LINC00963靶向miR-525-5p调控LPS诱导的牙周膜细胞损伤的机制研究

目的:探讨长链非编码RNA LINC00963是否通过靶向miR-525-5p调控LPS诱导的牙周膜细胞损伤。方法:分离培养牙周膜细胞,分别转染si-LINC00963、miR-525-5p和anti-miR-525-5p,用LPS处理形成炎性损伤细胞模型。采用RT-qPCR、ELISA、流式细胞术、Western blot检测牙周膜细胞中LINC00963、miR-525-5p表达、炎症因子TNF-α、IL-1β水平、细胞凋亡率。双荧光素酶报告实验分析LINC00963对miR-525-5p的靶向调控。结果:转染si-LINC00963或miR-525-5p过表达降低了LPS诱导的牙周膜细胞中TNF-α、IL-1β水平、凋亡率、Bax蛋白水平,提高了Bcl-2蛋白水平(P<0.05)。LINC00963靶向调控miR-525-5p的表达。下调miR-525-5p表达逆转了si-LINC00963表达对LPS诱导的牙周膜细胞损伤的作用。结论：干扰LINC00963通过靶向miR-525-5p,抑制LPS诱导的牙周膜细胞凋亡和炎症因子表达。     

微小RNA-30a靶向Beclin1抑制舌鳞状细胞癌细胞自噬活性的研究

目的研究微小RNA(mi RNA)-30a转染对舌鳞状细胞癌细胞自噬相关基因Beclin1表达及其自噬活性的影响,探讨舌鳞状细胞癌细胞自噬活性调控的相关机制。方法利用脂质体转染技术,将内源性mi RNA-30a模拟物和抑制物分别转染至舌鳞状细胞癌UM1、UM2和SCC25细胞。实验设mi RNA-30a mimic组、mi RNA-30a inhibitor组和对照组;通过实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测转染前后Beclin1基因m RNA表达变化,通过Western blot检测Beclin1、LC3的蛋白表达变化。结果在mi RNA-30a mimic组中,Beclin1和自噬标记蛋白LC3-Ⅱ表达量与对照组相比均明显下降(P<0.05);在mi RNA-30a inhibitor组中,Beclin1和LC3-Ⅱ表达量较对照组均明显上升(P<0.05)。结论 mi RNA-30a负调控Beclin1表达,并抑制舌鳞状细胞癌细胞的自噬水平。     

煅烧牙粉影响人牙周膜干细胞体外矿化的自噬机制研究

目的 探讨自噬在煅烧牙粉调节牙周膜干细胞体外矿化中的作用,为牙周膜干细胞的定向诱导分化和牙周病的治疗提供参考。方法 选用成人完整的牙齿在300 ℃的条件下煅烧后,研磨成粉,与α-MEM混合制备成20 μg/mL牙粉条件培养基,与人牙周膜干细胞共培养。采用流式细胞技术检测其对牙周膜干细胞凋亡的影响,通过Western blot检测、免疫荧光染色、茜素红染色和ALP染色观察检测其对牙周膜干细胞自噬活性及体外矿化的影响。结果 流式细胞技术结果显示牙粉对牙周膜干细胞的凋亡无明显影响（P＞0.05）;Western blot结果显示煅烧牙粉显著上调人牙周膜干细胞的自噬相关蛋白Beclin1,ATG5的表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值,以及明显下调了P62的蛋白水平（P<0.05）;免疫荧光染色显示牙粉促进人牙周膜干细胞中LC3在胞质内点状聚集;茜素红染色显示牙粉促进牙周膜干细胞的体外矿化;ALP染色显示自噬活性抑制剂氯喹降低牙粉对牙周膜干细胞体外矿化的促进作用。结论 煅烧牙粉通过激活自噬调节牙周膜干细胞的体外矿化作用。     

miR-124抑制口腔鳞状细胞癌CAL27细胞的增殖活性及其对EZH2的靶向调控

目的:探讨miR-124对口腔鳞状细胞癌CAL27细胞增殖活性的影响以及其与EZH2的靶向关系。方法:构建pre-miR-124、野生型EZH2(EZH2-WT)和突变型EZH2(EZH2-MT)真核表达载体,采用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测pre-miR-124的转染效率,MTT法检测miR-124过表达对CAL27细胞增殖活性的影响;另外,利用双荧光素酶报告基因系统、qRT-PCR和Western blot验证miR-124与EZH2的靶向关系。结果:采用NCBI BLAST软件比对载体测序,结果显示pcDNATM6.2-GW-pre-miR-124、pmirGLO- EZH2-WT和pmirGLO- EZH2-MT表达载体构建成功,qRT-PCR显示转染pre-miR-124后CAL27细胞内miR-124的表达水平显著升高(P＜0.001)。MTT分析结果显示miR-124过表达能够明显抑制CAL27细胞的增殖活性(P＜0.05),双光素酶报告基因显示共转染pre-miR-124和EZH2-WT的CAL27细胞荧光活性显著下降(P＜0.001),且qRT-PCR的结果也显示转染pre-miR-124的CAL27细胞内EZH2的表达水平明显低于对照组(P＜0.001),Western blot显示miR-124的过表达能够显著抑制EZH2蛋白水平的表达。结论:miR-124的过表达能够显著抑制口腔鳞状细胞癌CAL27细胞的增殖,并且与EZH2之间存在具有良好的靶向关系。     

雷帕霉素诱导自噬抑制舌鳞癌细胞增殖和迁移

目的探讨自噬诱导对舌鳞癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法应用雷帕霉素(Rap)诱导上调舌鳞癌Tca8113细胞自噬活性,Western blot检测诱导后Tca8113细胞自噬标记蛋白Beclin1和LC3的表达变化;MTT法检测自噬诱导对细胞增殖的影响;Wound-healing检测诱导后细胞迁移能力改变;SPSS 19.0统计软件进行数据分析。结果 Rap诱导6h即可上调舌鳞癌Tca8113细胞自噬标记蛋白LC3-Ⅱ表达,24h时LC3-Ⅱ表达最强,自噬活性最高(P<0.05)。与对照组相比,Rap诱导后细胞生长明显抑制(P<0.05),迁移速率减慢。结论上调舌鳞癌细胞自噬活性可以抑制其增殖和迁移。     

CircBARD1靶向miR-495-3p/TLR4调控LPS诱导的人牙周膜细胞增殖、凋亡和炎症

目的:研究circBARD1对LPS诱导的人牙周膜细胞(periodontal ligament cells, PDLCs)增殖、凋亡和炎症的影响，并探讨其潜在的调控机制。方法:脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)处理PDLCs建立体外牙周炎细胞模型。qRT-PCR检测circBARD1表达；分别采用CCK8实验和流式细胞术检测细胞增殖活性和凋亡情况；Western blot检测凋亡相关蛋白的表达；ELISA检测炎性因子水平。双荧光素酶报告基因实验验证circBARD1、miR-495-3p和TLR4之间的靶向关系。结果:LPS诱导PDLCs中circBARD1和TLR4表达上调，miR-495-3p表达下调。敲低circBARD1促进LPS诱导的PDLCs的增殖活性，抑制细胞凋亡和炎症反应。circBARD1靶向负调控miR-495-3p的表达，抑制miR-495-3p能够逆转circBARD1敲低对PDLCs的影响。TLR4是miR-495-3p的靶基因，敲低circBARD1可作为miR-495-3p海绵，抑制TLR4的表达。过表达TLR4能够逆转circBA...     

miR-20a 对人炎症牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的：研究 miR-20a 对人炎症牙周膜干细胞成骨分化能力的影响。方法：分离培养人牙周膜干细胞后用 qRT-PCR检测 miR-20a 的表达,并且在瞬时转染 miR-20a mimics 和 inhibitor 后成骨诱导,用茜素红染色,Western Blot 和 PCR 的方法检测成骨能力的改变。结果：人炎症牙周膜干细胞中 miR-20a 表达降低,转染 mimics 后成骨能力升高,转染 inhibitor 后成骨能力降低。结论：miR-20a 可以促进人炎症牙周膜干细胞成骨分化。     

微小RNA663b对口腔鳞状细胞癌细胞迁移、侵袭和上皮间充质转化的影响

目的　探讨微小RNA663b（miR-663b）对口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞迁移、侵袭和上皮间质转化（EMT）的影响。方法　通过基因表达数据库（GEO）使用R Studio进行OSCC组织与癌旁正常组织的差异表达分析。实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-663b在组织和细胞中的表达。检测miR-663b敲除质粒的HN30细胞转染效率，Transwell法检测迁移、侵袭能力。生物信息学方法预测miR-663b的靶向mRNA，双荧光素酶实验验证结合情况。Western blot检测EMT相关标志物的表达。结果　miR-663b在OSCC组织中表达上调，在HN30、CAL27、SCC-9细胞中表达较HOEC细胞高（P<0.05）。敲除miR-663b可以抑制HN30细胞的迁移和侵袭（P<0.05），抑制EMT的发生。生信预测SH3BP2与miR-663b靶向结合，SH3BP2低表达的患者预后较差（P<0.05）。双荧光素酶实验证明miR-663b可以与SHBP2靶向结合（P<0.05）。敲除miR-663b的OSCC细胞中SH3BP2的表达增加，EMT的发生受到抑制。结论　敲除miR-663b可靶向调节SH3BP2抑制OSCC细胞的迁移、侵袭和EMT。     

初步探索miR-27b-3p在普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤过程中的作用

目的 研究miR-27b-3p在普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤（infantile hemangioma,IH）的作用机制。方法用0、15、30、45、60、90μM普萘洛尔处理人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）,检测最佳浓度。采用实时PCR检测miR-27b-3p及凋亡因子mRNA表达,通过Western blot法检测凋亡相关蛋白表达,利用双荧光素酶报告检测miR-27b-3p与Apaf-1的靶向关系。结果 30μM普萘洛尔的最佳浓度作用后,miR-27b-3p表达下调,而Apaf-1、PARP、Caspase-9和Caspase-3表达上调,与敲除miR-27b-3p后结果相一致。上调miR-27b-3p后,细胞凋亡水平和凋亡因子表达被抑制。targetscan.org基因数据库分析发现miR-27b-3p与Apaf-1mRNA的3’UTR匹配,荧光素酶实验结果显示miR-27b-3p与Apaf-1具有靶向关系。结论 miR-27b-3p靶向抑制Apaf-1降低细胞凋亡水平,干扰普萘洛尔疗效。     

MicroRNA-125b对人牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的: 探讨microRNA-125b（miR-125b）对人牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cell, PDLSCs）成骨分化的影响。方法: 利用组织块法分离培养PDLSCs,流式细胞术检测细胞表面标志分子。PDLSCs经miR-125b模拟物或miR-125b抑制剂转染后,采用MTT法和LDH试剂盒分别检测细胞活性和细胞毒性,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性和细胞内钙离子水平均以相应试剂盒检测,Western 印迹法和RT-qPCR检测成骨相关基因水平。双荧光素酶基因报告实验检测miR-125b对细胞间隙连接蛋白43（connexin43,Cx43）的靶向调控作用。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 体外分离培养的PDLSCs呈现间充质干细胞特性。转染miR-125b mimic后,PDLSCs的活性下降,毒性上升,ALP活性、钙离子水平以及成骨相关分子水平均显著下降;相反,anti-miR125b提高了PDLSCs的细胞活性、ALP活性、钙离子水平以及成骨相关分子的表达。双荧光素酶基因报告实验结果表明,miR-125b能够靶向降低Cx43基因水平。而在Cx43过表达的PDLSCs中,miR-125b模拟物对PDLSCs成骨分化的作用被反转。结论: miR-125b通过靶向下调Cx43而抑制PDLSCs的成骨分化。     

miR-146a-5p在慢性根尖周炎病损组织中的表达及临床意义

目的:比较慢性根尖周炎病损组织和健康牙周膜组织中miR-146a-5p的相对表达水平,探讨miR-146a-5p在慢性根尖周炎发病中的作用及临床意义。方法:收集16例诊断为慢性根尖周炎患牙的根尖周组织作为病例组,8例因正畸拔除的健康牙的牙周膜作为对照组,采用HE染色检测样本的炎症浸润程度,采用实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)检测miR-146a-5p的表达。所有数据采用SPSS18.0软件包进行统计学分析。结果:HE染色结果可见对照组中无明显炎症细胞浸润,病损组织中可见大量炎症细胞浸润;RT-PCR实验结果显示,病例组与对照组均有miR-146a-5p的表达,且miR-146a-5p在慢性根尖周炎病损组织中的相对表达量明显高于对照组健康牙周膜组织,差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论:miR-146a-5p与慢性根尖周炎的发生发展密切相关。     

诱导型一氧化氮合酶基因转染兔牙周膜细胞的瞬时表达检测

目的检测含有人诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因的重组质粒pEGFP-iNOS体外转染兔牙周膜细胞后的瞬时表达情况,为动物牙周局部导入外源性iNOS基因奠定实验基础。方法通过脂质体介导将重组真核质粒pEGFPiNOS转染兔牙周膜细胞,在荧光显微镜下观察瞬时转染情况。并在转染后12 h与48 h,应用实时定量PCR检测iNOS基因的转录,Western免疫印迹技术检测iNOS蛋白表达。设空质粒转染组和空白组为对照。结果重组质粒转染后12 h即可观察到荧光蛋白的表达,pEGFP-iNOS转染组细胞中有iNOS mRNA转录及iNOS蛋白的表达。结论iNOS基因成功导入兔牙周膜细胞,瞬时转染后可在基因和蛋白水平检测到外源性基因的表达。在兔牙周组织导入iNOS基因从而诱导NO生成是具有可行性的。     

内皮素-1对牙周膜干细胞肿瘤坏死因子表达的影响

目的:探讨内皮素-1(endothelin-1,ET-1)对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)表达的影响。方法:体外培养鉴定牙周膜干细胞,加入不同浓度(1,10,100 nmol/L)的ET-1培养12、24、72 h,以未作任何处理的牙周膜干细胞为对照,采用ELISA及Western blot检测ET-1作用下牙周膜干细胞TNF-α分泌及蛋白表达的改变。结果:与对照组相比,ET-1对牙周膜干细胞TNF-α分泌及蛋白表达具有显著促进作用,且促进作用具有剂量依赖性及时间依赖性。结论:内皮素-1可以诱导牙周膜干细胞分泌TNF-α,而且这种促进作用呈浓度依赖性及时间依赖性。     

miR-199a调控IGF1表达对机械刺激下成骨细胞分化的影响

目的： 探讨微小RNA（miR）-199a在机械牵张力刺激下MC3T3-E1细胞中的表达变化及其对牵张力刺激MC3T3-E1细胞成骨分化的作用机制。方法： 对体外培养的MC3T3-E1细胞加载12%牵张力0、3、6、12和24 h后,利用碱性磷酸酶（ALP）活性检测试剂盒检测ALP活性,实时荧光定量PCR检测骨钙素（OCN）、成骨细胞特异性转录因子Osterix（OSX）、Runt相关转录因子2（Runx2） mRNA和miR-199a的表达。将MC3T3-E1细胞分为对照组、牵张力组、牵张力+miR-NC组和牵张力+miR-199a组,加载12%牵张力和转染miR-199a模拟物后,观察miR-199a和OCN、OSX、Runx2 mRNA及蛋白表达以及ALP活性。茜素红S（ARS）染色观察钙结节形成能力。采用双荧光素酶报告基因实验检测miR-199a与胰岛素样生长因子1（IGF1）的靶向关系,实时荧光定量PCR法和免疫印迹法检测miR-199a模拟物对IGF1 mRNA和蛋白表达的影响。采用SPSS 24.0软件包对数据进行统计学分析。结果： 与0 h时间点相比,以机械牵张力刺激3、6、12和24 h后,MC3T3-E1细胞ALP活性和OCN、OSX、Runx2 mRNA表达水平均显著升高,而miR-199a表达水平显著降低（P<0.05）,12 h时变化最为显著。与对照组相比,牵张力组细胞中miR-199a表达水平显著降低,而细胞ALP活性、OCN、OSX、Runx2 mRNA及蛋白表达水平、钙结节形成水平均显著升高（P<0.05）;与牵张力组相比,牵张力+miR-NC组细胞中上述各指标差异均无统计学意义（P>0.05）;与牵张力+miR-NC组相比,牵张力+miR-199a组细胞中miR-199a表达水平显著升高,而细胞ALP活性、OCN、OSX、Runx2 mRNA及蛋白表达水平、钙结节形成水平均显著降低（P<0.05）。miR-199a可与IGF1靶向结合,miR-199a模拟物可使MC3T3-E1细胞中IGF1 mRNA和蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。结论： miR-199a可抑制机械牵张力刺激诱导的MC3T3-E1细胞成骨分化,其作用机制可能与靶向调控IGF1表达有关。     

Effects of hyaluronan oligosaccharide on the expression of MMP-1 in periodontal ligament cells

It is well known that low-molecular weight hyaluronan (HA) is detected in human periodontal tissue under inflammatory conditions. HA oligosaccharide (HAoligo) has been demonstrated to induce matrix metalloproteinase (MMP)-1 expression in dendritic cells and chondrocytes, however, the bioactivities of HAoligo in periodontal ligament (PDL) cells remain unclear. In this study, we investigated the effect of HAoligo on MMP-1 expression in human PDL (HPDL) cells and the mechanisms in terms of the signal transmission. HAoligo was generated and purified from commercial human umbilical cord HA. HPDL cells were isolated from healthy ligaments, and cultured with HAoligo for 0-24 h. The expression of MMP-1, tissue inhibitor of MMPs (TIMP)-1 and TIMP-2 was analyzed by real-time PCR and Western blot analyses. Effects of specific inhibitors of p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity, MAPK kinase activity and NFkB activity on HAoligo-induced MMP-1 expression in HPDL cells were also investigated by real-time PCR and Western blot analyses. HAoligo remarkably enhanced MMP-1 expression in both mRNA and protein levels, but no effect was shown on the expression of TIMP-1 and TIMP-2 mRNAs. Inhibition of p38MAPK activity decreased the MMP-1 expression. Neither inhibition of NFkB nor MAPKK activity affected the MMP-1 expression. It was suggested that HAoligo induces MMP-1 expression in HPDL cells, and p38MAPK plays a crucial role in signal transduction for MMP-1 inducted by HAoligo.     

炎症微环境对人牙周膜成纤维细胞增殖与成骨分化的影响

目的: 观察脂多糖模拟的炎症微环境对体外培养的人牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament cells, PDLCs）增殖与成骨分化的影响。方法: 体外培养鉴定人牙周膜成纤维细胞,分别用浓度为0、0.1、10 μg/mL脂多糖作用于细胞,采用MTT法观察脂多糖对PDLCs增殖的影响,运用实时定量PCR和Western印迹法检测脂多糖模拟的炎症微环境对PDLCs成骨分化的影响。采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 0.1 μg/mL脂多糖促进PDLCs增殖,增强成骨标志物mRNA和蛋白的表达;10 μg/mL脂多糖可抑制PDLCs的增殖及碱性磷酸酶、RUNX2、Ⅰ型胶原、骨形态发生蛋白2的表达,其结果有统计学意义。结论: 高浓度脂多糖（10 μg/mL）模拟的炎症微环境对PDLCs增殖及成骨分化有抑制作用,低浓度脂多糖（0.1 μg/mL）对PDLCs的增殖和成骨分化有促进作用。