靶向人CD106基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的：：构建人CD106基因RNAi慢病毒载体。方法：设计4条靶向CD106的RNA干扰靶点序列(Target 1、2、3、4),合成短发卡结构shRNA并退火成双链DNA,与慢病毒载体重组形成siRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定验证获得连接正确的克隆。经由293T细胞包装siRNA慢病毒颗粒,随后将其感染人口腔鳞癌HN12细胞,分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率。结果：构建的慢病毒载体的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度至少达到1×109 TU/ ml。siRNA慢病毒感染人HN12细胞,经Real-time PCR和Western blot检测目的基因CD106的mRNA和蛋白表达较阴性对照载体慢病毒感染组明显下降。结论：成功构建了人靶向CD106RNAi慢病毒载体,并能够在细胞水平上有效沉默靶基因。     

Naa10p 表达对舌鳞癌 Tca8113细胞平阳霉素敏感性的影响

目的：观察 N-α乙酰基转移酶（Naa10p）表达对舌鳞癌 Tca8113细胞平阳霉素（PYM）敏感性的影响。方法：采用慢病毒体系分别构建干扰及过表达 Naa10p 的 Tca8113细胞株,并设立相应的对照细胞 Tca8113-LV-NC,鉴定干扰和过表达效率,MTS 法检测药物处理后各处理组细胞对 PYM的敏感性。结果：干扰 Naa10p 的 Tca8113-LV-shNaa10p 细胞、过表达Naa10p 的 Tca8113-LV-Naa10p 细胞与对照细胞 Tca8113-LV-NC 对平阳霉素的半数抑制浓度（IC50）分别为（20．772±0．106）μg／ml、（2．157±0．123）μg／ml、（6．301±0．069）μg／ml（组间比较,P ＜0．05）。结论：下调 Naa10p 表达可降低口腔鳞癌细胞 Tca8113对平阳霉素的敏感性,上调 Naa10p 表达可增强口腔鳞癌细胞 Tca8113对平阳霉素的敏感性。     

N-乙酰基转移酶10蛋白和朊蛋白在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及相关性研究

目的:检测N-乙酰基转移酶10蛋白(Naa10p)和朊蛋白(PrPc)在口腔鳞状细胞癌(OSCC) 、白斑、口腔正常黏膜中的表达及临床意义。方法:应用免疫组化EnvisionTM法检测OSCC(112例)、白斑(42例)及正常黏膜组织(11例)中Naa10p和PrPc的表达情况,并分析其与临床病理特征相关性。结果:Naa10p和PrPc在OSCC表达最高,白斑次之,正常黏膜组织中表达最低。Naa10p在3种不同组织中的表达两两比较均有显著统计学差异(P<0.05),PrPc分别在白斑和OSCC组织,正常口腔黏膜与OSCC组织中的表达有统计学差异(P<0.05)。Naa10p的表达水平与OSCC的TNM分期、淋巴结转移、组织学分化程度密切相关(P<0.05),与性别、年龄无关。PrPc表达仅与组织学分化程度密切相关(P<0.05)。PrPc在OSCC中的表达强度随组织学分化程度下降而明显升高(P<0.05),而Naa10p的表达强度随组织学分化程度下降而明显下降(P<0.05)。结论:Naa10p和PrPc与OSCC的发生和转移相关。     

蛋白激酶D1在调节口腔鳞癌细胞增殖、凋亡及药物敏感性中的作用

目的 探讨蛋白激酶D1（PKD1）在人口腔鳞癌细胞SCC-25生长、凋亡及化疗药物敏感性中的作用和机制。方法 转染control-shRNA和PKD1-shRNA质粒,建立PKD1基因沉默的SCC-25细胞系;CCK-8及流式细胞术检测PKD1基因沉默后细胞的增殖、凋亡及细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性;Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及多药耐药蛋白P-gp的表达变化。结果 PKD1在口腔肿瘤细胞SCC-25、CAL-27、SACC-83中呈现高表达;PKD1基因沉默后SCC-25细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著降低,细胞生长受到抑制,凋亡增加;多药耐药蛋白P-gp表达下调,紫杉醇半数抑制浓度及耐药指数明显降低。结论 PKD1通过调控SCC-25细胞内凋亡相关蛋白表达和多药耐药蛋白P-gp表达,调控SCC-25生长、凋亡和对药物敏感性,是口腔鳞癌细胞生物治疗潜在靶点。     

KLF4对口腔鳞癌细胞增殖的抑制作用

目的 探讨KLF4对人口腔鳞癌细胞CAL27的增殖抑制作用.方法 构建KLF4慢病毒表达载体,并转染人口腔鳞癌细胞系CAL27,转染不含KLF4开放读码框的慢病毒载体LV105作为对照.采用RT-PCR、免疫细胞化学法对KLF4表达进行鉴定.MTT实验、流式细胞术检测KLF4对口腔鳞癌细胞系CAL27的增殖抑制作用.结果 RT-PCR、免疫细胞化学实验均表明实验组细胞KLF4的表达明显高于对照组(P＜0.01).MTT实验结果表明与对照组CAL27/LV105组相比,CAL27/KLF4能够抑制细胞的增殖能力(P＜0.01).CAL27/KLF4主要通过使细胞周期中的G2/M期阻滞来抑制CAL27细胞的增殖(P＜0.01).结论 KLF4转染能够抑制口腔鳞癌细胞系CAL27的增殖能力,可能在口腔鳞状细胞癌中作为抑癌基因发挥作用.     

三氧化二砷对口腔鳞癌细胞系Nrf2通路的激活作用

目的探讨三氧化二砷(AS2O3)对人口腔鳞癌细胞系SCC-15中氧化应激Nrf2通路的作用。方法通过体外培养人口腔鳞癌细胞系SCC-15,采用细胞免疫荧光法检测不同浓度AS2O3对SCC-15中Nrf2及其下游基因Ⅱ相抗氧化酶—血红素氧合酶1(HO-1)和醌氧化还原酶(NQO1)表达水平的影响,计数平均光密度值。同时采用蛋白免疫印迹方法定量检测不同浓度AS2O3对SCC-15中Nrf2及其下游Ⅱ相抗氧化酶—血红素氧合酶1和醌氧化还原酶表达水平的影响。结果不同浓度的AS2O3对Nrf2、血红素氧合酶1和醌氧化还原酶均有一定的激活作用,并呈剂量依赖关系。结论 AS2O3可激活口腔鳞癌细胞系SCC-15的Nrf2信号通路,具有促进抗氧化基因表达的作用。     

EMP1基因对口腔鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭影响的体外研究

目的:体外观察EMP1基因对口腔鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:构建pEGFP-N1-EMP1表达载体,稳定转染口腔鳞癌细胞系Tb3.1,并以野生型Tb3.1和pEGFP-N1稳转的Tb3.1为对照,用MTT检测细胞增殖,绘制细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞周期变化;用Transwell小室检测细胞的迁移和侵袭能力;组间比较采用单因素方差分析。结果:相比野生型Tb3.1和Tb3.1-pEGFP-N1细胞,Tb3.1-pEGFP-N1-EMP1细胞生长受到抑制,同时其S+G2-M期细胞比例减少(P＜0.05),迁移和侵袭细胞数目减少(P＜0.05)。结论:EMP1在口腔鳞癌的发生、发展中作为抑癌基因可能对口腔鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭起抑制作用。     

人Notch-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建及鉴定人Notch-1基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,寻找最佳RNAi慢病毒载体。方法 针对人Notch-1基因序列,按照RNAi序列设计原则,设计3段RNAi靶点序列（shRNA1~3）,通过限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接,将Notch-1基因序列插入慢病毒载体pLenOR-THM,构建pLenOR-THM-Notch-1重组载体。质粒转化感受态DH5α细菌,筛选阳性克隆,经KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒四质粒系统共转染293T细胞,进行慢病毒包装并测定病毒滴度,观察感染效率。各组病毒载体转染ACC-M细胞后,运用定量逆转录聚合酶链反应和Western blot检测Notch-1基因mRNA和蛋白的表达水平。结果 成功构建慢病毒载体pLenOR-THM-Notch-1,四质粒共转染293T细胞后可见大量绿色荧光;浓缩后的病毒滴度为5.8×108 TU·mL-1;以复感染系数为1时感染293T细胞,感染效率在90％以上。QRT-PCR和Western blot检测结果表明,pLenOR-Notch-1-shRNA3组受抑制程度最高。结论 成功构建了人Notch-1 RNAi慢病毒载体。     

人舌鳞癌细胞SOCS1基因沉默对细胞增殖和化疗药物敏感性的影响

目的:在人舌鳞癌细胞中观察细胞因子信号转导抑制因子1(SOCS1)沉默对细胞增殖及化疗药物敏感性的影响,探讨SOCS1作为舌鳞癌治疗靶点的研究。方法:western blot、PCR及定量PCR验证SOCS1干扰序列沉默人舌鳞癌细胞系CAL27中SOCS1的表达; MTT法检测舌鳞癌细胞对化疗药物敏感性的变化;细胞计数的方法观察细胞的增殖速度;采用流式细胞术的方法检测细胞周期的变化。结果:将SOCS1干扰序列转染CAL27细胞后,SOCS1 mRNA及蛋白表达水平均明显下降。沉默SOCS1表达后,化疗药物卡铂和紫杉醇对CAL27细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)均显著降低(P<0.01);转染72 h后CAL27细胞数量较对照组显著减少(P<0.05);SOCS1表达抑制后CAL27细胞G0/G1期细胞比例明显升高,而S期和G2/M期细胞比例明显减小,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:SOCS1表达抑制后,人舌鳞癌细胞株CAL27的增殖能力下降,并且对化疗药物的敏感性增强。     

IL-24可能通过CXCL12/CXCR4信号轴抑制口腔鳞癌细胞迁移及侵袭能力

目的:探讨慢病毒介导IL-24基因转染口腔鳞癌细胞对细胞迁移和侵袭能力的影响及对CXCL12/CXCR4信号轴的影响。方法:培养OSCC细胞株,分为联合处理组、IL-24转染组、抑制剂组和空白对照组。转染后培养48 h,ELISA法检测各组细胞液中IL-24表达,检测不同处理组细胞细胞凋亡、迁移和侵袭能力,实时荧光定量PCR和Western blot法检测细胞中IL-24、CXCL12和CXCR4基因和蛋白表达。结果:联合处理组和IL-24转染组细胞上清液中IL-24水平均显著高于抑制剂组和空白对照组(P<0.05);联合处理组迁移数和侵袭数均低于IL-24转染组、抑制剂组和空白对照组,且IL-24转染组和抑制剂组均低于空白对照组(P<0.05);联合处理组和IL-24转染组细胞中IL-24 基因和蛋白表达量均高于抑制剂组和空白对照组(P<0.05),联合处理组和IL-24转染组细胞中CXCL12和CXCR4 基因和蛋白表达量均低于抑制剂组和空白对照组(P<0.05)。结论:上调IL-24可有效抑制OSCC细胞迁移及侵袭,可能与特异性抑制CXCL12/CXCR4信号通路有关。     

小分子RNA干扰沉默Tiam1基因对舌鳞状细胞癌细胞生物学特性的影响

目的:探讨小分子RNA干扰(siRNA)沉默Tiam1基因对舌鳞状细胞癌细胞生物学特性的影响。方法:培养人舌癌细胞SCC-4,随机分为siRNA-Tiam1组、siRNA-对照序列组和空白对照组,利用实时荧光定量PCR技术和Western blot法检测不同转染组细胞中Tiam1基因和蛋白表达,MTT法检测不同转染组细胞增殖情况,利用流式细胞术检测不同转染组细胞凋亡情况,Transwell法检测不同转染组细胞迁移和侵袭能力。结果:siRNA-Tiam1组细胞中Tiam1基因和蛋白相对表达量均低于siRNA-对照序列组和空白对照组(P<0.05);MTT实验结果显示,与siRNA-对照序列组和空白对照组相比,siRNA-Tiam1组细胞24 h、48 h、72 h和96 h时A值均降低(P<0.05);流式细胞检测结果显示,siRNA-Tiam1组细胞凋亡率显著高于siRNA-对照序列组和空白对照组(P<0.05);siRNA-Tiam1组迁移细胞数和侵袭细胞数均低于siRNA-对照序列组和空白对照组(P<0.05)。结论:特异性沉默Tiam1基因可有效抑制舌鳞状细胞癌细胞增殖能力,加速细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭能力。     

TRAF6沉默对LPS刺激牙周膜成纤维细胞增殖能力的影响

目的:使用小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)沉默人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament cell, hPDLC) 肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6,TRAF6)的基因,观察细胞的增殖情况及脂多糖刺激时增殖能力的变化。方法:酶消化联合组织块法体外培养原代hPDLC,并进行免疫组化鉴定,将细胞分为TRAF6 siRNA组、control siRNA组、NONE组,脂质体法将TRAF6 siRNA、control siRNA分别转染入对应组中,NONE组只加入等量的转染试剂,再使用10 mg/L LPS刺激细胞,RT-PCR检测TRAF6mRNA的表达情况,CCK-8检测沉默前后及LPS刺激时细胞增殖能力的改变。结果:免疫组化鉴定hPDLC培养成功;TRAF6 siRNA组的TRAF6 mRNA的表达水平与NONE、control siRNA组相比显著下降(P<0.001);TRAF6 siRNA组在转染后36、48、72 h的A值均显著低于相同时间点的2个对照组(P<0.001);使用10 mg/L LPS刺激各组细胞24、48 h时,TRAF6 siRNA组细胞的A值显著低于相同时间点的2个对照组(P<0.001)。结论:沉默TRAF6基因能抑制LPS刺激时hPDLC的增殖,推测TRAF6可能影响牙周炎的发生发展进程,是牙周炎潜在的治疗靶点。     

体外沉默法尼基转移酶对舌鳞状细胞癌迁移和侵袭的影响

目的 通过RNA干扰沉默法尼基转移酶（FTase）,探讨沉默FTase对舌鳞状细胞癌迁移和侵袭的影响及其相关机制。方法 针对FTase设计并构建3条小干扰RNA（siRNA）,转染人舌鳞状细胞癌CAL27和SCC-4细胞（实验组）,同时设置阴性对照组（转染NC-siRNA）和空白对照组（不转染siRNA）。应用实时荧光定量PCR检测各组细胞FTase、HRAS的mRNA表达,根据FTase mRNA的表达量,选取沉默效率最高的FTase-siRNA转染组作为进一步研究的实验组。蛋白质免疫印迹法检测各组细胞FTase、HRAS、p65、p-p65(S536)、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、低氧诱导因子1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）的蛋白表达,Transwell侵袭实验和细胞划痕实验检测各组细胞的侵袭和迁移能力。结果 与阴性对照组和空白对照组相比,实验组FTase的mRNA和蛋白表达下降（P<0.05）,HRAS的mRNA和蛋白表达无明显变化（P>0.05）,p-p65(S536)、MMP-9、HIF-1α、VEGF蛋白表达下降（P<0.05）,p65蛋白表达无明显变化（P>0.05）;实验组的细胞侵袭和迁移能力降低（P<0.05）。结论 体外沉默舌鳞状细胞癌细胞FTase,可以抑制细胞体外迁移和侵袭能力,为FTase可能作为舌癌治疗的分子靶点提供了一定的理论和实验依据。     

疲劳循环对复合树脂微渗漏影响的体外研究

目的:通过体外加载实验观察复合树脂边缘微渗漏变化情况,分析洞缘斜面的必要性。方法:将140颗离体牙按是否制备洞缘斜面、不同疲劳循环加载次数及位点随机分为14小组。所有样本采用复合树脂(3M P60)充填,包埋后经不同疲劳循环次数(0、1×10⁵、1.3×10⁶次)或加载位点(颊尖、颊界面、修复体)进行加载试验,检测修复体界面染料渗透深度。结果:1.3×10⁶次组微渗漏大于1×10⁵次及0次组。0次加载时,不同洞缘组间差异不显著;加载1×10⁵次后,牙体受力时洞缘斜面组的微渗漏比无洞缘斜面组小(P<0.05);加载1.3×10⁶次后,洞缘斜面组微渗漏小于无洞缘斜面组(P<0.05)。结论:体外疲劳循环(模拟咀嚼半年)后,洞缘斜面有利于减少复合树脂的微渗漏。     

体外沉默Rce1对舌鳞状细胞癌细胞侵袭和迁移能力的影响

目的 通过RNA干扰技术沉默Rce1基因,探讨Rce1对舌癌细胞侵袭和迁移能力的影响。方法 体外培养舌鳞状细胞癌Cal-27和SCC-4细胞,设计合成Rce1基因的小干扰RNA（siRNA）,采用脂质体载体瞬时转染沉默Rce1基因。根据转染的siRNA不同,将实验组分为Rce1-siRNA-1组、Rce1-siRNA-2组、Rce1-siRNA-3组,脂质体载体分别转染相对应序列的siRNA。脂质体转染siCON作为阴性对照组,不转染siRNA作为空白对照组。采用实时定量聚合酶链反应检测各组Rce1、RhoA以及K-Ras基因的表达,蛋白质印迹法（Western blot）检测Rce1、RhoA、K-Ras、金属基质蛋白酶（MMP）-2及MMP-9的表达,采用体外侵袭实验检测Cal-27和SCC-4的侵袭能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果 实时定量聚合酶链反应及Western blot检测结果显示,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组的Rce1基因及蛋白表达均下调（P<0.05）,RhoA、K-Ras基因及蛋白表达无统计学差异（P>0.05）,MMP-2、MMP-9表达下降（P<0.05）。体外侵袭实验表明,与对照组相比,实验组在聚碳酯膜上的细胞总数明显减少（P<0.05）。细胞划痕实验表明,实验组划痕处细胞闭合时间明显长于对照组（P<0.05）。结论 体外沉默Rce1可以有效下调其在舌癌细胞Cal-27和SCC-4中的表达水平,降低迁移和侵袭能力。     

4-1BB、CD8在口腔扁平苔藓组织中的表达研究

目的 检测共刺激信号4-1BB及CD8在口腔扁平苔藓(oral lichen planus,OLP)组织中的表达,探讨OLP病损中4-1BB介导CD8⁺ T细胞免疫应答的潜在机制。方法 选取31例OLP患者(糜烂型15例、非糜烂型16例),15例健康成人(对照组)为研究对象,收集其临床及病理资料,采用免疫组织化学法检测局部组织中4-1BB、CD8的表达情况。结果 OLP患者局部组织中4-1BB及CD8的表达高于对照组(P<0.05),且两者表达呈正相关(r=0.389,P<0.05),糜烂型OLP患者中CD8、4-1BB表达高于非糜烂型(P<0.05)。在OLP不同的临床亚组中,VAS评分、REU评分及基底细胞损伤程度均表现出差异(P<0.05)。Spearman相关性分析结果显示,CD8与基底细胞损伤程度呈正比(P<0.05),CD8、4-1BB分别与VAS评分、REU评分存在正相关性(P<0.05)。结论 OLP患者局部组织中4-1BB表达升高,其与疾病活动进展程度呈正相关,4-1BB可能通过调控CD8⁺ T细胞参与OLP的发生发展。     

Mechanism of long-chain noncoding RNA PCGEM1 in the regulation of the invasion and metastasis of oral squamous carcinoma cells via transforming growth factor β2/Smad2 signaling pathway

目的 探讨长链非编码RNA（lncRNA）PCGEM1通过转化生长因子β2（TGF β2）/Smad2信号通路调控口腔鳞状细胞癌（OSCC）侵袭和转移的机制。方法 将60例OSCC患者癌组织及距离癌组织超过2 cm处的正常组织纳入研究,实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-148a、lncRNA PCGEM1在OSCC组织及正常组织、人正常口腔黏膜上皮细胞（OMEC）及人源OSCC细胞株KB、BcaCD885、SCC-4、CAL27、SCC-15中的表达情况;分析lncRNA PCGEM1和miR-148a表达与患者临床病理信息之间的关系。构建lncRNA PCGEM1沉默细胞系KB-siPCGEM1及阴性对照（KB-NC）,并以KB作为空白对照组,采用MTT、Transwell和划痕实验检测lncRNA PCGEM1对KB细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;使用生物信息学网站starBase预测lncRNA PCGEM1可以互补结合的微小RNA（miRNA）,再根据www.microRNA.org网站预测相应miRNA可靶向结合的基因;免疫印迹（Western blotting）检测TGF β2/Smad2信号通路蛋白表达情况。结果 qRT-PCR结果显示,OSCC组织中lncRNA PCGEM1、miR-148a的表达水平高于正常组织（P<0.05）;lncRNA PCGEM1和miR-148a在不同TNM分期、淋巴结转移和组织分化程度的患者癌组织中表达差异均有统计学意义（P<0.05）;与空白对照组和KB-NC组相比,KB-siPCGEM1组细胞OD_{492 nm}值下降,细胞侵袭数量及迁移率降低,差异均具有统计学意义（P<0.05）;生物信息学预测结果显示,lncRNA PCGEM1可与miR-148a互补结合,miR-148a与TGFβ2存在靶向结合位点;qRT-PCR和Western blotting检测结果显示,KB-siPCGEM1组中miR148a、TGFβ2及p-Smad 2的表达明显低于空白对照组与KB-NC组（P<0.05）,空白对照组和KB-NC组的差异无统计学意义（P>0.05）。结论 lncRNA PCGEM1在OSCC中高表达,高表达lncRNA PCGEM1可能通过上调miR-148a水平,强化TGF β2/Smad2信号通路,从而促进OSCC的进展。