融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导小鼠的免疫应答及其保护力

目的研究融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导的小鼠体液和细胞免疫应答水平。方法以106CFU/0.1 mL重组M.S通过尾静脉途径免疫小鼠。用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原,用ELISA法测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。取部分免疫小鼠脾淋巴细胞,体外用ESAT6-CFP10融合蛋白刺激后,以MTT比色法检测淋巴细胞增殖反应,同时检测免疫小鼠IFN-γ和IL-2水平及脾细胞杀伤效应。结果融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠血清特异性抗体的滴度为1∶6 400。淋巴细胞刺激增殖指数为2.8,明显高于生理盐水组(0.90);IFN-γ和IL-2的含量分别为2230±11 pg/mL和221±17 pg/mL,显著高于生理盐水对照组,但不及BCG免疫组;同时重组耻垢分枝杆菌诱导的脾细胞杀伤率为45%。结论融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌能诱导小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答,可作为结核新型疫苗使用。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的高效表达及免疫原性研究

目的高效表达结核分枝杆菌6kDa早期分泌性抗原靶（6kDa early secretory antigenic target,ESAT6）和培养滤液蛋白10（culture filtrate protein 10,CFP10）的融合蛋白,通过免疫动物,获得CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板,扩增cfp10-esat6融合基因,将其与表达质粒pET32a（＋）构建成重组质粒pET—cfp10-esat6。在大肠杆菌BL21（DE3）中表达带组氨酸标签的融合蛋白,经亲和层析得到纯化CFP10-ESAT6蛋白。用该蛋白免疫成年家兔,获得的抗CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体,作Western—blot和ELISA分析。结果重组质粒pET—cfp10-esat6构建成功,融合蛋白CFP10-ESAT6大量表达,多克隆抗体制备成功（1：10^4）。结论成功构建并表达了CFP10-ESAT6融合蛋白,制备了大量的CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体,为发展新型结核病疫苗和临床血清学检测奠定了实验基础。     

结核分枝杆菌CFP10和ESAT6优势肽段融合蛋白的表达及其免疫学研究

目的：构建结核分枝杆菌分泌蛋白的重组质粒及工程菌,获得纯化的CFP10-ESAT6P蛋白抗原,制备初步用于检测结核病患者的特异性抗体。方法：根据编码结核分枝杆菌基因序列设计引物,克隆表达结核CFP10-ESAT6重组蛋白,表达产物免疫新西兰大白兔,其中80％可产生高价的抗体。利用产物建立IgG间接ELISA方法鉴定其抗原性及实用性。结果：应用ELISA法,通过检测113例结核病患者、82例非结核病患者及健康献血员,CFP10-ESAT6P和对照PPD对结核病患者血清检测的敏感性分别为89．4％和79．6％,特异性分别为96．3％和93．9％。结论：高效表达纯化的CFP10-ESAT6蛋白抗原性强,可用于结核病患者抗体的检测,用于结核病的辅助诊断。     

结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响

目的研究结核分枝杆菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响。方法H37Rv菌株感染小鼠巨噬细胞后加入纯化的重组ESAT6-CFP10融合蛋白,通过透射电镜检测自噬体的形成。提取细胞总RNA和蛋白,以实时定量RT-PCR及Western blot方法检测自噬相关基因(atg)分子水平和蛋白表达水平。结果ESAT6-CFP10融合蛋白可抑制小鼠巨噬细胞自噬体的形成,并导致atg分子表达水平下降,其中atg8表达量下降最为明显。结论MTB ESAT6-CFP10融合蛋白通过调控atg分子表达水平影响小鼠巨噬细胞自噬功能。     

结核分枝杆菌1hp-esat6融合基因原核表达载体的构建和表达

目的：构建结核分枝杆菌(MTb)1hp—esat6融合基因及其原核表达载体并进行表达。方法：用Gene SOEing法，将1hp基因和esat6基因体外重组，构建融合基因，克隆入pQE30质粒中进行表达。结果：构建的融合基因经测序证实完全正确，重组体转化表达菌DH5α后，经过IPTG诱导，表达出26kDa左右的CFP10-ESAT6融合蛋白。SDS—PAGE分析显示，IPTG诱导4h表达量最高，表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中，表达量占全菌蛋白质的40％，Western blotting证实其有良好的抗原性。表达蛋白经过Ni—NTA柱纯化后，获得了纯度为98%的重组蛋白。结论：成功构建MTb 1hp—esat6融合基因，成功构建原核表达载体pQE30-CFP10-ESAT6，并获得重组CFP10-ESAT6融合蛋白，为MTb重组抗原的应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌差异蛋白MPT64与ESAT6的融合表达与纯化

目的: 融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64-ESAT6,为结核病的预防提供可供选择的有效亚单位疫苗. 方法: 设计含不同酶切位点的mpt64和esat6引物,采用PCR的方法从结核分枝杆菌毒株H37Rv-DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段,将片段分别与T-easy载体连接测序. 将测序正确的mpt64和esat6按照不同的酶切位点克隆入pPro-EX HT表达载体,挑选出阳性克隆,将诱导的表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳分析,同时与6×His的mAb进行Western-blot分析,并用Ni-NTA亲合柱纯化表达产物. 结果: PCR获得的mpt64和esat6序列与GenBank报道的完全一致. 两者在大肠杆菌DH5α株中融合表达的产物Mr为38×103,与预计大小相吻合. Western-blot结果显示,在Mr约38×103处有表达产物与6×His mAb特异性结合带. 表达产物为包涵体,通过Ni-NTA纯化系统,可得到纯化的目的蛋白. 结论: 结核分枝杆菌的分泌蛋白MPT64和ESAT6被成功的融合表达,有望为结核的临床判定提供有效的诊断试剂.     

ESAT6抗原DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答

目的:构建结核杆菌ESAT6抗原DNA疫苗,并观察其在BALB/c小鼠体内诱导的免疫应答.方法:构建结核杆菌ESAT6抗原DNA疫苗pVAX-ESAT6,并将其肌肉注射免疫BALB/c雌性小鼠,用ELISA方法检测小鼠的血清抗体(IgG、IgG2a/IgG1)水平,并在体外用特异抗原刺激小鼠脾细胞,检测其分泌细胞因子(IFN-γ、IL-4)的水平;用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定小鼠细胞毒性T淋巴细胞反应.结果:pVAX-ESAT6 DNA疫苗诱导了抗原特异的体液免疫应答和细胞免疫应答,抗体亚型检测显示IgG2a与IgG1的比值为(2.28±0.4),脾细胞分泌的细胞因子水平检测显示IFN-γ的水平(360士45 Pg/ml)高于IL-4的水平(124±16 Pg/m).结论:成功地构建了pVAX-ESAT6 DNA疫苗,它能在小鼠中诱导抗原特异的免疫应答,应答类型以Th1型占优势.     

重组结核分枝杆菌ESAT6-PPE68融合蛋白的制备

目的 构建结核分支杆菌esat6-ppe68融合基因及其原核表达载体,在大肠杆菌中表达融合蛋白ESAT6-PPE68.方法 用基因拼接(GeneSOEing)法扩增esat6-ppe68融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGesat6-ppe68.重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后转化宿主菌大肠杆菌BL21,IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)诱导表达约69 000带谷胱苷肽硫转移酶蛋白(GST)标签的正SAT6-PPE68融合蛋白,经谷胱苷肽-硫-转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化的融合蛋白,产物进行SDS-PAGE电泳、Western-blotting鉴定.结果 重组质粒pGesat6-ppe68中目的基因测序结果与报道序列完全相同;在大肠杆菌中以可溶性非包涵体形式表达;表达量约占菌体总蛋白的40%,表达蛋白纯化后获得纯度为90%左右的重组蛋白;Westernblotting结果证实重组蛋白与确诊的结核病患者血清发生特异免疫反应.结论 成功构建了原核表达载体pGesat6-ppe68,获得了rESAT6-PPE68融合蛋白,为rESAT6-PPE68融合蛋白在结核病诊断中的应用奠定了基础.     

以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的酶联免疫斑点技术在脊柱结核感染辅助诊断中的应用价值

目的评价以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的酶联免疫斑点(ELISPOT)技术在脊柱结核感染辅助诊断中的应用价值。方法选取2012年5月至2013年12月广州中医药大学第一附属医院脊柱骨科和南方医科大学南方医院脊柱骨科收治的疑似脊柱结核患者91例,根据临床和细菌性诊断结果分为脊柱结核组(n=52)和对照组(n=39)。采用ELISPOT试验检测脊柱结核组和对照组外周血单个核细胞,观察斑点形成细胞的数量。患者同时接受结核菌素(PPD)皮肤试验、血清抗结核抗体检测、病灶病理学检查、抗酸杆菌涂片和病灶结核分枝杆菌培养,比较不同检测方法的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值,分析不同检测结果的一致性。结果 52例脊柱结核患者中共47例接受病灶活检穿刺病理检查,其中41例病理证实为结核。ELISPOT试验在脊柱结核诊断中的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为82.7%、87.2%、89.6%和79.1%;PPD皮肤试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为61.5%、46.2%、60.4%和47.4%;血清抗结核抗体试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为55.8%、61.5%、65.9%和51.1%。在脊柱结核患者中,ELISPOT试验的阳性率显著高于PPD皮肤试验(82.7%比61.5%,χ2=5.786,P=0.016)和血清抗结核抗体试验(82.7%比55.8%,χ2=8.847,P=0.003),与病理学检查比较差异无统计学意义(82.7%比87.2%,χ2=0.396,P=0.529)。ELISPOT试验与病理学检查一致性较好(87.2%,κ=0.498,P=0.001)。结论以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的ELISPOT法应用于脊柱结核诊断有良好的敏感性和特异性,可作为脊柱结核感染辅助诊断的有效方法。     

结核分枝杆菌lhp-esat6融合基因原核表达载体的构建和表达

目的 :构建结核分枝杆菌 (MTb) 1hp -esat6融合基因及其原核表达载体并进行表达。方法 :用GeneSOEing法 ,将1hp基因和esat6基因体外重组 ,构建融合基因 ,克隆入pQE30质粒中进行表达。 结果 :构建的融合基因经测序证实完全正确 ,重组体转化表达菌DH5α后 ,经过IPTG诱导 ,表达出 2 6kDa左右的CFP10 -ESAT6融合蛋白。SDS -PAGE分析显示 ,IPTG诱导 4h表达量最高 ,表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中 ,表达量占全菌蛋白质的 4 0 % ,Westernblotting证实其有良好的抗原性。表达蛋白经过Ni-NTA柱纯化后 ,获得了纯度为 98%的重组蛋白。结论 :成功构建MTblhp -esat6融合基因 ,成功构建原核表达载体pQE30 -CFP10 -ESAT6 ,并获得重组CFP10 -ESAT6融合蛋白 ,为MTb重组抗原的应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白的原核表达、纯化及ELISPOT检测方法的建立与应用

以结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白原核表达、纯化体系为基础,建立稳定的ELISPOT方法;检测164份疑似结核患者标本的外周血ELISPOT,与临床诊断及T-SPOT·TB结果对比. 表达所得重组蛋白浓度和纯度如下:CFP10 为0. 5 mg/ml,84%;ESAT6为4 mg/ml,98%. ELISPOT方法最佳实验条件为每孔细胞密度2 × 105/孔,CFP10、ESAT6蛋白抗原浓度分别为10 μg/孔,细胞孵育时间20 h. ELISPOT的灵敏度与特异度分别为88. 50%、82. 35%,检测结果与 T-SPOT·TB 方法结果一致(χ2 =0. 57).     

分泌性表达融合蛋白CFP10-ESAT6重组卡介苗构建研究

目的构建分泌表达融合蛋白CFP10-ESAT6的重组卡介苗。方法采用基因拼接（Gene SOEing）法，体外扩增结核杆菌CFP10-ESAT6融合基因，插入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG3000，构建重组穿梭表达质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6，用电穿孔法将pBCG3000-CFPIO-ESAT6质粒转化BCG细胞，得到重组卡介苗，热诱导表达CFPIO—ESAT6融合蛋白，SDS—PAGE电泳观察CFP10-ESAT6融合蛋白的表达，Western blot鉴定其生物活性。结果经PCR、酶切及测序鉴定，证实成功构建重组质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6，经热诱导表达出约22kDa的CFP10-ESAT6蛋白，可分别被鼠抗ESAT6血清、鼠抗CFP10血清识别。结论分泌性表达融合蛋白CFP10-ESAT6的重组卡介苗构建成功。     

结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及其保护力

目的: 研究Ag85B与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护力.方法: 采用皮下包埋的方法,将预先转移到硝酸纤维素膜上的表达蛋白免疫小鼠3次,每次间隔2 wk,用MTB培养上清滤液蛋白(culture filtrate proteins, CFP)作为抗原,ELASA测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度.为了检测融合蛋白免疫小鼠引起的细胞免疫应答,最后一次免疫完成后4 wk,取一部分免疫小鼠分离脾淋巴细胞,体外用抗原刺激,MTT法检测淋巴细胞刺激反应,ELISA检测悬液中IFN-γ水平. 另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4 wk后计数脾脏细菌负荷数. 结果: Ag85B-ESAT6 蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1: 1000,ESAT6-Ag85B 蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1: 5000. 融合蛋白Ag85B-ESAT6和ESAT6-Ag85B免疫组淋巴细胞刺增殖指数分别为2.40±0.17 和2.60±0.25,而生理盐水组只有0.90±0.21;相对应的IFN-γ含量分别为(3.51±0.30) μg/L和(4.05±0.41) μg/L,显著高与生理盐水对照组(0.50±0.25) μg/L, P<0.05,但不及BCG免疫组(5.55±0.31) μg/L. 与生理盐水免疫组(细菌负荷6.31±0.13)相比较,融合蛋白免疫的BALB/c小鼠,对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用(细菌负荷分别为5.04±0.11和5.15±0.29, P<0.05),但与BCG免疫组相比脾脏细菌负荷减少甚微. 结论: Ag85B与ESAT6融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分.     

以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的酶联免疫斑点技术在脊柱结核感染辅助诊断中的应用价值

目的 评价以CFP10／ESAT6融合蛋白为抗原的酶联免疫斑点(ELISPOT)技术在脊柱结核感染辅助诊断中的应用价值。方法 选取2012年5月至2013年12月广州中医药大学第一附属医院脊柱骨科和南方医科大学南方医院脊柱骨科收治的疑似脊柱结核患者91例,根据临床和细菌性诊断结果分为脊柱结核组(n=52)和对照组(n=39)。采用ELISPOT试验检测脊柱结核组和对照组外周血单个核细胞,观察斑点形成细胞的数量。患者同时接受结核菌素(PPD)皮肤试验、血清抗结核抗体检测、病灶病理学检查、抗酸杆菌涂片和病灶结核分枝杆菌培养,比较不同检测方法的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值,分析不同检测结果的一致性。结果 52例脊柱结核患者中共47例接受病灶活检穿刺病理检查,其中41例病理证实为结核。ELISPOT试验在脊柱结核诊断中的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为82.7%、87.2%、89.6%和79.1%;PPD皮肤试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为61.5%、46.2%、60.4%和47.4%;血清抗结核抗体试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为55.8%、61.5%、65.9%和51.1%。在脊柱结核患者中,ELISPOT试验的阳性率显著高于PPD皮肤试验(82.7%比61.5%,χ²=5.786,P=0.016)和血清抗结核抗体试验(82.7%比55.8%,χ²=8.847,P=0.003),与病理学检查比较差异无统计学意义(82.7%比87.2%,χ²=0.396,P=0.529)。ELISPOT试验与病理学检查一致性较好(87.2%,κ=0.498,P=0.001)。结论 以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的ELISPOT法应用于脊柱结核诊断有良好的敏感性和特异性,可作为脊柱结核感染辅助诊断的有效方法。     

结核分枝杆菌MPT64-ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及其保护力

目的:测定MPT64与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力. 方法:将MPT64与ESAT6的融合蛋白皮下免疫小鼠3次,每次间隔2 wk,ELISA测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度. 最后一次免疫完成后4 wk,分离部分免疫小鼠脾淋巴细胞,MTT法检测淋巴细胞刺激指数,ELISA检测悬液中IFN-γ水平. 另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4 wk后计数脾脏细菌负荷数. 结果:MPT64-ESAT6融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度1∶ 1500,免疫小鼠后淋巴细胞刺激增殖指数为2.23,而生理盐水免疫组只有0.88;脾淋巴细胞悬液中诱发的IFN-γ为(4.28±0.27)μg/L,显著高于生理盐水免疫组[(0.48±0.17) μg/L,P<0.05],但不及BCG免疫组[(5.18±0.31)μg/L]. 与生理盐水免疫组(细菌负荷6.45±0.17)相比较,融合蛋白免疫的小鼠,对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用,细菌负荷为5.04±0.11,但与BCG免疫组相比脾脏细菌负荷减少甚微(细菌负荷4.38±0.22). 结论:MPT64与ESAT6融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分.     

结核分枝杆菌H37 Ra菌株ESAT6基因的克隆及序列分析

目的:从结核分枝杆菌H37Ra菌株克隆早期分泌性抗原靶6(ESAT6)基因并进行序列分析。方法:以结核分枝杆菌H37Ra菌株基因组DNA为模版,用PCR方法扩增ESAT6基因,将扩增产物连接到克隆载体pTG19-T中,并用PCR、单双酶切和测序进行鉴定,以BLAST软件进行序列比对分析。结果:从结核分枝杆菌H37Ra株成功克隆了ESAT6基因,测序表明该片段由288 bp组成,与GenBank所报告的H37Rv基因相比同源性为100%。结论:成功克隆了H37Ra株ESAT6编码基因,其序列与H37Rv标准株ESAT6编码基因完全一致。