沉默STAT1基因增强放射抗拒鼻咽癌CNE-2R细胞放射敏感性

目的 研究基因STAT1沉默对人放射抗拒鼻咽癌细胞放射敏感性的影响.方法 慢病毒介导的STAT1基因转染放射抗拒鼻咽癌细胞CNE-2R,荧光定量RT-PCR技术检测沉默效果.MTT法检测转染前后细胞增殖活性,流式细胞技术检测细胞周期及凋亡,克隆形成实验检测转染前后细胞放射敏感性变化.结果 慢病毒转染后放射抗拒鼻咽癌细胞STAT1表达降低(F=429.87,P<0.05)、细胞生长抑制(F3=.88~4.63,P<0.05)、凋亡率增加(F=38.13,P<0.05)、放射敏感性增加(F=252.80,P<0.05)、细胞周期中G₀/G₁、S和G₂/M期未见明显差异(P>0.05).结论 沉默STAT1基因能增加放射抗拒鼻咽癌细胞 CNE-2R的放射敏感性.     

RNA干扰抑制c-jun基因表达对放射抗拒人鼻咽癌细胞系CNE-2R放射敏感性的影响

目的 利用RNA干扰技术抑制放射抗拒人鼻咽癌细胞系CNE-2R中高表达的c-jun基因,研究其对CNE-2R细胞放射敏感性的影响及其潜在机制.方法 设计合成3组特异性针对c-jun基因的siRNA,构建慢病毒vshRNA载体,感染CNE-2R细胞,采用RT-PCR和Western blot方法检测各组对目的基因的抑制效果;并通过克隆形成实验测定其放射敏感性,CCK-8实验检测细胞的存活能力,流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 重组慢病毒c-jun-RNAi-LV2能明显下调CNE-2R细胞中c-jun的mRNA和蛋白水平的表达(F=217.20、42.07, P<0.05).6 MV X射线联合c-jun-RNAi-LV2组在0、2、4、6和8 Gy照射后细胞的吸光度值均显著低于未转染组和阴性对照组(F=42.70~200.67, P<0.05).克隆形成实验显示,c-jun-RNAi-LV2组与未转染组及阴性对照组相比,SF₂、D₀和D_q值均减小,放射增敏比(SER_D0)为1.41.细胞凋亡实验结果显示,未经照射的c-jun-RNAi-LV2组与联合2 Gy照射的凋亡率分别为(20.93±1.99)%和(38.17±0.83)%,均高于未转染组和阴性对照组的凋亡率[0 Gy:(10.97±0.70)%和(20.43±0.25)%;2 Gy:(10.80±1.25)%和(19.53±1.50)%;F=50.54、330.14, P<0.05].结论 RNA干扰技术可有效抑制放射抗拒人鼻咽癌细胞系CNE-2R中高表达的c-jun基因,使细胞放射敏感性增高,其作用可能与c-jun基因的下调使细胞增殖能力减弱,细胞凋亡增多有关.     

自噬抑制剂磷酸氯喹增加鼻咽癌CNE-2细胞株的放射敏感性

目的 探讨自噬现象在照射致人鼻咽低分化鳞癌(CNE-2)细胞死亡过程中的作用。方法 采用Western blot技术检测CNE-2细胞经射线照射后自噬标志物LC3、P62的变化,透射电镜检测自噬小体;流式细胞术检测CNE-2细胞凋亡率;MTT法检测CNE-2细胞照射后不同时间的存活率;细胞克隆形成实验检测CNE-2细胞的存活能力及放射敏感性。结果 透射电镜检测示自噬抑制剂磷酸氯喹(CDP)抑制照射所致自噬体的形成,自噬诱导剂雷帕霉素(RAPA)增加照射致自噬体数量(F=105.15,P<0.05);CDP抑制射线引起的LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化,而RAPA促进LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化(F=231.68,P<0.05);CDP使P62表达上调,RAPA使P62表达下调(F=117.52,P<0.05);CDP+照射组和RAPA+照射组的CNE-2细胞凋亡率明显高于单纯照射组(F=143.72,P<0.05);CDP、RAPA降低了照射后CNE-2细胞的存活率(F=25.88,P<0.05);二次线性模型拟合剂量存活曲线示自噬抑制剂CDP、RAPA可增加CNE-2细胞株的放射敏感性(F=167.32,P<0.05)。结论 照射联合自噬抑制剂CDP显著增加了CNE-2细胞株对射线的敏感性,提示自噬抑制剂或可用于鼻咽癌的辅助治疗。     

3-甲基腺嘌呤增强食管鳞癌Eca-109细胞放射敏感性的研究

目的 研究自噬在照射致人食管鳞癌Eca-109细胞死亡过程中的作用。方法 选用食管鳞癌Eca-109细胞,分为对照组、5 mmol/L给药组、10 mmol/L给药组、单纯照射组、照射+5 mmol/L组、照射+10 mmol/L组,共6组。采用Western blot检测不同处理组自噬标志物LC3B表达水平;GFP-LC3转染食管鳞癌Eca-109细胞后监测自噬体数量变化;MTT法检测不同处理组细胞活力;荧光染料Hoechst 33342观察不同处理组细胞凋亡的形态学变化;流式细胞术检测不同处理组细胞周期和细胞凋亡;克隆形成实验检测食管鳞癌Eca-109细胞不同处理组放射敏感性。结果 Western blot显示,照射后自噬水平升高,自噬抑制后LC3BⅡ和LC3BⅡ/LC3BⅠ比值明显下降(F=25.64,P<0.05);GFP-LC3转染食管鳞癌Eca-109细胞后,可见照射后自噬体荧光斑点明显增多,自噬抑制后自噬体明显减少(F=127.36,P<0.05);抑制自噬协同照射后细胞活力明显低于单纯照射组(F=129.54,P<0.05);抑制自噬后也增加了照射诱导的凋亡率和G₂/M期阻滞细胞比;线性二次模型拟合剂量存活曲线显示,抑制自噬能增加食管鳞癌Eca-109细胞的放射敏感性。结论 抑制自噬能提高食管鳞癌Eca-109细胞的放射敏感性,协同杀伤肿瘤细胞,提示抑制自噬或可用于辅助食管鳞癌的放射治疗。     

ZEB1通过上调ATM表达调控胃癌细胞AGS的放射敏感性

目的 探究锌指结构E-box结合蛋白1（ZEB1）对胃癌细胞AGS放射敏感性的影响并探究其可能的作用机制。方法 通过不同剂量（0、2、4、6、8 Gy）X射线照射AGS细胞,蛋白质印迹法（Western blot）实验观测细胞中ZEB1的表达量;取对数生长期AGS细胞,将过表达ZEB1、ZEB1干扰表达质粒以及相应的对照质粒（pcDNA3.1）和阴性对照干扰质粒转染至AGS细胞中,分别记为过表达ZEB1组、沉默ZEB1组、对照组和阴性对照组,细胞克隆实验检测过表达和沉默ZEB1对AGS细胞存活率的影响;流式细胞术实验检测细胞的凋亡率;Western blot检测细胞损伤相关组蛋白H2A（H2AX）、磷酸化H2AX（γ-H2AX）以及毛细血管扩张突变基因（ATM）表达量。结果 ZEB1在AGS细胞中的表达对放射剂量具有依赖性（F=58.57,P<0.05）;过表达ZEB1能够提高AGS细胞的存活,抑制γ-H2AX表达（t=12.18,P<0.05）,并阻碍细胞的凋亡（t=7.27,P<0.05）,并随时间上调ATM表达量（F=165.70,P<0.05）;沉默ZEB1降低AGS细胞的存活,增加γ-H2AX表达（t=12.88,P<0.05）和细胞的凋亡（t=8.36,P<0.05）,随时间下调ATM表达量（F=44.80,P<0.05）。结论 ZEB1通过上调ATM表达调控胃癌AGS细胞放射敏感性。     

沉默细胞周期检测点激酶1(Chk1)对宫颈癌HeLa细胞放射敏感性的影响

目的 探讨siRNA沉默细胞周期检测点激酶1（Chk1）基因对宫颈癌HeLa细胞放射敏感性的影响。方法 合成Chk1基因的小分子干扰RNA（si-Chk1）,将si-NC或者si-Chk1分别转染到宫颈癌HeLa细胞中,0、2、4、6、8、10 Gy剂量的X射线照射细胞,RT-qPCR和Western blot检测转染后Chk1的mRNA水平和蛋白水平的表达,MTT方法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡,克隆形成实验检测转染后HeLa细胞放射敏感性,Western blot检测转染后P21蛋白和抗凋亡基因Bcl-2蛋白的表达水平。结果 si-Chk1转染到HeLa细胞后,HeLa细胞Chk1基因的mRNA和蛋白表达水平均显著下降（t=2.12~5.86,P<0.05）,沉默Chk1的表达抑制了宫颈癌HeLa细胞的增殖（t=3.15~6.36,P<0.05）,同时降低宫颈癌HeLa细胞克隆形成能力（t=1.58~6.36,P<0.05）,上调P21（t=4.35,P<0.05）、下调Bcl-2蛋白（t=2.37,P<0.05）的表达水平。结论 siRNA沉默Chk1表达能够增强HeLa细胞放射敏感性。     

雌激素受体诱导乳腺癌细胞辐射抗性的机制研究

目的 探讨雌激素受体(ESR1)对乳腺癌细胞辐射抗性的影响及分子机制。方法 在雌激素受体阴性乳腺癌细胞中转染ESR1过表达质粒(过表达对照vector组、过表达ESR1 OE组),在雌激素受体阳性乳腺癌细胞中通过慢病毒转染方法构建稳定敲低ESR1(敲低对照shNC组、敲低shESR1组)的细胞模型,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)和免疫印迹方法检测自噬相关基因mRNA(ATG5)和蛋白表达水平(LC3B-I、LC3B-II、P62、FIP200、ATG5、ATG7、ATG12、Beclin1、ULK1);在8 Gy X射线的电离辐射处理下,免疫印迹法检测自噬通量;采用流式细胞术检测细胞死亡;采用集落形成实验检测乳腺癌细胞辐射敏感性(未照射sham组、照射IR组、电离辐射联合铁死亡抑制剂处理Fer-1+IR组、电离辐射联合凋亡抑制剂处理Z-VAD+IR组、电离辐射联合自噬抑制剂处理CQ+IR组);用台盼蓝染色检测自噬基因敲低和过表达细胞模型以及雌激素受体抑制剂他莫昔芬(TAM)与电离辐射联合治疗下乳腺癌细胞的死亡率(他莫昔芬未处理TAM-组、他莫昔芬处理TAM+组)。结果 在8 Gy X射线照射后24 h处理条件下,雌激素受体阳性乳腺癌ZR75细胞ESR1的敲低促进细胞死亡(t=3.49、3.13, P < 0.05),而雌激素受体阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞ESR1的过表达抑制细胞死亡(t=4.16、7.48, P < 0.05);与单纯照射相比,自噬抑制剂氯喹的处理后增加了敲低ESR1的ZR75细胞集落形成数量(t=8.49, P < 0.05), 抑制自噬可以减少沉默ESR1所致的ZR75细胞死亡。在电离辐射处理下,MDA-MB-231细胞过表达ESR1促进了细胞保护性自噬;ZR75细胞敲低ESR1后细胞保护性自噬降低。在ZR75细胞中敲低ATG5发现自噬降低,细胞死亡增加(t=4.19、6.39, P < 0.05),而在ZR75中过表达ATG5可以逆转因敲低ESR1导致的细胞死亡增加(t=1.70、4.65, P < 0.05)。化疗药物他莫昔芬处理雌激素受体阳性乳腺癌细胞ZR75后发现自噬基因ATG5、ATG12的表达下降,自噬抑制,细胞死亡增加(t=18.70, P < 0.05),电离辐射处理促进了这一进程(t=16.82, P < 0.05)。结论 雌激素受体ESR1通过增加ATG5自噬相关蛋白,促进雌激素受体阳性乳腺癌细胞的保护性自噬,从而导致雌激素受体阳性乳腺癌细胞的辐射抵抗,化疗药物他莫昔芬联合电离辐射治疗增加了雌激素受体阳性乳腺癌细胞的辐射敏感性。     

鼻咽癌细胞放射敏感性的比较蛋白质组学研究

目的 探讨与鼻咽癌细胞放射敏感性相关的并可能预测鼻咽癌细胞放射敏感性的蛋白质。方法 以人鼻咽癌细胞株CNE-2诱导建立放射抗拒的鼻咽癌细胞株CNE-2(R743),通过克隆形成实验及流式细胞术检测以比较CNE-2和CNE-2(R743)细胞的放射敏感性及细胞周期的特征。提取细胞总蛋白质,进行双向凝胶电泳,Image Master 7.0图像分析软件分析图谱以识别差异蛋白质点,MALDI-TOF/TOF肽质量指纹图谱分析,蛋白质质谱数据库搜索鉴定差异蛋白。应用RT-PCR和Western blot验证2种细胞中相关差异蛋白的表达。 结果 得到7个差异表达较显著的蛋白质,与CNE-2相比较,CNE-2(R743)细胞中6个上调,1个下调。Western blot及 RT-PCR证实膜联蛋白A2、原肌球蛋白及糖调节蛋白78在CNE-2(R743)的表达均上调(t=24.22、24.20和29.19,P<0.05),与蛋白质组学结果一致。结论 不同放射敏感性鼻咽癌细胞存在差异表达的蛋白质,其中膜联蛋白A2、原肌球蛋白及糖调节蛋白78有可能成为预测鼻咽癌细胞放射敏感性的候选生物标志物。     

Musashi1基因表达对人结肠癌HCT116细胞的放射增敏作用及其机制

目的 研究沉默Musashi1对人结肠癌HCT116细胞放射敏感性的影响,为放射治疗提供新的增敏靶点。方法 用慢病毒载体建立Musashil（Msi1）低表达的稳转细胞株及阴性对照细胞株,将细胞分为沉默组、空白对照组和阴性对照组,通过克隆实验、流式细胞技术检测细胞凋亡及细胞周期,证实其放射敏感性。结果 成功构建了沉默Musashi1的HCT116细胞。沉默组的D₀、D_q、N、SF₂分别为1.55、0.88、1.76 Gy和0.43,空白对照组分别为2.17、1.51、2.01 Gy和0.64,阴性对照组分别为1.99、1.45、2.07 Gy和0.62。沉默组相对于空白对照组的放射增敏比为1.40,相对于阴性对照组的放射增敏比为1.28。8 Gy照射后24、48、72 h,沉默组凋亡比例始终高于阴性对照组和空白对照组（F=65.16,P<0.05）,而阴性对照组和空白对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）。12 Gy照射后48 h,沉默组细胞周期中G₂/M期比例较空白对照组和阴性对照组显著下降（F=65.398,P<0.05）。结论 降低Musashi1的表达对人结肠癌HCT116细胞有放射增敏作用,可能通过促进其凋亡,解除G₂/M期阻滞而发挥放射增敏作用,有望成为新的增敏靶点。     

沉默GRAMD1A及抑制STAT5信号通路对肝癌细胞Huh7放射敏感性的影响

目的 探讨沉默GRAMD1A及抑制STAT5信号对肝癌细胞Huh7放射敏感性的影响,旨在为肝癌临床联合治疗提供新思路。方法 慢病素感染构建沉默GRAMD1A的Huh7细胞株,采用qPCR和Western blot进行验证,qPCR和荧光素酶报告实验检测沉默GRAMD1A后对Huh7细胞中STAT5及其下游基因表达的影响;以克隆形成率和细胞凋亡为指标检测沉默GRA株。结果 构建后的Huh7细胞经2 Gy照射后,沉默GRAMD1A联合照射组细胞克隆形成能力较阴性对照联合照射组显著降低,差异有统计学意义（t=8.494,P<0.05）;沉默GRAMD1A联合照射组细胞凋亡较阴性对照联合照射组显著增加,差异有统计学意义（t=3.560,P<0.05）。沉默GRAMD1A后Huh7细胞放射敏感性明显增加,且细胞中STAT5及其下游基因表达显著降低。SH-4-54抑制剂联合照射组较二甲基亚砜联合照射组细胞克隆存活能力显著降低,差异有统计学意义（t=8.660,P<0.05）,SH-4-54抑制STAT5通路后,Huh7细胞放射敏感性显著增加。结论 沉默GRAMD1A可能通过STAT5信号通路增强肝癌细胞Huh7的放射敏感性,表明GRAMD1A在肝癌发生发展中起重要作用,将可能为肝癌靶向治疗及联合治疗提供新靶点。     

鼻咽癌细胞辐射抗拒的比较蛋白质组学分析

目的 通过分离并鉴定具有不同辐射抗拒的人鼻咽癌细胞株CNE-2R与CNE-2的差异表达蛋白,探讨与鼻咽癌细胞辐射抗拒相关的分子机制.方法 分别提取鼻咽癌辐射抗拒细胞株CNE-2R及其亲本细胞株CNE-2的总蛋白,采用双向凝胶电泳分离,经软件分析识别差异表达蛋白点,应用基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱技术(MALDI-TOF-MS)鉴定差异蛋白质.结果 两种不同辐射敏感性的鼻咽癌细胞株CNE-2R和CNE-2中,共筛选出差异表达明显的蛋白质点有32个,其中11个蛋白质被鉴定成功,在CNE-2R中上调的蛋白有3个,下调的蛋白有8个.结论 不同辐射敏感性的鼻咽癌细胞的差异表达蛋白,主要涉及调节凋亡、DNA损伤与修复、细胞周期调控、RNA转录、细胞信号转导、细胞骨架组成及辐射应激反应等多个方面.     

龙葵碱对骨肉瘤细胞放射敏感性的影响

目的 研究龙葵碱对骨肉瘤细胞放射敏感性的影响。方法 用龙葵碱处理骨肉瘤细胞,同时给予6 MV X射线照射,噻唑蓝（MTT）方法测定细胞增殖变化,流式细胞术测定细胞凋亡,Western blot检测细胞中Ki-67、PCNA、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平,JC-1法检测线粒体膜电位,DCFH-DA法检测细胞中ROS水平,平板克隆实验测定放射敏感性。结果 与未经龙葵碱和照射后的细胞比较,龙葵碱或照射处理后骨肉瘤细胞增殖能力和Ki-67、PCNA蛋白水平均降低（F=55.165、50.667、23.389,P<0.05）,细胞凋亡率和Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平均升高（F=54.588、42.924、51.541,P<0.05）,线粒体膜电位下降（F=40.762,P<0.05）,细胞中ROS水平升高（F=79.055,P<0.05）。与龙葵碱或单纯照射的细胞比较,龙葵碱联合照射处理后的骨肉瘤细胞增殖能力和Ki-67、PCNA蛋白水平降低（F=55.165、50.667、23.389,P<0.05）,细胞凋亡率和Bax、Cleaved Caspase-3水平升高（F=54.588、42.924、51.541,P<0.05）,线粒体膜电位降低（F=40.762,P<0.05）,ROS水平升高（F=79.055,P<0.05）。龙葵碱对骨肉瘤细胞的放射增敏比为1.786。结论 龙葵碱抑制骨肉瘤细胞增殖并诱导凋亡,提高骨肉瘤细胞放射敏感性。     

Famitinib enhances nasopharyngeal cancer cell radiosensitivity by attenuating radiation-induced phosphorylation of platelet-derived growth factor receptor and c-kit and inhibiting microvessel formation

Purpose: Famitinib is a novel tyrosine kinase inhibitor. We investigated the effects of famitinib on the radiosensitivity of human nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell radiosensitivity in vitro and in vivo, and explored its possible mechanisms.

Materials and methods: Human nasopharyngeal carcinoma cell line (CNE-2) were treated with famitinib and radiation, and analyzed by3-(4,5-dimethylthaizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), clonogenic survival assay, and Western blot. A xenograft model using CNE-2 cells was established to analyze the effects of famitinib and radiation on tumor volume and microvessel density (MVD).

Results: Famitinib dose-dependently inhibited CNE-2 cells growth and significantly reduced clonogenic survival (p < 0.05), with a sensitivity enhancement ratio (SER) of 1.45. The tumor inhibition rate of the combined treatment group was 91%, which was significantly higher than the radiation group (35%, p < 0.05) and famitinib group (46%, p < 0.05). Famitinib attenuated radiation-induced phosphorylation of the platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) and stem cell factor (c-kit) at 0, 30, 60 min after radiation treatment. Furthermore, radiation combined with famitinib decreased tumor MVD (p < 0.05).

Conclusions: Famitinib significantly increased CNE-2 cell radiosensitivity in vitro and in vivo by attenuating radiation-induced PDGFR and c-kit phosphorylation and by inhibiting microvessel formation.     

尼妥珠单抗及西妥昔单抗增强照射对人食管癌细胞系的作用

目的 观察尼妥珠单抗（h-R3）、西妥昔单抗（C225）联合照射对人食管鳞癌细胞系TE-13的作用。方法 分为无药对照组、h-R3组、C225组、单纯照射组、h-R3联合照射组、C225联合照射组,采用MTS法观察处理组对食管癌细胞增殖的影响,并计算细胞增殖率;采用克隆形成实验检测h-R3、C225对食管癌细胞系放射敏感性的影响,多靶单击模型拟合细胞存活曲线;通过流式细胞仪分析细胞周期分布及细胞凋亡变化。结果 与单纯照射组相比,单抗联合照射组的细胞增殖率明显降低（F=325.59,P<0.05）,细胞凋亡率明显升高（F=120.59,P<0.05）, SF₂、D₀、D_q及N值均显著降低,G₀/G₁、G₂/M期细胞比例均增加,S期细胞比例减少。C225联合照射组的细胞凋亡率高于h-R3联合照射组（F=120.59,P<0.05）,C225联合照射组SER（1.83）高于h-R3联合照射组SER（1.46）。结论 h-R3与C225均能提高照射对食管鳞癌细胞系TE-13的抗肿瘤作用,C225的杀伤作用略优于h-R3。     

辐射增强启动子调控的p53基因联合照射对肿瘤细胞的作用

目的 研究辐射增强启动子调控的野生型-p53抑癌基因系统联合照射对人肿瘤细胞系HeLa和A549细胞的特异性杀伤作用。方法 构建辐射增强启动子pE6（TATA）-p53,Western blot检测不同射线剂量诱导下人肺腺癌A549细胞系和人宫颈癌HeLa细胞系中P53蛋白的表达水平,筛选出最适的照射剂量;AnnexinV-FITC试剂盒检测肿瘤细胞系早期凋亡率;利用克隆形成实验检测此系统对肿瘤细胞放射敏感性的影响。结果 在HeLa和A549细胞中,P53蛋白表达均受放射线诱导增高,且在6 Gy时辐射诱导活性最高;实验组质粒的细胞早期凋亡率与转染对照组质粒的细胞早期凋亡率相比有明显提高（F=11.018、10.736,P<0.05）。HeLa细胞和A549细胞的放射增敏比（SER）分别为2.56和2.36。结论 辐射增强启动子调控的p53基因系统具有显著的诱导肿瘤细胞凋亡的作用,可以提高肿瘤细胞的辐射敏感性,对肿瘤的治疗提供了新思路。