鼻咽癌可溶性抗原负载DC诱导CTL杀伤鼻咽癌细胞的体外研究

目的用负载鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原的树突状细胞(dendritic cells, DC)诱导自身淋巴细胞,使之活化为鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)特异性细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL),观察其对鼻咽癌细胞的体外特异性杀伤作用. 方法用GM-CSF、IL-4和TNF-α体外诱导健康成人外周血单核细胞,使其分化为高纯度DC.用鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原负载成熟DC,流式细胞仪检测负载前后DC的表型特征,MLR检测负载前后DC对同种异体T淋巴细胞增殖的能力.在白细胞介素-2(IL-2)的作用下,用负载鼻咽癌细胞可溶性抗原的DC诱导自身淋巴细胞成NPC特异性CTL,通过杀伤活性实验观察它对鼻咽癌细胞(CNE)的特异性杀伤效应. 结果人外周血单核细胞体外在GM-CSF、IL-4、TNF-α诱导下获得具典型表型特征的成熟DC.负载CNE可溶性抗原对成熟DC表面共刺激分子及特异性表面标志无影响,仍有较强的刺激同种异体淋巴细胞增殖能力,所诱导的CTL对鼻咽癌细胞(CNE)有明显的特异性杀伤作用.结论负载鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原的DC所诱导的CTL在体外对鼻咽癌细胞有特异性杀伤作用,对NPC的临床治疗有潜在的应用价值.     

SOCS1沉默的树突状细胞疫苗在喉癌治疗中的实验研究

目的:研究SOCS1沉默的树突状细胞(DC)疫苗特异性抗肿瘤作用机制,并探讨RNAi技术在喉癌基因治疗中的应用前景,为DC的临床应用提供新思路。方法:以细胞因子GM-CSF、IL-4和TNF-α体外诱导扩增外周血单核细胞来源的DC,倒置显微镜下观察DC形态特征;构建RNAi载体转染DC,Western blot检测SOCS1的表达情况,筛选抑制SOCS1表达的有效靶序列;流式细胞术检测DC表面分子CD83、CD86和HLA-DR的表达;ELISA法分析上清中IFN-γ的含量;MTT法评估DC刺激T细胞增殖的能力及诱导细胞毒性T细胞(CTL)的杀伤活性。结果:DC体外诱导培养成功;设计的RNAi载体经测序验证无误。干扰序列5可显著下调SOCS1表达水平;SOCS1沉默联合喉癌Hep-2抗原致敏的DC可显著上调表面分子标志CD83(85.61±0.96)%、CD86(96.86±1.20)%和HLA-DR(98.02±0.94)%的表达;该组DC能有效刺激T细胞增殖,增加IFN-γ的分泌量,最终增强CTL的特异性杀伤作用,效靶比为50∶1时其杀伤活性与对照组之间的差异有统计学意义(P<0.01)。结论:SOCS1沉默并负载喉癌Hep-2抗原的DC疫苗可以产生高效而特异性的抗喉癌免疫应答。     

SOCS1siRNA和IL-12基因共同修饰树突状细胞体外抗喉癌的免疫反应

目的:探讨腺病毒负载SOCS1siRNA和IL-12基因共同修饰人喉癌细胞(Hep-2)抗原致敏的树突状细胞(DC)在体外诱导﹑激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫杀伤Hep-2的效能及相关免疫机制。方法:采用重组腺病毒介导SOCS1siRNA基因和重组腺病毒介导IL-12基因共同修饰人外周血单个核细胞(PBMC)来源的DC;采用反复冻融法提取Hep-2粗体抗原(Ag)致敏的基因修饰的DC;用ELISA法检测各组DC及CTL分泌IL-12和IFN-γ的水平;MTT法检测DC刺激同源T淋巴细胞增殖能力及CTL免疫杀伤Hep-2的效能;统计学分析各组间的差异。结果:DC体外诱导培养成功,Ad-GFP转染可见荧光表达率在90%以上。经SOCS1siRNA和IL-12基因共同修饰能有效下调DC中SOCS1蛋白的表达和上调IL-12蛋白的表达。IL-12因子的分泌率也明显高于SOCS1siRNA或IL-12的单基因转染,并能促使T细胞显著增殖和活化。DC和CTL持续高分泌IFN-γ,因此产生对Hep-2的特异性细胞免疫。结论:SOCS1siRNA和IL-12基因共同修饰喉癌抗原致敏的DC分泌的IL-12和IFN-γ的能力增强。双基因共同修饰喉癌抗原致敏的DC与T细胞混合反应能有效的促进T细胞增殖,促进其分泌IFN-γ和IL-12,从而诱导CTL更强的特异性杀伤喉癌细胞的能力。     

可溶性喉鳞癌抗原诱导TAK细胞的免疫学特征

从喉鳞癌患者的手术切除标本中提取的可溶性抗原具有免疫活性，在抗CD3单抗和rIL－2的协同作用下，能刺激外周血单核细胞（PBMC）增殖产生CD8＋细胞毒T淋巴细胞为主的杀瘤细胞，称其为TAK细胞。它是异质性细胞群，其细胞表型以CD8＋细胞为主，具有活化的淋巴母细胞的形态学特征，常形成集落，并表达活化的淋巴细胞的表面标记，如IL－2受体。     

共刺激分子CD28、CD137在喉癌患者T淋巴细胞中的表达及其与细胞免疫功能失调的关系

目的探讨共刺激分子CD28、CD137与喉癌患者细胞免疫功能状况的关系。方法应用梯度离心法分离并纯化外周血和肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte,TIL）,流式细胞术检测喉癌患者外周血T细胞CD8^＋、CD8^＋CD28^＋、CD8^＋CD28^-、CD28^＋细胞亚群分布和双香豆素（phytohemagglutinin,PHA）刺激前后患者外周血T细胞及TIL中CD137的表达。结果喉癌患者CD8^＋T细胞比率为（32.11±5.07）%,CD8^＋CD28^-T细胞比率为（21.03±5.69）%,均明显高于正常对照组（均P〈0.01）;CD28^＋T细胞比率为（45.53±4.51）%,CD8^＋CD28^＋T细胞比率为（12.70±3.41）%,均明显低于正常对照组（P均〈0.01）。CD137^＋T细胞活化增殖能力与CD28的阳性表达呈明显的正相关,喉癌患者外周血T细胞和TIL在未受PHA刺激时CD137^＋T细胞比率分别为（1.90±0.71）%和（3.52±1.64）%,明显高于正常对照组（P均〈0.01）。但经PHA刺激48小时后,外周血和TIL中CD137^＋-48h/CD137^＋-0h值为分11.48±4.03和10.39±3.02,均明显低于正常对照组,P均〈0.01。结论共刺激分子CD28在CD8^＋T细胞亚群中的表达失调使免疫效应性CD137^＋T细胞活化增殖能力下降,是引起喉癌患者细胞免疫功能紊乱的重要原因之一。 还原     

鼻咽癌患者外周血树突状细胞体外扩增及生物学特性的研究

目的：观察鼻咽癌（NPC）患者外周血单核细胞来源的树突状细胞（DC）的形态、表型和功能与健康者DC的差别。方法：从12例NPC患者（NPC组）和9例健康者（对照组）的外周血中分离和培养DC，观察DC的形态，用流式细胞仪检测DC的表型CD83、CD1a、CD86和HLA-DR，用4，二甲基噻唑2，5二苯基四唑溴化物（MTT）比色法检测DC诱导混合淋巴细胞反应（MLR）的能力。结果：对照组的DC形态较NPC组成熟，NPC组CD83、CD1a的表达率较对照组低，差异有统计学意义（均P〈0.05），但CD86、HLA-DR表达率2组差异无统计学意义（均P〉0.05）；NPC组CD83、CD1a、CD86和HLA-DR表达的平均荧光指数（MFI）均低于对照组，但差异无统计学意义（均P〉0.05）；对照组和NPC组外周血单核细胞均能诱导出DC，前者有较强的MLR诱导能力（P〈0.05），而后者能力低下（P〉0.05）。结论：NPC患者外周静脉血单核细胞来源的DC转化率较健康者低，且分化成熟能力也较低。     

EB病毒潜伏膜蛋白2A诱导细胞毒性T细胞抗鼻咽癌的体内外实验

目的观察EB病毒（Epstein—Barr virus，EBV）-潜伏膜蛋白2A（1atent membrane protein2A，LMP2A）转染人树突状细胞（dendritic cell，DC）诱导特异性细胞毒性T细胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL）的体外生物学特性；建立表达EBV—LMP2A的裸鼠鼻咽癌动物模型，探讨LMP2A特异性CTL在荷瘤鼠体内的抗肿瘤效应。方法分离人外周血单核细胞（pripheral blood mononuclear cell，PBMC），以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte—monocyte colony stimulating factor，GM—CSF）、白细胞介素4（interleukin-4，IL4）及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF—α）诱导培养获得DC，荧光激活细胞分选仪（fluorescence activated cell sorter，FACS）检测成熟DC的表面分子表达。用LMP2A重组腺病毒转染成熟DC，将转染DC与自体PBMC混合培养，在白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）作用下诱导针对LMP2A的特异性CTL，FACS检测CTL群体中阳性细胞的组成。将鼻咽癌CNE细胞接种BALB／c裸鼠，建立鼻咽癌动物模型；在裸鼠肿瘤局部注射LMP2A特异性CTL，观察治疗后移植瘤生长情况及病理变化。结果人外周血PBMC体外在GM—CSF、IL4、TNF—α诱导下获得典型形态及表型特征的成熟DC。FACS检测表明，以LMP2A重组腺病毒转染DC诱导的CTL细胞群体以CIM、CD8阳性细胞组成为主。在接种CNE细胞3周后建立表达EBV—LMP2A的裸鼠鼻咽癌动物模型；动物体内实验表明注射CTL的裸鼠肿瘤生长缓慢，体积明显小于对照组（P〈0．01）；病理检查显示肿瘤局部发生液化性坏死并有淋巴细胞浸润。结论人外周血单核细胞体外经细胞因子诱导，可生成具典型特征的成熟DC。利用LMP2A重组腺病毒将LMP2A基因转入DC，可在同一个体体外诱导出针对LMP2A的特异性CTL。CNE细胞接种裸鼠，可成功构建鼻咽癌动物模型；LMP2A特异性CTL在动物体内可明显抑制鼻咽癌肿瘤的生长，发挥有效的抗肿瘤作用。     

喉癌人类组织相容性抗原Ⅰ缺失与癌组织中淋巴细胞浸润的研究

目的检测喉癌组织人类主要组织相容性抗原(human leucotyte antigen,HLA)表达缺失情况,探讨其表达与肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)及肿瘤细胞恶性度的关系. 方法 2001年2月～2001年5月应用特异性鼠抗人HLAⅠ类分子等单克隆抗体与喉癌组织结合,通过免疫组化法,对1993～1998年64例手术切除喉癌标本进行检测.结果 64例喉癌组织中有57例HLAⅠ抗原阳性表达,7例阴性表达,阴性表达率为10.9%(7/64);HLAⅠ抗原阳性组织,浸润到肿瘤实质的CD+3T细胞和CD+8T细胞数量明显多于HLAⅠ抗原阴性组织;随着HLAⅠ抗原表达下调,肿瘤细胞恶性度增加.随访52例,3年生存率与HLAⅠ抗原缺失无关(P>0.05).结论部分喉癌组织存在HLAⅠ抗原丢失,且其丢失不利于细胞毒性T淋巴细胞向肿瘤实质浸润与杀伤.HLAⅠ抗原表达缺如,可能促进了细胞恶变的发生发展,是肿瘤逃避免疫监视的方式之一.     

喉癌患者不同来源淋巴细胞毒性的对比研究

应用细胞生物学方法，从１２例喉癌患者分离的外周血淋巴细胞（ＰＢＬ）、肿瘤引流淋巴结淋巴细胞（ＴｄＬＮＬ）和肿瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ）在体外经重组务细胞介素２（ｒＩＬ－２）诱导５－７天后，成为具有杀瘤活性的淋巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ细胞）或激活的ＴＩＬ。采用＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法，检查它们对Ｋ５６２靶细胞的杀伤能力。实验结果显示：加入ｒＩＬ－２栖外培养的ＰＢＬ、ＴＤＬＮＬ和ＴＩＬ细胞体积增大，呈不     

喉癌围手术期细胞免疫功能改变的意义

目的:了解喉癌患者围手术期细胞免疫的状况及手术相关因素对患者细胞免疫的影响;了解T淋巴细胞水平与喉癌临床特征、病程进展的关系.方法:应用SAP法检测喉癌术前2d及术后12d外周血CD3+、CD4+、CD8+细胞水平及CD4+/CD8+比率的改变,并联系临床分期、淋巴结转移、复发综合分析.结果:喉癌患者CD3+、CD4+、CD8+细胞水平及CD4+/CD8+比正常对照组明显下降;术后CD3+、CD4+、CD8+有进一步下降的倾向.晚期喉癌患者CD4+细胞水平、CD4+/CD8+比率明显下降(P＜0.05).淋巴结转移者CD4+/CD8+亦下降,CD8+细胞水平却相对升高;复发患者的CD8+细胞水平相对提高.结论:喉癌患者T淋巴细胞免疫功能低下,全麻、手术创伤及术后复合因素是喉癌术后免疫功能进一步低下的原因.CD4+、CD8+细胞水平及CD4+/CD8+比率是表明喉癌患者病期进展、淋巴结转移、复发的免疫学指标.围手术期需行免疫治疗.     

慢性鼻窦炎鼻窦黏膜中表皮生长因子及其受体的表达

目的 观察表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)及其配体表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)在慢性鼻窦炎患者鼻窦黏膜中的表达及分布,探讨EGFR信号通路与慢性鼻窦炎的关系.方法 取慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者上颔窦窦口黏膜20例(Ⅰ型和Ⅱ型各10例),另以10例正常鼻窦黏膜作为对照,应用HE染色和免疫荧光技术观察EGF和EGFR在各组鼻窦黏膜中的表达,比较阳性细胞面积比在各组间的差异.结果 EGF和EGFR在Ⅰ型和Ⅱ型慢性鼻窦炎鼻窦黏膜中均有表达,其中EGF主要表达于上皮细胞,炎性细胞和部分黏膜下腺体亦有表达;而EGFR主要表达于杯状细胞,上皮细胞和基底细胞亦有表达,两组间阳性细胞面积比差异均无统计学意义(P＞0.05).正常鼻窦黏膜中上述部位仅有弱表达或无表达,阳性细胞面积比与两病变组差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 EGFR及其配体EGF在慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者鼻窦黏膜中均有明显表达,EGFR信号通路可能在慢性鼻窦炎的病理机制中发挥重要作用.     

23例改良腭咽成形患者术后出血相关因素及处理措施的研究

目的回顾总结改良悬雍垂腭咽成形术(UPPP)后23例并发出血的相关因素和处理。方法选取我科2017年1月至2018年12月收治的阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者(OSAHS)行改良腭咽成形术后并发出血患者23例作为研究对象,分析患者的出血原因、出血情况,采取不同的止血治疗措施。结果23例出血患者经过各项止血措施的积极治疗后,伤口出血均得到有效控制。结论应根据患者精神状态、出血的部位、范围、血量,采取不同的止血方法。对改良腭咽成形术后出血的可能相关因素展开有效的预防,提高手术技巧,加强围手术期管理,加强健康宣传教育,能够显著减少术后出血的产生以及可能造成的严重后果,可以促进患者康复,提高住院患者的满意度。     

Comprehensive Analysis of Clinicopathologic Factors Predictive of an Unfavorable Prognosis in Patients With Acinic Cell Carcinoma of the Parotid Gland

Objectives.In subset of patients, acinic cell carcinoma (AcCC) exhibits aggressive features such as recurrence, distant metastasis, and mortality. This study aimed to investigate clinicopathologic factors influencing patients’ prognosis and to identify adverse features predictive of an unfavorable prognosis.Methods.Between January 2000 and December 2016, 59 patients with AcCC were enrolled in this study.Results.The patients’ 5-year overall survival rate was 93.3%, and their 5-year recurrence-free survival rate was 80.5%. During the study period, recurrence occurred in 10 patients. The mean time to recurrence after surgery was 26 months (range, 5–60 months). During the study period, three patients died from the disease. Univariate analysis showed that sex, surgical extent, extranodal extension, T classification, and TNM stage were significantly associated with disease recurrence. Multivariate analysis showed that, among the clinicopathologic factors included in the analysis, only TNM stage displayed a statistically significant correlation with disease recurrence.Conclusion.Surgical treatment alone yielded good results for AcCC, and additional treatment did not affect the recurrence-free survival rate or the overall survival rate, even when the resection margin was less than 1 mm. Other pathologic factors did not show prognostic significance for disease recurrence or death.     

睫状神经营养因子对面神经损伤的修复作用

目的探讨局部应用睫状神经营养因子对面神经损伤的修复作用。方法将成年新西兰兔面神经上颊支切除5mm,在断端间置入硅胶再生室,实验组室内注入睫状神经营养因子,对照组用生理盐水。术后4周和8周进行电生理学、组织病理学观察和形态学定量分析。结果术后4周,两组电刺激面神经很少能引发面肌兴奋,有髓轴索计数,轴索直径和面积t检验,两组差异有显著性意义(P<0.05)。术后8周面神经复合肌动作电位,实验组运动神经传导速度明显短于对照组,有髓轴索计数,轴索直径和面积实验组大于对照组(P<0.05)。结论局部应用睫状神经营养因子可促进面神经损伤的修复。     

影响聋儿家庭康复效果的因素及对策

当前聋儿家庭康复教育越来越受到重视,但许多聋儿家长在家庭康复教育中存在着错误观念和盲目行为,从而影响了家庭康复教育的质量,甚至阻碍了聋儿身心的健康发展。为此,笔者提出对策。以期给家长提供帮助。     

地塞米松对人鼻黏膜上皮细胞前炎性因子表达的抑制作用

目的观察地塞米松对脂多糖(lipopolysac-charide,LPS)诱导的人鼻黏膜上皮细胞缺氧诱导因子-1(hypoxic inducible factor-1,HIF-1)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达抑制情况及意义。方法无血清原代培养人鼻息肉和下鼻甲黏膜上皮细胞,以LPS100ng/ml,白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)20ng/ml,LPS100ng/ml加地塞米松13ng/ml,IL-1β20ng/ml加地塞米松13ng/ml作用于对数生长期的上皮细胞3、6、9小时后,采用免疫细胞化学和原位杂交方法检测HIF-1α和VEGF蛋白及mRNA的表达情况。结果①LPS和IL-1β作用于上皮细胞时,HIF-1α及VEGF表达增加具有时间依赖性,以LPS100ng/ml6小时组最明显(P<0.05),且鼻息肉中的表达明显高于下鼻甲(P<0.05);②LPS100ng/ml加地塞米松13ng/ml组和IL-1β20ng/ml加地塞米松13ng/ml组表达强度分别较LPS100ng/ml组和IL-1β20ng/ml组弱(P<0.05)。两抑制组间表达无显著性差异。结论炎性因子及感染性因子可以诱导人鼻黏膜上皮细胞大量表达HIF-1α及VEGF,而地塞米松对其表达有很强的抑制作用。     

白细胞介素17与血管内皮生长因子在鼻息肉发病中的作用

鼻息肉是临床鼻科的常见病,其发生是一个多因素、多步骤、多种因子综合参与的复杂的病理生理过程。白细胞介素17是一种强大的前炎症细胞因子,血管内皮生长因子则是已知的最强的血管通透因子,近年来大量研究证实白细胞介素17与血管内皮生长因子在鼻息肉的发生、发展中扮演着重要的角色,且两者之间可能形成一个作用环,共同促进鼻息肉的发生与发展。     

226例声门型喉癌预后及影响因素分析

目的分析影响外科治疗声门型喉癌患者的预后及其影响因素。方法2008年6月—2013年4月首诊并行手术治疗的声门型喉癌患者226例的临床资料,分析患者的性别、年龄、T分期、N分期、手术方式、术后放疗、病理分级可能与喉癌预后相关的指标;单因素分析采用Log rank检验,多因素分析采用Cox比例风险回归模型,5年生存率采用Kaplan-Meier 法计算。结果①单因素分析显示年龄、T分期、N分期、病理分级、术后放疗、术后局部复发、术后颈部淋巴结复发与声门型喉癌预后相关(P＜0.05);②多因素分析显示年龄、T分期、N分期、术后咽喉部/造瘘口复发、术后颈淋巴结复发是影响声门型喉癌患者预后的独立危险因素(P＜0.05);③声门型喉癌患者5年总体生存率75.2%。结论合理的颈部淋巴结清扫和术后放疗可以提高局部晚期声门型喉癌的疗效;III、IV期患者术后局部/颈淋巴结复发风险高,需要密切随访,积极的挽救性手术仍是患者复发后主要的治疗方法。     

成纤维细胞生长因子2型受体在喉癌中的表达及临床意义

目的　探讨成纤维细胞生长因子2型受体（fibroblast growth factor 2,FGFR2）在喉癌中的表达及临床意义。方法　应用免疫组织化学（SP法）检测FGFR2蛋 白在40例喉癌组织、15例癌旁组织和8例正常喉黏膜中的表达情况。应用流式细胞术的方法定量检测40例喉癌组织、13例癌旁组织和5例正常喉黏膜组织中FGFR2的含量。结果　喉癌组织、癌旁组织及正常喉黏膜中FGFR2蛋白的表达强度呈下降趋势,差异有统计学意义（H =11.4573,P <0.01）。FGFR2蛋白在喉癌组织、癌旁组织及正常黏膜中的表达量分别为1.8776±0.1683、1.1815±0.2710和1.0100±0.1341,差异有统计学意义（F =93.1797,P =0.0000）。喉癌组织中FGFR2蛋白的表达量明显高于癌旁组织及正常喉黏膜组织,而癌旁组织与正常喉黏膜相比无显著性差异。喉癌组织中FGFR2蛋白表达与病理分级有关,而与其临床分期、淋巴结转移、临床分型、肿瘤大小、吸烟量、年龄和性别均无关。结论　FGFR2蛋白在喉癌中的发生、发展有一定的相关性。     

111例突发性耳聋的临床疗效分析

目的探讨突发性耳聋患者的临床疗效及相关因素。方法回顾性分析111例突发性耳聋的临床资料,应用统计学方法对患者的性别、年龄、就诊时间、耳鸣、各频率听力损失及听力损失曲线类型进行分析。结果 111例突发性耳聋患者,痊愈15例（13.51%）,显效18例（16.22%）,有效38例（34.33%）,无效40例（36.04%）;总有效率为63.96%。突发性耳聋的疗效与患者性别、年龄、耳鸣无关（P〉0.05）,但与患者就诊时间、听力损失程度以及听力损失曲线类型有关（P〈0.05）。突发性耳聋患者在发病7 d内就诊、听力损失轻中度及听力损失曲线呈上升型及凹陷型的患者预后较好;反之预后较差。结论病程、听力曲线类型、听力损伤程度与突发性耳聋的预后有一定的相关性;而年龄、性别、伴发耳鸣与预后均无明显相关性。