桑黄鲨烯环氧酶基因原核表达及过表达载体的构建

目的构建桑黄三萜生物合成途径中的关键酶——鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因的原核表达和过表达载体。方法将克隆到的桑黄SE基因构建到原核表达载体p ET-32a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),使用异丙基硫代-β-D-呋喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达2~10 h后,通过SDS-PAGE进行检测。根据Gen Bank中提交的香菇3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)启动子序列设计引物,利用PCR技术克隆获得香菇gpd启动子片段,以植物双元表达载体p CAMBIA1301为基础载体,通过酶切、连接等方法将其中的35 S启动子替换为香菇gpd启动子,再将SE基因编码区序列构建到gpd启动子下游,构建桑黄SE基因的过表达载体。结果成功构建了SE基因的原核表达载体p ET-32a-SE,SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约为55 000,与预测的蛋白相对分子质量基本一致。PCR检测、酶切鉴定和测序分析可知,成功构建了适宜食用菌遗传转化的中间载体p CAMBIA1301-gpd-gpd及SE基因的过表达载体p CAMBIA1301-gpd-gpd-SE。结论为后期研究SE基因在桑黄三萜生物合成方面所发挥的功能奠定基础。     

人参中核黄素激酶基因的克隆与原核表达

目的从人参中克隆出核黄素激酶基因,进行相关的生物信息学分析,构建原核表达载体并在大肠杆菌诱导表达。方法根据人参转录组数据库筛选出序列comp61599_c0_seq12,经相关软件对其进行序列分析;该序列3’末端缺失,利用3’RACE技术获得3’端序列;通过PCR技术获得人参核黄素激酶基因的全长c DNA序列,并构建原核表达载体p ET-32a-Pg RFK,通过热激法转化到大肠杆菌BL-21中进行诱导表达。结果从人参中成功克隆出1条长度为1 200 bp的核黄素激酶基因,其编码399个氨基酸,同时成功构建该基因的原核表达载体,SDS-PAGE电泳结果显示该蛋白大小与预测蛋白相对分子质量一致。结论成功克隆了人参核黄素激酶基因,并在大肠杆菌中成功表达。     

三七GGPPS基因CDS序列克隆及原核表达

目的为研究GGPPS基因在三七中的功能,从三七中克隆GGPPS基因CDS序列,并进行原核表达。方法以3年生三七叶组织为材料,依据Genbank中已报道的GGPPS基因序列设计引物,利用RT-PCR技术,克隆得到编码区序列;克隆片段连接到p ET-30α(+)表达载体,转入大肠杆菌BL21后,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下进行表达。结果三七GGPPS基因CDS序列全长1 032 bp,编码343个氨基酸。SDS-PAGE结果表明,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白大小在29 000~44 000,且表达产物主要以不溶性包涵体形式存在。结论成功克隆了三七GGPPS基因CDS序列,建立了稳定的原核表达体系,为进一步研究其在三七中的生物学功能奠定了基础。     

白木香AsJAZ1基因原核载体的构建与表达

克隆国产沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis jasmonate-zim-domain protein(As JAZ1)基因的编码区,构建原核表达载体及诱导重组蛋白的表达,为筛选互作蛋白因子和研究基因功能奠定基础。该实验以白木香叶片中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR方法克隆到茉莉酸信号转导抑制蛋白基因JAZ(As JAZ1)的编码区全长序列,克隆到原核表达载体p ET-28a上,构建重组原核表达载体p ET-28a-As JAZ1,经酶切鉴定和测序验证后将其转入大肠杆菌BL21(DE3),在37℃经0.5 mmol·L-1异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达4 h后,可获得相对分子质量约为39 k Da的融合重组蛋白的高效表达。该重组蛋白在大肠杆菌的上清和沉淀中均有表达,但以包涵体表达为主。     

麻疯树核糖体失活蛋白curcin在大肠杆菌中高效表达条件的研究

目的:编码麻疯树毒蛋白(curcin)成熟蛋白的基因原核表达载体的构建及其高效表达条件的研究.方法:根据GenBank上麻疯树的cDNA序列设计引物,用PCR方法从麻疯树基因组中扩增得到编码麻疯树毒蛋白成熟蛋白的基因;将其导入原核表达载体pQE-30,pET-32中,并将其转入大肠杆菌获得重组菌株.在不同诱导剂、不同温度、不同诱导时间等条件下诱导其产生重组蛋白并进行检测比较.结果:用PCR方法从麻疯树基因组中扩增得到编码麻疯树毒蛋白成熟蛋白的基因,成功构建了原核表达载体pQE-R,pET-R,并获得重组菌株PRM,PRB.在不同诱导剂、不同温度、不同诱导时间等条件诱导下,PRB均无重组蛋白产生,而PRM却能以包涵体的形式表达curcin.结论:重组菌PRM在诱导6 h,28℃,IPTG 0.5 mmol·L~(-1)时表达curcin蛋白的效率最高.     

登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原核载体的构建及蛋白表达

目的体外扩增登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列,构建pET28a(+)-ME、pET28a(+)-NE,分析其在E-coli BL21中的表达。方法 PCR方法扩增(DENV-2)M株、NGC株E基因部分序列并构建原核重组载体pET28a(+)-ME、pET28a(+)-NE,将重组载体转化E-coli BL21,IPTG诱导表达,采用镍离子亲和层析的方法纯化目的蛋白并用SDS-PAGE电泳和Western-Blot进行鉴定。结果经双酶切、PCR和测序证实成功构建原核重组载体pET28a+-ME、pET28a(+)-NE,Western-Blot证实成功诱导出目的蛋白,SDS-PAGE电泳证实亲和层析法纯化后得到较高纯度的目的蛋白。结论检测到目的蛋白的表达,经纯化后得到纯度约为90%的目的蛋白,为研究登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E蛋白在致病机制方面奠定了一定的基础。     

银杏果抗真菌肽基因(GZ-gb)原核表达载体的构建

目的 为了构建贵州银杏果抗真菌肽基因(GZ-gb)的表达载体.方法 采用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切的pMD18-T-GZ-gb和pET32a(+)质粒,纯化回收产物进行反应,将连接产物pET32a(+)-GZ-gb转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后,经菌落PCR、酶切鉴定和测序.结果 表明目的片段成功插入表达载体.结论 pET32a(+)-GZ-gb可以用来制备抗真菌蛋白.     

黄花蒿MCS基因的克隆及其序列分析与原核表达

目的 从黄花蒿中克隆MEP途径关键酶2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合成酶(MCS)基因,进行序列特征分析、原核表达以及组织表达的研究.方法 根据黄花蒿MCS (AaMCS)基因EST序列,克隆MCS cDNA及基因组序列.将MCS编码区与表达载体pET-21a(+)重组,构建pET-21a (+)-MCS的原核表达载体并转入大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导获得MCS融合蛋白.半定量RT-PCR检测MCS的组织表达情况.结果 AaMCS cDNA全长994 bp,包含681 bp的开放阅读框,编码226个氨基酸,基因全长2 540 bp,包含3个外显子和2个内含子.构建pET-21a (+)-MCS重组质粒,获得稳定的pET-21a (+)-MCS原核表达体系.AaMCS在根、茎、叶、花中均有表达,其中花中表达量较高,根和茎中表达量低.结论 克隆了AaMCS基因,建立pET-2 1a (+)-MCS稳定的原核表达体系,为研究AaMCS蛋白的活性及其功能奠定了基础.     

北葶苈子GGPS基因的克隆、序列分析与原核表达

目的:获得北葶苈子(Lepidium apetalum)中牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPS)的编码基因,进行生物信息学分析,在大肠杆菌中表达该蛋白。方法:根据北葶苈子转录组测序结果中的GGPS基因序列,设计特异性引物,通过PCR扩增得到北葶苈子GGPS的c DNA序列,进行TA克隆、测序及序列分析,构建原核表达载体并于大肠杆菌中表达北葶苈子GGPS蛋白。结果:得到北葶苈子GGPS c DNA全长1 146 bp,编码381个氨基酸;序列分析表明北葶苈子GGPS基因编码的氨基酸序列包含类异戊二烯合成酶结构域,氨基酸序列进化关系表明北葶苈子GGPS与拟南芥(Arabidopsis thaliana)和白芥(Sinapis alba)亲缘关系最近;成功构建了p ET-32a-La GGPS原核表达载体,并在大肠杆菌BL21菌株中成功诱导表达。结论:首次克隆得到北葶苈子GGPS基因,并在大肠杆菌中成功表达了北葶苈子GGPS蛋白,为纯化该蛋白并研究其结构和功能奠定了基础。     

北柴胡糖基转移酶基因BcUGT8的克隆、序列分析及其原核表达载体构建

目的 克隆北柴胡Bupleurum chinense中可能参与柴胡皂苷生物合成的糖基转移酶基因BcUGT8,构建其原核表达载体,为通过体外表达和纯化蛋白的催化活性,分析验证其功能奠定基础.方法 在Roche (454) GS FLX系统高通量测序已获得部分cDNA序列基础上,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)和长距离PCR扩增方法(LD-PCR)克隆全长cDNA.设计含有酶切位点的PCR引物,PCR扩增其开放阅读框(ORF),酶切后,插入到pET-28a(+)载体中,构建出原核表达载体.结果 扩增到北柴胡1个糖基转移酶(UGT)基因全长cDNA,构建了这一基因的原核表达载体.结论 通过BcUGT8基因的全长cDNA克隆、序列分析和原核表达载体的构建,为后续开展体外酶蛋白表达、纯化和催化活性分析实验,验证其生物功能奠定了基础.     

金荞麦黄酮醇合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 克隆金荞麦黄酮醇合酶(FdFLS)基因的编码序列,并对该基因进行序列分析、原核表达及其活性研究.方法 采用同源克隆技术获得FdFLS基因cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;构建FdFLS原核表达载体pET-30b(+)-FdFLS,在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,并测定目标蛋白的酶学活性.结果 FdFLS基因开放阅读框(ORF)全长1008 bp,编码334个氨基酸;FdFLS基因在大肠杆菌中可表达出相对分子量约4×104的蛋白,并具有将二氢槲皮素和二氢山柰酚转化为槲皮素和山柰酚的催化活性.结论 首次克隆到FdFLS基因,并实现该基因在大肠杆菌中有活性的表达.     

独行菜La F3H基因克隆、序列分析及原核表达

目的为了研究独行菜黄酮类化合物生物合成途径的关键基因,从独行菜中克隆了黄烷酮-3-羟化酶(flavanone-3-hydroxylase,F3H)基因,命名为LaF3H,并进行序列分析、原核表达和纯化。方法根据独行菜转录组数据中LaF3H基因序列设计特异性引物,克隆LaF3H基因的cDNA序列,构建pET-32a-LaF3H原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达LaF3H重组蛋白。结果 LaF3H基因开放阅读框(ORF)长1080bp,编码359个氨基酸,其蛋白质相对分子质量为40 320。序列分析结果表明LaF3H具有F3H蛋白的5个保守基序,系统进化分析结果显示LaF3H蛋白与拟南芥等十字花科植物F3H蛋白同源性较高。通过构建原核表达载体pET-32a-LaF3H,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达LaF3H重组蛋白,利用Ni2+亲和色谱得到了纯化的LaF3H重组蛋白。结论克隆了LaF3H基因,获得LaF3H纯化蛋白,为下一步制备LaF3H蛋白抗体、酶学活性检测,研究LaF3H基因在独行菜黄酮类化合物生物合成途径中的功能奠定基础。     

地黄RgGGPPS2基因克隆、生物信息学分析及表达分析

目的为了研究地黄萜类化合物生物合成途径的功能基因,从地黄中克隆了一条新的地黄GGPPS基因(RgGGPPS2),进行生物信息学分析,原核表达、纯化以及基因表达模式分析。方法根据地黄转录组数据中RgGGPPS2基因的序列信息,设计特异性引物,克隆了RgGGPPS2基因的开放阅读框(ORF)序列,构建pET32a-RgGGPPS2原核表达载体,用IPTG在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达RgGGPPS2重组蛋白,荧光定量PCR检测RgGGPPS2基因的组织特异性表达。结果 RgGGPPS2基因的ORF为867 bp,编码289个氨基酸。生物信息学分析结果发现RgGGPPS2蛋白含有2个富含天冬氨酸的基序FARM(first aspartate-rich motif)和SARM(second aspartate-rich motif),RgGGPPS2与芝麻、长春花等双子叶植物中GGPPS蛋白的同源性较高。通过构建pET-32a-RgGGPPS2原核表达载体在大肠杆菌中成功表达RgGGPPS2重组蛋白,利用Ni2+亲和色谱得到了纯化的RgGGPPS2重组蛋白。荧光定量PCR结果显示RgGGPPS2基因在根中表达量最高,其次是叶,茎中最低。结论克隆了RgGGPPS2基因,获得了纯化的RgGGPPS2重组蛋白,为研究RgGGPPS2基因在地黄萜类化合物生物合成途径中的功能奠定了基础。     

鸢尾糖基转移酶编码基因ItUGT349和ItUGT419克隆及特性研究

目的 克隆获得鸢尾Iris tectorum糖基转移酶基因ItUGT349和ItUGT419,并对其进行生物信息学分析、基因差异表达检测和蛋白原核表达等特性分析。方法 以鸢尾转录组中筛选到的ItUGTs基因全长开放阅读框(open reading frame,ORF)设计特异性引物,进行PCR扩增,经测序后获得基因序列并进行生物信息学分析;通过荧光定量PCR(real-time PCR,qRT-PCR)进行基因差异表达检测;最后构建pET-32a(+)原核表达载体在大肠杆菌中表达蛋白。结果 PCR扩增ItUGT349和ItUGT419的ORF长度分别为1461、1488 bp,编码蛋白相对分子质量大小分别为53 830、54 910。荧光定量PCR显示,ItUGT349的表达量在叶片中最高,而ItUGT419在花器官中表达最高。进化树表明,ItUGT419与三萜类糖基转移酶聚类在一起,ItUGT349与三萜、黄酮和木质素等多种类型的糖基转移酶聚类到一支。ItUGT349和ItUGT419在大肠杆菌中均成功的表达出可溶性蛋白。结论 通过ItUGT349和ItUGT419基因全长ORF克隆,并对其进行序列分析,基因差异表达检测及原核表达等研究,为后续进一步鉴定其催化功能奠定基础。     

铁皮石斛HDS基因的克隆与初步表达分析

目的从铁皮石斛Dendrobium officinale中克隆4-羟基-3-甲基-2-E-丁烯基-1-焦磷酸合成酶(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate synthase,HDS)基因,在大肠杆菌中诱导融合蛋白,并探究该基因在铁皮石斛不同组织中的表达规律。方法采用RT-PCR和RACE等方法获取铁皮石斛HDS(Do HDS)的c DNA全长,利用相关软件和在线网站进行生物信息学分析,使用Real-Time PCR分析Do HDS在不同组织的表达特征,构建原核表达载体p ET-28a(+)-Do HDS,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。结果成功获得Do HDS的c DNA全长序列,Gen Bank登录号为KJ161312,全长2 666 bp,ORF为2 238 bp,编码745个氨基酸。Do HDS在各组织中均有表达,在茎中表达量最高,为原球茎的5倍;SDS-PAGE结果显示诱导产物为1个相对分子质量(82 700)与理论值相符的融合蛋白。结论克隆了Do HDS的c DNA全长序列,探究其在不同组织中的表达模式,建立了原核表达体系,为后续研究Do HDS的功能提供了一定的理论基础。     

独行菜幼苗叶片乙酰CoA酰基转移酶基因克隆、序列分析与原核表达

目的:研究独行菜强心苷生物合成途径的相关基因,从独行菜幼苗叶片中克隆强心苷生物合成途径关键酶乙酰CoA酰基转移酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase,AACT)基因,进行序列分析和原核表达。方法:根据独行菜转录组数据中LaAACT基因序列设计特异性引物,克隆得到LaAACT基因的cDNA序列,构建pET-32a-LaAACT原核表达载体,诱导表达LaAACT重组蛋白。结果:LaAACT基因ORF全长为1 212 bp,编码403个氨基酸。序列分析结果显示LaAACT蛋白没有跨膜区,不含信号肽,位于细胞质中,含有硫解酶家族保守结构域。系统进化结果显示LaAACT蛋白与十字花科植物的AACT蛋白亲缘关系较近。通过IPTG诱导,在大肠埃希菌中成功表达LaAACT重组蛋白,并得到了纯化的LaAACT重组蛋白。结论:首次从独行菜幼苗叶片中克隆了LaAACT基因,建立其稳定的原核表达体系,为LaAACT蛋白抗体的制备,进一步研究LaAACT基因在独行菜强心苷生物合成途径中的功能奠定了基础。     

独行菜磷酸甲羟戊酸激酶LaPMK基因克隆、生物信息学分析及原核表达

目的从独行菜Lepidium apetalum中克隆萜类合成途径关键酶磷酸甲羟戊酸激酶(phosphomevalonate kinase,PMK)基因,进行序列分析和原核表达。方法根据独行菜转录组数据中La PMK基因序列设计特异性引物,克隆得到La PMK基因的开放阅读框(open reading frame,ORF),构建p ET32a-La PMK原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达La PMK融合蛋白。结果 La PMK基因ORF全长为1 518 bp(Genbank注册号KT004541),编码505个氨基酸。生物信息学分析结果显示La PMK蛋白没有跨膜区,不含信号肽,位于细胞质中,含有GHMP激酶家族特异的N末端和C末端的保守结构域。系统进化树结果显示La PMK蛋白与芜菁的PMK蛋白具有92%的序列相似性,亲缘关系较近。构建p ET32a-La PMK原核表达载体,在大肠杆菌中成功表达La PMK融合蛋白。结论克隆了La PMK基因,建立其稳定的原核表达体系,为La PMK蛋白纯化、抗体的制备,进一步研究La PMK基因在独行菜萜类合成途径中的作用奠定了基础。