喉鳞状细胞癌的体外原代培养

利用体外组织培养方法对１１组喉鳞状细胞癌标本进行原代培养。结果原代培养平时时间２月，培养成功率６３．６％（７／１１），并可继续传代，介绍了组织块培养和胰蛋白酶消化分离培养两种方法以及去除成纤维细胞的方法。讨论了喉鳞癌原代培养中的注意事项。     

巨噬细胞集落刺激因子对喉鳞状细胞癌喉癌细胞株的作用

目的:了解和探讨巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)及其受体对喉鳞状细胞癌细胞株(Hep2)细胞系的作用。方法:使用氚标记胸腺嘧啶核苷(3HTDR)掺入法和MTT法测试MCSF作用于Hep2后细胞的增殖状况,并测试加入巨噬细胞集落刺激因子受体(MC-SFR)抗体后细胞生长情况。ELISA法测试M-CSF作用Hep2细胞后上清中的MCSF的浓度变化。结果:Hep2细胞培养后较培养前的上清中的MCSF的浓度升高。加入的M-CSF浓度越大,细胞增殖越差,加入MCSFR抗体浓度越大细胞增殖越好。结论:MCSF对喉癌细胞Hep2细胞的增殖具有抑制作用。     

喉癌树突状细胞的免疫组化研究及其临床意义

树突状细胞是一种具有免疫活性的特殊的组织细胞，它在抗肿瘤免疫中的作用越来越受到人们的重视。本文采用免疫组化方法用抗Ｓ－１００蛋白抗体对６８例喉癌组织，２１晨喉癌组织中的树突状细胞的分布进行观察，以了解它与肿瘤生物学行为及预后的关系。结果表明喉癌组织中树突状细胞检出率为６３．２４％，主要散在于肿瘤细胞间的间质中，非喉癌组织中很少见到ＤＣ，ＤＣ的分布情况与喉癌预后有关系，ＤＣ阳性才术后生存率明显高于阴     

人β-防御素-2在喉癌组织中的表达及与CD1a~+树突状细胞浸润的相关性

目的 研究喉癌组织中人β-防御素-2(human beta-defensin-2,HBD-2)mRNA和蛋白的表达,探讨其在机体抗肿瘤免疫中的潜在价值.方法 采用链霉亲合素-生物素酶复合物法(strept actividin-biotin complex,SABC)检测34例喉鳞癌石蜡标本中HBD-2蛋白表达及CD1a~+树突状细胞(dendritic cell,DC)的浸润;收集18例喉鳞癌患者术中切除的新鲜肿瘤组织及其中5例距肿瘤边缘2 cm的癌旁上皮组织,应用互补DNA(cDNA)探针原位杂交检测HBD-2 mRNA的表达.分析HBD-2在不同的临床和病理状态下的表达及与CD1a~+树突状细胞浸润的关系.结果 ①免疫组化结果显示,在不同的病理分化组中HBD-2的表达差异有统计学意义(F=6.809,P＜0.05),高分化组HBD-2表达水平明显高于中分化和低分化组(P值均＜0.05).不同临床分型、T分期及有无淋巴转移组中HBD-2的表达水平差异无统计学意义.②原位杂交结果显示,18例喉鳞癌和5例癌旁上皮组织中HBD-2 mRNA的表达存在差异,喉癌低分化组明显弱于高分化组和癌旁上皮组织(F=16.391,P＜0.05).③连续切片染色结果显示,HBD-2蛋白表达水平与CD1a~+DC浸润程度呈正相关(r=0.343,P＜0.05),连续切片结果显示,图片染色的阳性区域相互对应,表示存在位置上的相关性.结论 HBD-2在喉鳞癌中的表达与癌细胞的分化程度有关,并受到转录水平和翻译水平上的调节;HBD-2可能通过趋化CD1a~+DC在肿瘤局部的浸润及功能的活化在机体获得性抗肿瘤免疫中发挥作用.     

喉癌肿瘤细胞间树突状细胞浸润与局部淋巴转移及癌周淋巴细胞反应的关系

目的探讨喉癌癌细胞间浸润树突状细胞在局部抗肿瘤免疫反应中的作用及其与局部淋巴结转移的关系.方法采用免疫组织化学方法,以S-100蛋白抗体标记23例喉鳞状细胞癌组织中树突状细胞,观察癌细胞间树突状细胞密度与淋巴结转移及其与癌周淋巴细胞反应的关系.结果喉癌无淋巴结转移患者癌细胞间树突状细胞密度显著高于淋巴结转移患者(P<0.01).癌周淋巴细胞反应强阳性患者喉癌细胞间树突状细胞浸润密度高于癌周淋巴细胞反应中、弱阳性合并组患者(P<0.05).结论喉癌细胞间的树突状细胞在喉癌局部抗肿瘤反应中起重要作用.喉癌细胞间树突状细胞浸润密度越高,局部淋巴结转移越少,癌周淋巴细胞反应越强.定量检测喉癌细胞间树突状细胞可作为判断预后的指标之一.     

应用OKT单克隆抗体测定喉癌患者外周血T细胞亚群的研究

应用OKT单克隆抗体借助间接免疫荧光法测定49例受检者外周血T细胞亚群,结果表明,喉癌组OKT_8~+细胞百分率显著升高,OKT_4~+/OKT_8~+比值显著低于正常组和良性病变组。并且,喉癌患者外周血中T细胞亚群的分布与临床分期有一定关系。提示喉癌患者总的细胞免疫功能处于抑制状态,晚期表现尤为显著。表明测定外周血T细胞亚群,对于了解喉癌患者的免疫状态、监测病情变化和估价预后有一定临床价值。     

SOCS1siRNA和IL-12基因共同修饰树突状细胞体外抗喉癌的免疫反应

目的:探讨腺病毒负载SOCS1siRNA和IL-12基因共同修饰人喉癌细胞(Hep-2)抗原致敏的树突状细胞(DC)在体外诱导﹑激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫杀伤Hep-2的效能及相关免疫机制。方法:采用重组腺病毒介导SOCS1siRNA基因和重组腺病毒介导IL-12基因共同修饰人外周血单个核细胞(PBMC)来源的DC;采用反复冻融法提取Hep-2粗体抗原(Ag)致敏的基因修饰的DC;用ELISA法检测各组DC及CTL分泌IL-12和IFN-γ的水平;MTT法检测DC刺激同源T淋巴细胞增殖能力及CTL免疫杀伤Hep-2的效能;统计学分析各组间的差异。结果:DC体外诱导培养成功,Ad-GFP转染可见荧光表达率在90%以上。经SOCS1siRNA和IL-12基因共同修饰能有效下调DC中SOCS1蛋白的表达和上调IL-12蛋白的表达。IL-12因子的分泌率也明显高于SOCS1siRNA或IL-12的单基因转染,并能促使T细胞显著增殖和活化。DC和CTL持续高分泌IFN-γ,因此产生对Hep-2的特异性细胞免疫。结论:SOCS1siRNA和IL-12基因共同修饰喉癌抗原致敏的DC分泌的IL-12和IFN-γ的能力增强。双基因共同修饰喉癌抗原致敏的DC与T细胞混合反应能有效的促进T细胞增殖,促进其分泌IFN-γ和IL-12,从而诱导CTL更强的特异性杀伤喉癌细胞的能力。     

喉鳞状细胞癌组织体外原代培养的初步研究

目的 应用体外培养技术,对喉鳞状细胞癌组织进行体外培养,探讨喉鳞癌组织原代培养中的各种影响因素,为建立人喉鳞癌组织的细胞系提供实验基础。方法采用体外组织培养技术,对24例人喉鳞状细胞癌组织进行原代培养,观察原代培养中肿瘤细胞的生长与供体的年龄、肿瘤组织的分化程度及不同培养方法的关系,分析在人喉鳞癌细胞的培养中成纤维细胞、微生物污染的影响。结果 24例人喉鳞状细胞癌组织标本,年龄小于60岁组的细胞生长率为31.25％(5/16例),年龄大于60岁组为37.5％(3/8例);高分化组为100％(2/2例),中分化组为30.8％(4/13例),低分化组25％(2/8例);组织块培养法为43.75％(7/16例),酶消化法培养为10％(1/10例);倒置显微镜下观察,在培养的第5～7天,在贴壁组织块周围可见到有上皮样细胞爬出。全部标本中,成纤维细胞的过度生长和微生物的污染是阻碍人喉鳞癌细胞生长的重要因素。结论培养组织的细胞生长率与供体的年龄关系不大;肿瘤组织的分化程度较高者,细胞的生长率较高;与酶消化分离培养法相比,贴壁组织块培养法的细胞生长率较高;成纤维细胞及微生物的污染是阻碍人喉鳞癌细胞系建立的重要因素。     

RA和VD诱导喉癌患者LAK细胞TNF—α的表达

本文应用全反式维甲酸和１，２５－二羟维生素Ｄ３诱导培养喉癌患者ＬＡＫ细胞，采用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术和ＥＬＩＳＡ检测ＴＮＦ－α基因ｍＲＮＡ及其蛋白的表达，结果显示，ＶＤ或ＲＡ加ＶＤ诱导的ＬＡＫ细胞ＴＮＦ－αｍＲＮＡ及其蛋白的表达显著增高。     

喉癌患者染色体对致突变剂诱发畸变的敏感性研究

采用平阳霉素作为诱变剂，对２８例喉癌患者和２３例正常人做外周血淋巴细胞染色体对诱变剂敏感性研究，结果显示喉癌患者的染色体总畸变率、每细胞染色单体断裂率（ｂ／ｃ值）和细胞畸变率分别为１．９８％±０．０５％，０．５７％±０．３５％和４２．８％±１２％。正常人则分别为０．９４％±０．０４％，０．２８％±０．１２％和２７％±１２％。经统计学处理，喉癌患者组与正常人组的差异有高度显著性。并结合实验结果探讨了染色体对致突变剂的敏感性与患喉癌风险的关系。     

白细胞介素18在喉鳞状细胞癌中的表达

目的 探讨白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)在喉癌发生发展中的作用.方法 采用双抗体夹心ELISA法检测22例喉癌患者(喉癌组)和10例健康人(对照组)血清中IL-18的含量;采用RT-PCR法检测22例配对喉癌组织及切缘黏膜组织中IL-18基因的表达.结果 喉癌组血清IL-18含量(68.44±39.42)pg/ml高于对照组(28.44±2.29)pg/ml,差异有显著性(P＜0.01);RT-PCR检测IL-18 mRNA,22例喉癌组织均无表达;癌旁黏膜IL-18 mRNA有9例(40.9%)表达.结论 喉癌患者血清IL-18表达增高,提示IL-18与喉癌的发生发展相关;喉癌组织IL-18 mRNA不表达,而癌旁黏膜部分表达,表明IL-18并非肿瘤细胞所分泌,可能来自宿主细胞.     

抑癌基因PTEN和血管内皮生长因子在喉癌中的表达及临床意义

目的 探讨抑癌基因PTEN（phosphates and tension homolog deleted on chromosome ten）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）在喉鳞状细胞癌（Iaryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）中的表达及临床意义.方法 采用免疫组化SP法检测10例远处癌旁组织（距癌组织1.5cm）,20例癌旁组织（距癌组织0.5 cm）和60例LSCC组织中PTEN、VEGF基因的表达情况.结果 PTEN在LSCC、癌旁组织及远处癌旁组织中阳性表达率分别为70.0%、95.0%、100.0%,有显著性差异（P＜0.01）.LSCC组织中PTEN蛋白表达在TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、高中分化癌、无转移、生存率＞3年的患者中表达水平较Ⅲ～Ⅳ期、低分化和有转移、生存率＜3年的患者高,有显著性差异（P＜0.05）.VEGF在LSCC、癌旁喉组织及远处癌旁组织中阳性表达率分别为73.3%、55.0%、20.0%,有显著性差异（P＜0.05）.LSCC组织中VEGF蛋白表达在TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、高中分化癌、无转移、生存率＞3年的患者中表达水平较Ⅲ～Ⅳ期、低分化和有转移、生存率＜3年的患者低,差异有显著性（P＜0.05）.PTEN、VEGF蛋白表达与年龄、性别、肿瘤部位无关（P＜0.05）.Spearman相关分析发现PTEN与VEGF表达呈负相关（γ=-03948,P=0.0018）结论 PTEN、VEGF的异常表达可能与LSCC的发生、发展和预后有关.     

微卫星不稳定和错配修复基因异常在喉鳞状细胞癌中相关性研究

目的 研究喉鳞状细胞癌中微卫星不稳定（microsatellite instability,MSI）发生的临床意义及其与错配修复基因（mismatch repair gene,MMR）表达的相关性。方法 50例喉鳞状细胞癌患者的石蜡切片选自北京同仁医院2002年至2003年的手术标本,利用显微切割-多聚酶链反应-单链长度多态性分析-银染的方法进行MSI的检测,统计MSI的发生率及其与临床资料的相关性,应用免疫组织化学观察MMR中hMLH1和hMSH2的表达。五个微卫星位点位于染色体1P,3p,5q,9p,17p上,分别临近BCAR3（breast cancer anti-estrogen resistance3）,FHIT,APC,CDKN2A（p16）,TP53等基因。结果 在五个微卫星位点（D17S796,D3S3544,D5S656,D1S375,D9S162）提供统计信息的病例数分别是44,42,45,44和40例。MSI的发生率低于杂合性缺失（loss of heterozygosity,LOH）的发生率。MSI的发生率分别是：D17S796（TP53）20．5％（9／44）,D3S3544（FHIT）14．3％（6／42）,D5S65631．1％（14／45）,D1S375（BCAR3）20．5％（9／44）,D9S162（CDKN2A）15．0％（6／401。MSI的发生与年龄、性别、吸烟史、肿瘤部位、肿瘤分化、TNM分期的关系没有统计学意义（P〉0．05）,但是与肿瘤复发的相关性具有统计学意义（P〈0．01）。MSI的发生与MMR的表达存在相关性（P〈0．01）。MMR阳性细胞和阴性细胞共存在同一张切片内是MMR免疫组织化学的特点。结论 微卫星不稳定和错配修复基因异常可能参与部分喉鳞状细胞癌的发生,微卫星不稳定可能是喉鳞癌复发的特征性指标。     

基质金属蛋白酶MMP20与喉癌的浸润和转移

目的探讨基质金属蛋白酶MMP20与喉癌浸润和转移的关系.方法用RT-PCR和免疫组化的方法,研究MMP20在喉癌组织和其相邻的正常黏膜组织的差异表达量,分析其表达与喉癌浸润和转移的关系.数据分析借助SPSS10.0软件完成.结果 36例配对标本中MMP20基因在31例喉癌组织中的表达与其相应的正常黏膜组织差异表达不明显,而在5例喉癌组织中差异表达明显;MMP20蛋白绝大多数在癌巢细胞浆内表达（占93.2%,68/73）,少数主要在细胞核内表达（占6.8%,5/73）,MMP20蛋白在大多数喉癌组织中的表达明显高于其相应的正常黏膜组织;有淋巴结转移病例中,MMP20蛋白表达差异明显的病例数高于没有淋巴结转移者（P=0.023）;5例MMP20蛋白喉癌组织细胞核内表达中有4例与淋巴结转移有关.结论 MMP20蛋白在喉癌的淋巴结转移中起着重要的作用;MMP20蛋白的过度表达可作为喉癌淋巴结转移的标志.     

细胞周期蛋白G2在喉癌中的表达

目的探讨细胞周期蛋白G2(Cyclin G2)的表达与喉鳞状细胞癌的关系。方法收集2000年1月～2000年12月共81例喉鳞状细胞癌患者的临床资料和石蜡块,用免疫组化方法检测肿瘤组织、喉癌旁黏膜Cyclin G2表达:并分析Cyclin G2的表达与喉癌患者年龄、性别、临床分期、肿瘤分化程度以及预后等的关系。统计学分析采用SPSS12.0软件。结果Cyclin G2在喉癌中阳性表达率为67.9%,并随分化程度的降低而降低,有、无淋巴结转移者阳性率分别为38.4%和73.5%,差异均具有显著性(P>0.05)。结论Cyclin G2表达强度与喉癌的恶性程度及发展趋势明显负相关,可作为预测喉癌预后的生物学指标之一。     

凋亡抑制蛋白Livin在喉癌中的表达和意义

目的研究凋亡抑制蛋白Livin在喉癌周黏膜、喉不典型增生和喉鳞状细胞癌(简称喉癌)组织中的表达以及与喉癌各临床因素的相关性。方法采用免疫组织化学SP法检测10例喉癌周黏膜,12例喉不典型增生和61例喉癌中Livin蛋白的表达,分析其与喉癌发生、发展及预后的关系。结果Livin在喉癌中阳性表达率为67.21%(41/61);在喉不典型增生中为25% (3/12);在喉癌周黏膜中表达阴性。在喉癌组中Livin高表达与临床分期、T分期、病理分化程度呈显著相关(P<0.05);与年龄、部位、淋巴转移无显著相关(P>0.05),随访发现该蛋白的表达与患者5年生存率无显著相关(P>0.05)。结论凋亡抑制蛋白Livin在喉癌的发生、发展中起着重要作用,尚不能作为判断患者预后的一项指标,该基因有望成为喉癌基因治疗的一个新的有效的靶点。     

喉鳞状细胞癌与端粒酶亚单位表达

目的 检测喉鳞状细胞癌（简称喉鳞癌）相关组织中端粒酶亚单位（端粒酶逆转录酶、端粒酶相关蛋白1和端粒酶RNA组分hTR）mRNA的表达,研究不同的端粒酶亚单位的表达与喉鳞癌发生的关系。方法 对34例喉鳞癌病例,采用逆转录聚合酶链（RT-PCR）技术检测上述三种端粒酶亚单位在喉癌组织、对应的癌旁组织和转移淋巴结中的mRNA表达。结果 喉癌组织、对应癌旁组织和转移淋巴结中端粒酶逆转录酶mRNA的阳性率分别为88．2％（30／34）、5．9％（2／34）和90．0％（9／10）,三种组织的阳性率间存在显著性差异（P〈0．05）,喉癌组织和转移淋巴结组织的阳性率显著高于癌旁组织（P〈0．05）。端粒酶相关蛋白1和端粒酶RNA组分mRNA在喉癌组织、对应癌旁组织和转移淋巴结中的阳性率均为100％。结论 本研究结果提示端粒酶依赖途径是喉鳞癌发生的方式之一。与端粒酶相关蛋白1和端粒酶RNA组分比较,端粒酶逆转录酶表达的上调在端粒酶依赖途径的喉鳞癌的发生中占有更重要的地位。     

CD105标记微血管密度与喉癌临床病理特征相关性

目的探讨喉鳞状细胞癌血管生成与各临床病理特征的关系。方法应用CD105单克隆抗体进行免疫组化SABC法检测54例喉癌组织中微血管密度(intratumormicrovesseldensity,IMVD)。结果54例喉癌组织中IMVD为8.854.50,T3和T4级喉癌组织IMVD(10.734.33)明显高于T1和T2级(6.803.68),其差异有显著性意义(P<0.01)。颈淋巴结转移组IMVD(12.873.39)明显高于非转移组(6.092.73),差异有显著性意义(P<0.01)。术后复发者组IMVD值(11.934.55)高于无复发者组(8.324.32),差别有意义(P<0.05)。结论CD105标记IMVD与喉癌T分级、颈淋巴结转移和肿瘤复发密切相关,可能是喉癌患者的一个独立的预后指标。