNA修复提供实验模型。方法:10 μg/L脂多糖连续刺激牙髓细胞1、3、6次后,采取MTT及TUNEL分别检测其对牙髓细胞增殖及凋亡的作用;采用q-PCR及免疫印迹检测γ-H2A.X的mRNA及蛋白水平的表达;使用免疫荧光及免疫组化法观测γ-H2A.X在体内、外牙髓细胞的表达。结果:与对照组相比,10 μg/L脂多糖连续刺激对牙髓细胞增殖及凋亡均无显著性差异;脂多糖连续刺激6次后细胞免疫荧光显示在细胞核检测到γ-H2A.X的阳性表达,且蛋白及mRNA水平的表达较对照组有显著性增加(P<0.05);免疫组化结果表明在脂多糖诱导4、6、8 d后,γ-H2A.X在大鼠牙髓组织较对照组表达水平显著升高(P<0.05)。结论:低剂量脂多糖连续刺激可诱导牙髓细胞产生DNA双链断裂。     

高迁移率族蛋白B1在人牙髓细胞成牙本质分化中的表达

目的:检测人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)诱导矿化过程中高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1,HMGB1)的表达变化,探讨HMGB1在人牙髓细胞损伤修复中的可能作用。方法:组织块法分离培养hDPCs,收集矿化诱导0、3、7、11、14d后hDPCs的mRNA、蛋白质及细胞爬片,实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(western blot)分别检测HMGB1、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein, DSPP)、牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1, DMP1)及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的mRNA及蛋白表达水平;并检测ALP活性,免疫荧光检测HMGB1在hDPCs矿化过程中的表达。结果:hDPCs矿化诱导后,DMP1、DSPP、ALP及HMGB1的mRNA表达显著性上调,DMP1、DSPP和ALP的mRNA以及碱性磷酸酶活性在诱导7 d、11 d和14 d后与对照组间差异有统计学意义(P<0.05),HMGB1mRNA在矿化诱导11d和14d后与对照组的差异具有统计学意义(P<0.05)。蛋白印迹法检测示细胞内各矿化标记的蛋白表达均较对照组上调,而细胞内HMGB1的蛋白表达较对照组下调。免疫荧光结果显示hDPCs矿化过程中,HMGB1逐渐从胞核转移至胞浆。结论:在hDPCs诱导成牙本质细胞分化过程中,HMGB1在mRNA水平上与DMP1、DSPP和ALP的表达变化趋势相似,而细胞内HMGB1蛋白水平表达下调,且HMGB1在hDPCs细胞内出现转位,提示HMGB1与hDPCs的成牙本质分化有关,可能在牙髓细胞损伤修复中发挥作用。     

rhBMP-7对牙髓细胞影响的体内、外研究

目的:观察rhBMP-7对体外培养的人牙髓细胞生物学的影响,及其诱导大鼠牙髓组织异位成骨作用.方法:体外人牙髓细胞连续培养,MTT法、碱性磷酸酶(ATP)检测法比较不同浓度BMP-7对体外人牙髓细胞增殖及ALP活性的影响.将BMP-7处理过的大鼠牙髓组织移植到同种异体大鼠的肾被膜下和头部皮下,分别在术后10、20 d观察移植组织的钙化情况.结果:60μg/L的rhBMP-7可以显著地刺激体外培养的人牙髓细胞增殖,同时提高细胞ALP活性.将用此浓度处理过的大鼠牙髓组织移植后数天,移植组织会在其诱导下产生不同程度的钙化.结论:BMP-7可诱导大鼠牙髓组织异位成骨.     

腺病毒介导的人骨形成蛋白7基因转染对人牙髓细胞增殖与分化作用的研究

目的探讨腺病毒介导的人骨形成蛋白7(Ad-hBMP-7)转染对体外培养的人牙髓细胞增殖及向成牙本质细胞分化的作用。方法人胚肾293细胞扩增复制缺陷型重组腺病毒,选用细胞半数感染剂量法测定病毒滴度。体外培养人牙髓细胞,荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪检测病毒的转染率。将 Ad-hBMP-7感染人牙髓细胞,Western blot 检测蛋白表达情况,噻唑蓝比色法(MTT)、酶动力学法、von Kossa 染色及半定量逆转录聚合酶链分别检测转基因细胞的增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性、钙化结节的形成和牙本质涎磷蛋白(DSPP)mRNA 的表达。结果病毒滴度为1.785×10~(12)pfu/L;人牙髓细胞受 Ad-hBMP-7感染48 h 后即可检测到外源蛋白表达;当感染复数为75时,重组腺病毒对牙髓细胞的转染率达(91.1±1.0)%;与空载体组及未转染细胞组相比,细胞的增殖特性无明显改变;ALP 活性高于对照组(P<0.05);能够形成矿化结节;DSPP mRNA 的表达呈剂量和时间依赖性。结论 Ad-hBMP-7可促进体外培养的人牙髓细胞向成牙本质细胞分化,但对细胞的增殖无明显改变。     

IGF-1对小鼠牙囊细胞生物学特性的影响

目的:探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对小鼠牙囊细胞增殖、蛋白含量及分化能力影响。方法:将第3代小鼠牙囊细胞与不同浓度IGF-1(0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 mg/L)共孵育后,测定IGF-1对细胞增殖、碱性磷酸酶活性、总蛋白含量的影响;并用Von Kossa法检测0.05和0.1 mg/L的IGF-1对牙囊细胞矿化结节形成能力的影响。结果:在0.05~0.1 mg/L的浓度范围内,IGF-1能显著促进牙囊细胞的增殖,使ALP活性及总蛋白含量增加(P<0.01),但三者的最佳效应浓度有所差异,当浓度升高至0.5 mg/L时,促进效应下降,与对照组无显著性差异(P>0.05);0.05和0.1 mg/L的IGF-1均能显著促进牙囊细胞矿化结节的形成(P<0.05,与对照组相比)。结论:合适浓度的IGF-1能促进牙囊细胞的增殖,增加蛋白含量及向成骨细胞(成牙骨质细胞)方向分化的能力。     

促红细胞生成素对人牙髓细胞增殖和成骨分化的影响

目的：探讨促红细胞生成素（EPO）对体外培养的人牙髓细胞（hDPCs）增殖和成骨分化的影响。方法：体外培养鉴定人牙髓细胞。使用 EPO 对在成骨诱导培养基中培养的牙髓细胞进行刺激,CCK-8检测 EPO 对牙髓细胞增殖的影响;20 U ／ml EPO 培养 hDPCs 7 d 和14 d,采用碱性磷酸酶活性（ALP）检测和茜素红染色观察 EPO 对牙髓细胞矿化的影响;利用 Real-time PCR 检测加入 EPO 后牙髓细胞成牙本质向分化相关基因的表达情况。结果：EPO 以时间和剂量依赖性方式促进牙髓细胞的增殖;20 U ／ml 的 EPO 后作用,牙髓细胞碱性磷酸酶活性显著提高（P ＜0．05）,钙结节形成明显增多;成牙本质向分化相关基因 DSPP、OCN、OSTERIX、RUNX2的表达明显上调（P ＜0．05）。结论：EPO 能促进人牙髓细胞的增殖和分化。     

Adenovirus-mediated recombinant human bone morphogenetic protein-7 expression promotes differentiation of human dental pulp cells

Recombinant human bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) has been shown to stimulate new reparative dentin formation in animal models. However, little is known about whether BMP-7 could promote the odontoblast-like differentiation and the formation of mineralized nodules in human dental pulp cells. Here, we reported that the infection with adenovirus-BMP-7 (Ad-BMP-7), a BMP-7-expressing adenoviral vector, induced the expression of BMP-7 in primarily cultured human dental pulp cells in the long term with little effect on their proliferation and viability. Importantly, BMP-7 expression significantly increased alkaline phosphatase activity and induced the dentin sialophosphoprotein expression in a dose- and time-dependent manner, suggesting that BMP-7 promoted the odontoblast differentiation. Furthermore, BMP-7 expression stimulated the formation of many mineralized dentin-like calcified nodules. Our data suggest that Ad-BMP-7-mediated BMP-7 expression can promote the differentiation of human pulp cells into odontoblast-like cells and mineralization in vitro, which may provide insight for the design of new gene therapy for the pulp capping in the clinic.     

SOX2通过PI3K/AKT通路调控口腔鳞癌细胞迁徙的机制研究

目的:研究过表达SOX2通过PI3K/AKT通路促进口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)细胞迁移及上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)的作用及机制.方法:收集OSCC组织及正常口腔黏膜组织,培养OSCC细胞株Tca83、SC...     

Insulin-like growth factor 1 promotes the proliferation and committed differentiation of human dental pulp stem cells through MAPK pathways

ObjectivesInsulin-like growth factor 1 (IGF-1) is a broad-spectrum growth-promoting factor that plays a key role in natural tooth development. Human dental pulp stem cells (hDPSCs) are multipotent and can influence the reparative regeneration of dental pulp and dentin. This study was designed to evaluate the effects of IGF-1 on the proliferation and differentiation of human dental pulp stem cells.MethodsHDPSCs were isolated and purified from human dental pulps. The proliferation and osteo/odontogenic differentiation of hDPSCs treated with 100 ng/ml exogenous IGF-1 were subsequently investigated.ResultsMTT assays revealed that IGF-1 enhanced the proliferation of hDPSCs. ALP activity in IGF-1-treated group was obviously enhanced compared to the control group from days 3 to 9. Alizarin red staining revealed that the IGF-1-treated cells contained a greater number of mineralization nodules and had higher calcium concentrations. Moreover, western blot and qRT-PCR analyses demonstrated that the expression levels of several osteogenic genes (e.g., RUNX2, OSX, and OCN) and an odontoblast-specific marker (DSPP) were significantly up-regulated in IGF-1-treated hDPSCs as compared with untreated cells (P < 0.01). Interestingly, the expression of phospho-ERK and phospho-p38 were also up-regulated, indicating that the MAPK signaling pathway is activated during the differentiation of hDPSCs.ConclusionsIGF-1 can promote the proliferation and osteo/odontogenic differentiation of hDPSCs by activating MAPK pathways.     

1,25-(OH)2 Vit D3对小鼠牙囊细胞分化的影响

目的:探讨1,25-(OH)2V it D3对小鼠牙囊细胞向成骨细胞(成牙骨质细胞)分化能力的影响。方法:第3代小鼠牙囊细胞与10-8mol/L的1,25-(OH)2V it D3共孵育3、5、7、9 d后,测定其对牙囊细胞增殖、碱性磷酸酶(alkaline phosphotase,ALP)活性、蛋白含量及骨钙素(osteocalc in,OC)表达的影响。结果:在5~7 d的时间范围内,1,25-(OH)2V it D3能显著促进牙囊细胞的增殖(P<0.05),在5~9 d内能提高ALP活性(P<0.01),增加OC阳性细胞率(P<0.05),但在9 d时能使总蛋白含量下降(P<0.05)。结论:1,25-(OH)2V it D3能促进牙囊细胞的增殖及向成骨细胞方向分化,但对蛋白合成有抑制作用。