西洋参PqGA2ox基因的克隆与序列分析

目的 克隆、分析西洋参Panax quinquefolium种子萌发过程的赤霉素2-氧化酶(gibberellin 2-oxidase,GA2ox)基因.方法 从前期由高通量测序得到78 207条unigenes基因的注释信息中挖掘出与赤霉素合成和分解代谢相关的基因序列,得到11条GA2ox基因相关序列,通过序列比对分析确定GA2ox的转录本.根据选定的unigene序列设计引物,采用PCR方法扩增西洋参GA2ox的cDNA全长;利用生物信息学方法分析所得基因,并用实时荧光定量PCR技术进行表达分析.结果 得到一条长度为987 bp,编码328个氨基酸残基的西洋参GA2ox基因,命名为PqGA2ox.生物信息学预测PqGA2ox蛋白不含跨膜区,不含信号肽,具有依赖于2-酮戊二酸和Fe²⁺的双加氧酶超家族的保守结构域.实时荧光定量PCR结果显示在形态休眠中期和生理休眠中期的表达量低于其休眠起始期和解除休眠期.结论 首次获得西洋参种子PqGA2ox基因的编码区序列,为进一步研究西洋参种子解除休眠的分子机制奠定基础.     

铁皮石斛赤霉素3-氧化酶基因的克隆及表达分析

目的克隆珍稀濒危药用植物铁皮石斛Dendrobium officinale赤霉素3-氧化酶(gibberellin 3-oxidases,GA3ox)基因(Do GA3ox),并进行生物信息学和表达分析。方法采用RACE和RT-PCR技术获得Do GA3ox基因c DNA全长;利用生物信息学软件预测其编码蛋白的理化性质、结构域及亚细胞定位等分子特性;用DNASTAR 7.0和MEGA 6.0软件分别对其进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;借助实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测基因表达模式。结果克隆到Do GA3ox基因(Gen Bank注册号KT597694),c DNA全长1 318 bp,编码一条由353个氨基酸组成的多肽,相对分子质量为39 052.5,等电点6.21;Do GA3ox蛋白不含跨膜域和信号肽,具有GA3ox的保守结构域DIOX_N(40~130)和2OG-Fe II_Oxy(197~299);Do GA3ox与大葱、油棕、海枣、野茶树及蓝猪耳GA3ox蛋白一致性分别为55%、56%、54%、51%、50%,与单子叶植物大葱、油棕和海枣的亲缘关系较近。q RT-PCR实验结果显示Do GA3ox基因在铁皮石斛种子共生(非共生)萌发1~3级时,其相对表达量呈现出先升高后降低再升高的趋势,分别为未萌发种子的13.44(5.21)、7.28(2.32)和9.40(6.21)倍,由此可知,该基因在共生萌发种子中的表达量高于非共生萌发种子。结论首次克隆得到1个Do GA3ox基因的全长c DNA,其转录本在共生和非共生不同萌发级别种子中的表达特性说明该基因在铁皮石斛种子萌发中起着重要调控作用。     

西洋参环氧角鲨烯环化酶基因的克隆、分布与分析

目的 克隆西洋参皂苷合成下游途径关键酶-环氧角鲨烯环化酶(oxidosqualene cyclases,OSC,EC 4.2.1.B2),分析基因功能及其在不同组织中的表达.方法 采用大规模ESTs测序和eDNA末端扩增(RACE)技术,对西洋参中参与达玛烷皂苷合成的环氧角鲨烯环化酶基因(OSC)进行克隆和研究.结果 获得了西洋参环氧角鲨烯环化酶(OSC)基因全长eDNA,命名为PqDS(GenBank注册号:GU997679),其核苷酸序列长度为2 310 bp,含有1个开放阅读框编码769个氨基酸的蛋白.保守结构域搜索显示PqDS含有环氧角鲨烯环化酶(OSC)共有的活性位点和保守基序.信号肽分析(Singal P3.0)表明西洋参PqDS属于非分泌型蛋白.采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)研究了PqDS基因在各个器官中的表达,结果显示在花中高表达,根、叶和茎中表达量相对较低.结论 首次克隆了西洋参环氧角鲨烯环化酶(PqDS)基因全长序列,为研究该酶在植物体内的表达、功能与作用机制奠定了基础.     

西洋参β-香树脂合成酶基因的克隆和生物信息学分析

目的 克隆西洋参三萜皂苷生物合成途径关键酶β-香树脂合成酶(bAS)全长cDNA,为研究西洋参皂苷生物合成与次生代谢调控奠定基础.方法 采用大规模ESTs测序和cDNA末端扩增(RACE)技术克隆西洋参bAS基因.结果 获得了西洋参bAS基因全长cDNA,命名为PqbAS(GenBank注册号:JX185490),其核苷酸序列长度为2 309 bp,含有1个开放阅读框,编码631个氨基酸多肽.保守结构域搜索显示PqbAS含有环氧角鲨烯环化酶(OSCs)共有的活性位点和保守基序.Singal P4.0分析表明PqbAS属于非分泌型蛋白,Tmhmm 2.0分析表明其为非跨膜蛋白.实时荧光定量PCR显示PqbAS基因在各个器官中均有表达,在花和幼茎中高表达,根和叶中表达量相对较低.结论 首次克隆了PqbAS基因全长序列,为研究其表达特性以及在三萜皂苷生物合成中的功能奠定了基础.     

太子参2个赤霉素2-氧化酶基因的克隆与序列分析

目的克隆太子参Pseudostellariae Radix赤霉素2-氧化酶(gibberellin2-oxidase,GA2ox)基因,并进行生物信息学和表达分析。方法通过对太子参转录组数据库的分析,得到2个太子参GA2ox基因PhGA2ox1和PhGA2ox8。。采用反转录PCR(RT-PCR)和特异PCR技术获得2个基因的蛋白编码区(coding sequence,CDS),并对其编码的蛋白进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测基因的表达模式。结果生物信息学分析表明,PhGA2ox1和PhGA2ox8的CDS区分别长981和1 056 bp,编码326和351个氨基酸残基,蛋白相对分子质量分别为36 871.3和40 169.9,理论等电点为8.66和6.91,具有GA2ox的保守结构域DIOX_N和20G-Fell_Oxy,但均无明显疏水区,无跨膜结构域,无信号肽,为稳定蛋白。序列系统进化分析显示植物GA2ox蛋白可被分为3个亚类,PhGA2ox1和PhGA2ox8分别归入Class I和Class III亚类。qPCR分析显示,PhGA2ox1在不同组织器官中的表达基本恒定,而PhGA2ox8在块根木质部的表达量却显著高于在其他组织器官中的表达量(P0.05)。结论首次获得PhGA2ox1和PhGA2ox8基因的编码区序列,为进一步分析2个基因在太子参生长发育过程中的作用奠定了基础。     

滇重楼种子层积后脱落酸和赤霉素相关基因表达水平的研究

目的 研究脱落酸(ABA)和赤霉素(GA)相关的6个基因(NCED、CYP707A、ABI2、PP2C、GA20ox2、GA20ox3)在滇重楼种子休眠解除过程中的表达特点.方法 分别选取20℃层积和20℃转4℃层积处理后处于不同休眠解除阶段的滇重楼种子为材料,应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析不同层积处理后6个基因在胚和胚乳中的表达水平.结果 在滇重楼种子层积过程中CYP707A、NCED、GA20ox2、GA20ox3和ABI2基因在胚和胚乳中表达有差异,而PP2C表达水平无明显变化规律;CYP707A在低温层积后表达水平显著高于高温层积,尤其是在胚中,而NCED、GA20ox2、GA20ox3和ABI2在高温和低温层积后均有较高的表达水平,且在胚中的表达水平高于胚乳中.结论 所筛选出的NCED、CYP707A、ABI2、GA20ox2、GA20ox3基因参与滇重楼种子休眠解除过程,可以作为研究滇重楼种子休眠过程的重要基因.     

西洋参不同组织部位中皂苷生物合成相关基因的表达研究

通过皂苷含量与基因表达量之间相关性分析,获得西洋参中不同组织部位皂苷含量与人参皂苷生物合成相关基因表达之间联系。以四年生红果期西洋参的14个组织部位为材料,利用高效液相法和香草醛-硫酸比色法测定西洋参样本中6种单体皂苷（人参皂苷Rg1,Re,Rb1,Rc,Rb2,Rd）,分组皂苷和总皂苷含量;同时,利用实时荧光定量PCR法检测西洋参不同组织部位中7种（SQS,OSC,DS,β-AS,SQE,P450,FPS）人参皂苷生物合成相关基因的表达量。在西洋参中7种人参皂苷生物合成相关酶基因虽然参与人参皂苷合成,但是β-AS和P450基因的表达对单体皂苷,分组皂苷及总皂苷含量影响不显著;FPS,SQS,OSC,DS和SQE这5种基因表达对单体皂苷Re,Rg1,Rb1,Rd,分组皂苷PPD和PPT,单体总皂苷TMS和总皂苷TS含量影响显著或者极显著（P〈0.05或P〈0.01）。西洋参中部分单体皂苷,分组皂苷以及总皂苷的生物合成受着皂苷合成途径多种酶基因相互作用影响,生物合成途径中关键酶基因表达差异决定了西洋参中不同组织部位皂苷含量。因此,该研究通过相关性分析进一步明确了FPS,SQS,OSC,DS和SQE这5种酶基因是控制西洋参中皂苷合成的关键酶,它们通过集群协同表达互作的方式调控西洋参中人参皂苷的生物合成。     

西洋参实时荧光定量PCR快速鉴别方法的建立北大核心CSCD

基于ITS2片段序列特征,该研究设计了西洋参的特异性引物、探针,通过条件的优化建立了西洋参的实时荧光定量PCR快速鉴别方法。利用该方法对43个中药材样本进行了验证,结果能准确地鉴别出43个药材样本中的22个西洋参,并且灵敏度高,检测限可达到1×10-4ng。该方法具有准确、快捷、灵敏的特点,可对西洋参及其加工产品进行准确的鉴别和检测,应用前景广阔。     

洋常春藤鲨烯合成酶基因HhSS的克隆与表达分析

目的克隆获得洋常春藤Hedera helix鲨烯合成酶基因(HhSS)cDNA全长序列并进行生物信息学分析及表达分析。方法根据洋常春藤转录组数据信息设计引物,通过RACE克隆方法获得HhSS基因序列;采用DNAMAN、PROTPARAM、TMHMM、PSORT、Scan Prosite、SOPMA、SWISS-MODEL等生物信息学工具分析序列信息及编码蛋白的理化特性、结构域等特征;通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术进行HhSS基因的检测分析。结果 RACE克隆获得HhSS(Gen Bank登录号KX056078)基因cDNA序列全长1 889 bp,包含一个从248~1 477 bp的完整开放阅读框(ORF)以及247 bp的5’非编码区(5’UTR)和412 bp的3’非编码区(3’UTR)。该基因编码409个氨基酸,相对分子质量为46 800,等电点为5.68。HhSS蛋白具有植物SS蛋白的特征结构域和跨膜区,与刺五加、人参等同科植物亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明洋常春藤叶片中HhSS基因的相对表达量与常春藤皂苷含量存在正相关性。结论洋常春藤HhSS基因的成功克隆及表达分析研究,为阐明HhSS基因在常春藤皂苷生物合成途径中的作用及代谢调控研究提供理论依据和技术基础。     

红花2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶基因的克隆及表达分析

目的克隆红花维生素E合成相关关键酶2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶(MPBQ MT)基因,并进行生物信息学及表达分析,为红花维生素E生物合成及调控机制研究奠定基础。方法根据红花种子转录组数据库中得到的中间序列,采用RT-PCR和RACE方法从红花种子中克隆MPBQ MT基因序列,通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,构建MPBQ MT与相关物种MPBQ MT的系统进化树,利用RT-PCR方法分析在红花种子不同发育时期MPBQ MT基因的表达量。结果MPBQ MT基因全长1 392 bp,命名为Ct MPBQ MT,具有完整的开放阅读框(ORF),共1 038 bp,编码345个氨基酸。生物信息学分析显示,该基因编码的蛋白理论相对分子质量约为38 900。保守结构域预测表明,该基因编码的蛋白具有典型的SAM蛋白功能结构域。结合其他物种的MPBQ MT基因构建系统树表明,红花MPBQ MT基因与其他物种氨基酸具有一定的同源性,其中与向日葵和生菜同源性高达89%和86%。实时荧光定量PCR分析表明,MPBQ MT基因在红花开花后50 d的种子中表达量最高。结论成功地对MPBQ MT基因进行克隆及表达分析,为红花维生素E合成及调控机制研究奠定基础。     

基于ITS2序列的人参及同属易混品西洋参种子的分子鉴定

目的基于DNA条形码技术建立人参与西洋参种子的分子鉴别方法。方法采用生药鉴定方法研究其性状、显微特征,并结合DNA条形码技术,基于中药材DNA条形码数据库,通过ITS2序列比对、遗传距离比较和构建临接(NJ)系统发育树,对人参与西洋参的种子进行鉴别研究。结果人参与西洋参种子的种内遗传距离分别小于种间遗传距离,系统发育树图中各物种均聚为一支,来自9个产地的42份人参及西洋参的种子均为正品,且容易区分。结论基于ITS2序列DNA条形码技术可以快速、准确、有效地鉴别人参与西洋参种质资源。     

双重实时荧光PCR快速鉴别人参和西洋参＊

目的 建立一种能够快速鉴定人参和西洋参的双重实时荧光PCR方法。方法 通过对人参属及其近似种基因序列的分析比对，设计特异性的引物探针，建立双重实时荧光PCR检测方法。PCR反应体系为Premix Ex Taq （Probe qPCR） 10 μL，人参上下游引物各0.5 μL，西洋参上下游引物各0.3 μL，人参与西洋参特异性探针各0.4 μL，DNA模板2 μL，灭菌去离子水补至20 μL。反应条件为95℃预变性30 s；然后以95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s进行40个循环。应用该方法测试了27份DNA样品，包括7份人参、6份西洋参、4份人参与西洋参混合样、10份其他人参属样品及其他常见中药材样品的DNA，以确定该方法的特异性。将人参与西洋参样品DNA混合后10倍稀释成不同浓度后进行检测，用以确定该方法的灵敏度。结果 人参及西洋参样品均在特定的荧光通道下出现典型的阳性扩增曲线，人参与西洋参混合样品均同时出现两条阳性扩增曲线，其它对照样品及空白对照均没有出现阳性扩增曲线。灵敏度检测结果显示该方法检测人参及西洋参的最低检测限均为2 pg DNA/反应。结论 本实验建立的双重实时荧光PCR方法能够同时快速、准确、灵敏地鉴别出人参和西洋参。     

西洋参不同部位皂苷成分研究

[目的] 研究西洋参不同部位皂苷类成分的含量差异。[方法] 对西洋参9个部位以甲醇为溶剂分别进行回流提取,用HPLC法测定西洋参不同部位中7种单体皂苷,即人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3和Rd的含量,并对测定结果分别进行主成分分析和聚类分析。[结果] 西洋参花蕾、须根、芦头中7种皂苷含量较高,用主成分分析和聚类分析将9个部位分成两类,花蕾和叶为一类,其他部位为另一类。[结论] 西洋参各部位总皂苷及单体皂苷含量差异较大,通过HPLC对其进行含量测定,并结合主成分和聚类分析,可对各部位皂苷成分的分布及含量进行全面评价。     

三七香叶基香叶基焦磷酸合酶基因的克隆及表达分析

基于三七转录组测序结果,选择萜类代谢骨架上香叶基香叶基焦磷酸合酶基因(GGPPS),结合RACE技术,克隆得到全长1 203 bp的cDNA序列,最长开放阅读框为1 035 bp,命名为PnGGPPS,GeneBank登录号为KM486564,PnGGPPS基因全长2 370 bp,包含1个内含子和2个外显子,该基因编码344个氨基酸,与蓖麻Ricinus communis、丹参Salvia miltiorrhiza等植物GGPPS的同源性达到73%以上,具有富天冬氨酸区等多个结构域,属于类异戊二烯合成酶超家族。实时荧光定量PCR结果显示,PnGGPPS在一至三年生三七的根、茎、叶和三年生的花等不同器官组织中均有表达,但以三年生叶中具有显著水平的高表达量,暗示其既具有调节三七生长发育的基本功能,也与三七叶绿素和类胡萝卜素的合成、叶绿体的发育、阴生适应性,以及品质的形成有关。     

西洋参根腐病与三七素积累之间关系

目的:西洋参的根腐病与西洋参自身产生和分泌的化感物质有关,研究西洋参根腐病的发生与西洋参根中三七素(β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸,β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionic acid,β-ODAP)积累之间的相关性。方法:采集陕西汉中留坝县佳仕森西洋参种植基地生长2~4年的重茬地与生茬地的正常西洋参和患根腐病西洋参,利用2,4-二硝基氟苯(FDNB)柱前衍生法,然后通过高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定西洋参主根和侧根中β-ODAP含量的变化。结果:结果表明,患根腐病参样中β-ODAP的积累明显高于正常参样,重茬地患根腐病参样中β-ODAP的积累明显高于生茬地;正常参样中β-ODAP含量的积累为三年生最高,二年生次之,四年生最低,而在患根腐病参样中,四年生最高,二年生次之,三年生最低,呈完全相反趋势;且同株参样中,主根和须根中β-ODAP含量的积累存在明显差异,尤其是二年生和三年生的参样。结论:以上结果表明重茬地西洋参根中β-ODAP含量明显高于生茬地西洋参,患根腐病西洋参根中β-ODAP含量明显高于正常西洋参,西洋参根腐病的发生与西洋参根中β-ODAP含量的积累呈正相关。     

碳源、氮源和磷源对西洋参悬浮细胞生物量和活性成分积累的影响

 目的研究碳源、氮源和磷源对西洋参悬浮细胞生长,人参皂苷Re,Rb1以及西洋参多糖合成的影响。方法利用组织培养技术结合高效液相色谱法和紫外分光光度法,通过改变培养基碳源种类、氮源和磷源浓度,研究其对西洋参悬浮细胞生长,人参皂苷Re,Rb1以及西洋参多糖含量的影响。结果添加40g·L^-1蔗糖的细胞干重生长率最大,加入30g·L^-1蔗糖得到的人参皂苷Re、Rb1和多糖的含量最高,分别为0.531%,0.145%和3.62%。本实验保持氮源浓度60mmol·L^-1,当培养基中全部为NO₃^-时,细胞干重生长率最低,而人参皂苷Re、Rb1和多糖含量最高,分别为对照组的2.40,1.96和4.41倍。添加5.00mmol·L^-1的KH₂PO₄,细胞干重生长率最大。当培养基中KH₂PO₄浓度为0.63mmol·L^-1时,人参皂苷Re、Rb1和多糖的含量最高。结论本实验确定了西洋参细胞悬浮培养的最佳碳源种类、氮源比例和磷源浓度,表明不同碳源、氮源和磷源对西洋参细胞生长和活性成分有显著影响。     

HPLC-MSn法测定加拿大原产地西洋参不同入药部位的人参皂苷含量

目的:采用HPLC-MSn法对加拿大原产地采收的西洋参根、茎和叶中的10种人参皂苷的含量进行测定.方法:采用HPLC-MSn法,色谱柱为DIKMA diamonsil(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为乙腈-0.05％磷酸水和乙腈-0.05％乙酸水,流速0.3 mL· min-1,柱温35℃,检测波长203 nm.质谱条件:正离子检测模式,鞘气10 L·min-1,辅助气10 L·min-1,喷雾电压4.5 kV,毛细管温度320℃,毛细管电压30 V.结果:10种人参皂苷的含量在一定范围内线性关系良好(r＞0.999),平均回收率为95％～102％,RSD ＜2.68％.西洋参不同入药部位单体人参皂苷含量差异较大,西洋参叶的总皂苷与西洋参根的总皂苷相当,西洋参叶样品S1的总皂苷甚至高于西洋参根的总皂苷;西洋参茎的总皂苷含量则远低于叶和根中的含量;单体人参皂苷则以Rb2、Rb3在西洋参叶中有很高的含量,Re,Rb1在根中有很高的含量.结论:该方法简便、准确、重复性好,可用于西洋参的定量定性检测;建议西洋参叶可以作为人参皂苷的新来源.     

三七几丁质酶基因PnCHI1的克隆及表达特性分析

几丁质酶(chitinase,EC3.2.1.14)广泛存在于多种生物体中,催化水解几丁质(chitin),在抗真菌防卫反应体系中具有重要作用,同时几丁质酶还调控植物的生长和发育,参与细胞的程序性死亡(programmed cell death,PCD)。该实验基于三七Panax notoginseng中编码几丁质酶的EST序列设计引物,采用快速扩增cDNA末端技术,克隆得到1个新的几丁质酶基因的全长cDNA序列,命名为PnCHI1。PnCHI1的cDNA全长为1 022 bp,含有822 bp的开放阅读框,26 bp 5'-非翻译区以及174bp的3'-非翻译区,编码具有273个氨基酸的蛋白质。该基因编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族成员,进化树分析表明PnCHI1编码的氨基酸序列属于IV类几丁质酶。qRT-PCR分析结果显示,植物信号分子水杨酸、茉莉酸甲酯、H_2O_2和乙烯处理可均明显诱导三七根中PnCHI1的转录水平;三七叶片接种人参链格孢Altemaria panax后,PnCHI1的表达量迅速升高,呈波动上升趋势;外源茉莉酸甲酯预处理三七根部,PnCHI1的表达水平上升,接种茄腐镰刀菌Fusarium solani后,PnCHI1的转录水平急剧上升,接种后4 h达到最高转录水平;而无菌水预处理三七受茄腐镰刀菌侵染过程中,PnCHI1的表达量逐渐上升,至48h达到最大值。上述结果表明PnCHI1参与三七对根腐病菌以及黑斑病菌的防卫反应。