慢病毒载体介导的转基因整合位点研究方法

慢病毒载体整合到宿主细胞的染色体上可以长期稳定表达,目前已成为基因治疗和转基因动物载体研究的热点.慢病毒载体整合的位置效应是影响外源基因表达的重要因素,慢病毒载体整合位点的研究是探索外源基因整合机制的手段之一.转基因整合位点研究的方法主要有5种:荧光原位杂交、个体基因组文库筛选法、反向PCR、接头PCR、锚定PCR.近来的研究后发现整合位点之间可能存在一些共同特征.     

MagA转基因小鼠模型的建立

目的建立MagA转基因小鼠,为活体MRI成像系统提供重要的实验动物模型。方法采用显微注射法．将MagA基因导入小鼠受精卵,再培育成转基因小鼠并繁殖传代。利用PCR方法鉴定转基因首建鼠及其子代基因型。结果酶切和DNA测序分析证实MagA基因准确克隆表达载体设计位点,目的基因序列与GenBank中MagA序列完全一致。通过PCR分析,进行转基因整合检测。目前转基因小鼠已稳定传代至第5代。结论MagA基因在转基因小鼠中整合,成功建立了MagA转基因小鼠。MagA转基因小鼠将成为MRI影像系统的重要实验动物模型。     

小鼠BTLA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠BTLA慢病毒表达载体,并对表达产物进行鉴定.方法 以pET-28a-mBTLA质粒为模板,通过PCR技术构建pMD18-T-mBTLA质粒,将小鼠BTLA基因全长编码序列克隆到慢病毒转移载体,通过脂质体转染293T细胞包装成小鼠BTLA慢病毒颗粒.PCR技术和基因测序对重组质粒进行鉴定.荧光显微镜观察重组慢病毒感染293T细胞形态学变化.RT-PCR和Western blot法鉴定BTLA在重组慢病毒感染293T细胞中的表达.50％组织培养感染剂量法(TCID5o法)检测重组慢病毒滴度.结果 成功构建的pMD18-T-mBTLA质粒和pSL6-mBTLA质粒,经双酶切电泳后均出现大小约为1 kb的条带与mBTLA编码序列的大小相符.基因测序并比对分析进一步证实mBTLA编码序列成功整合到质粒载体.病毒上清PCR扩增和293T细胞形态学观察证实Lenti-mBTLA慢病毒包装成功.TCID50法测定Lenti-mBTLA慢病毒滴度为1.3×108 pfu/mL.RT-PCR和Western blot法证实Lenti-mBTLA慢病毒能有效表达mBTLA mRNA和蛋白质.结论 成功构建了表达小鼠BTLA的慢病毒.     

小鼠survivin基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

背景：间充质干细胞体内有限的存活能力严重制约其用于体内治疗方面的应用,因此寻找一种能延长存活能力的实验方法是间充质干细胞进行体内实验的重要前提。 目的：应用pLV.Des3d.P/hygro构建小鼠survivin基因的慢病毒表达载体。 方法：采用Oligo核酸软件对Genbank上所发表的小鼠survivin mRNA序列进行分析,设计一对survivin基因上下游引物,利用Gateway 克隆方法,分别在其两端添加attB重组位点,运用PCR扩增mSurvivin和IRES/EmGFP,将PCR产物进行BP反应然后转化到Stbl3感受态菌,通过卡那霉素抗性筛选、PCR鉴定,选取鉴定正确的pDown-mSurvivin和pTail-IRES/EmGFP克隆测序。将pDown-mSurvivin和pTail-IRES/EmGFP与pLV.Des3d.P/hygro混合进行LR反应,构建慢病毒载体pLV.EX3d.P/hygro-EF1A>mSurvivin>IRES/EmGFP,再次进行PCR、测序的鉴定。 结果与结论：显示基因序列克隆正确,成功构建了含有小鼠survivin基因的重组慢病毒表达载体。说明慢病毒表达载体pLV.EX3d.P/hygro-EF1A>mSurvivin>IRES/EmGFP构建成功,为下一步研究survivin在间充质干细胞中抗凋亡作用奠定基础。     

mTOR shRNA慢病毒载体的构建及包装

目的:构建mTORshRNA慢病毒表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制T细胞mTOR基因的相关研究奠定基础.方法:设计合成针对小鼠mTOR基因的shRNA片段,与酶切后的pLKD.UBC.GFP.U6载体片段进行连接并转化DH5α,提取阳性克隆质粒,测序,转染293T细胞.通过GFP表达水平测定病毒滴度.结果:DNA测序结果及PCR鉴定证实成功构建小鼠mTOR-shRNA重组慢病毒载体,对其进行包装后测定慢病毒滴度为1.38E+ 08 TU/ml.结论:成功构建并包装小鼠mTOR-shRNA重组慢病毒表达载体.     

慢病毒载体法制备荧光素酶转基因小鼠

目的基于慢病毒介导的转基因方法制备荧光素酶（Luc）转基因小鼠。方法制备携带Luc基因的慢病毒,将其注入小鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,然后将胚胎移植进假孕母鼠体内以获得仔鼠,应用小动物活体成像仪及PCR等在蛋白和DNA水平上筛选和鉴定Luc转基因小鼠。结果移植慢病毒隙感染后的成活胚胎63枚。将其移植至3只假孕母鼠,其中2只怀孕,共生仔鼠11只;利用小动物活体成像仪检测Luc表达,在蛋白水平证实11只F0代中,3只（命名为S1、S2、S3）表达Luc;DNA水平检测证实,3只Luc阳性小鼠的基因组中整合有外源转基因Luc。此外,Luc转基因首建鼠基因组中整合的Luc转基因可稳定遗传至下一代,并能正常表达。Luc转基因小鼠主要脏器如睾丸、肾脏、胃、肠、肺、脑、胸腺、肝脏和心脏等均可见Luc信号,但不同脏器间Luc强度有差异。结论成功制备Luc报告基因转基因小鼠。     

小鼠CXCR4基因的克隆和慢病毒介导的表达

目的:克隆小鼠CXCR4基因并建立其慢病毒表达系统.方法:设计合成PCR引物, 从小鼠骨髓有核细胞来源的cDNA中扩增并克隆小鼠CXCR4基因的编码区.构建CXCR4-IRES-GFP表达单元后通过转染细胞, 观察GFP的表达证实其表达效能.然后建立慢病毒表达载体, 包装慢病毒后感染培养的细胞, 用流式细胞术分析其在被感染的细胞中的表达.结果:成功扩增了小鼠CXCR4基因的编码区.克隆入质粒载体后经DNA序列测定证实了其序列.通过转染细胞和流式细胞术以及荧光显微镜观察证实了CXCR4-IRES-GFP的表达效能.成功构建了CXCR4慢病毒表达载体, 感染细胞后经流式细胞术分析, 证实被感染的细胞可以表达小鼠CXCR4.结论:成功扩增、克隆了小鼠CXCR4基因, 并成功建立起其慢病毒表达系统, 为后续的基础和应用研究奠定了基础.     

三种PCR方法在HBV基因整合位点确定中的应用比较

目的 比较反向PCR（Inverse-PCR,IPCR）、Alu-PCR、接头PCR（Cassette-ligationmediated-PCR,CLM-PCR）三种PCR（Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应）方法在乙型肝炎病毒基因组（HBV DNA）整合位点筛选中的应用效果.方法 手术获取1例乙肝表面抗原（HBsAg）阳性的肝癌患者的肝癌组织,提取基因组DNA,设计相应引物,分别采用三种PCR方法进行扩增,将PCR产物回收,克隆至PMD18-T载体进行基因测序,利用BLAST工具进行序列比对,分析三种方法在乙型肝炎病毒（HBV）DNA整合位点确定中的效果.结果 采用Inverse PCR方法检测PCR产物后得到7个特异性电泳条带,克隆后得到测序结果22个,经序列比对发现3个整合位点;采用Alu-PCR方法,产物电泳得到13个特异性条带,得到测序结果32个,序列比对未发现整合位点;采用CLM-PCR方法,得到12个特异性电泳条带,得到测序结果4个,未发现整合位点.结论 在查找HBV整合位点的研究中,IPCR方法具有较稳定的扩增能力及较高的位点检测率.     

小鼠IL-10重组慢病毒载体的构建和病毒包装

目的:构建小鼠IL-10重组慢病毒表达载体并进行包装,为进一步研究IL-10基因修饰树突细胞在哮喘免疫耐受中的作用提供实验基础。方法:小鼠IL-10基因片段经PCR扩增后,与酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,获得PGC-LV-IL-10重组慢病毒并转化细菌感受态细胞。克隆菌落行PCR鉴定,对阳性的重组质粒进行测序并转入293T细胞,荧光显微镜下观察GFP表达并行Western blot鉴定。将重组质粒与慢病毒包装系统一同转染293T细胞进行病毒包装,Real-time定量PCR法检测病毒滴度。结果:DNA测序结果及Western blot鉴定证实成功构建小鼠IL-10重组慢病毒载体,对其进行包装后测定慢病毒滴度为2×108TU/ml。结论:成功构建并包装小鼠IL-10重组慢病毒表达载体。     

小鼠水通道蛋白1基因shRNA慢病毒载体构建与鉴定

目的 应用RNA干扰技术,构建小鼠水通道蛋白1(AQP1)基因重组慢病毒载体并鉴定.方法 对小鼠AQP1 mRNA分析,设计合成的单链引物经退火形成双链寡核苷酸序列,连接入经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切线性化的pLKO.1-TRC慢病毒质粒载体中,菌液PCR鉴定并经测序验证.测序正确后与慢病毒包装辅助质粒共转染293T细胞,收集病毒上清经高速离心浓缩后感染小鼠小胶质细胞BV-2,Western blot法分析筛选有效shRNA序列.结果 成功退火合成3对发夹shRNA序列并将其克隆到pLKO.1-TRC载体中,构建重组质粒pLKO-AQP1-SH1、2、3,经菌液PCR鉴定和测序验证载体构建成功.Real-time PCR检测发现重组质粒pLKO-AQP1-SH2感染BV-2细胞后AQP1 mRNA表达最低,Western blot结果进一步验证结果的准确性.结论 成功构建出AQP1基因shRNA慢病毒载体.     

外源基因在转基因小鼠中整合状况的分析

目的研究外源基因在转基因小鼠及其家系中的整合状况。方法采用PCR、定量PCR和荧光原位杂交(FISH)的方法对原代转基因小鼠中外源人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因的整合和嵌合情况进行分析。使用PCR、直接测序法鉴定整合的外源基因多拷贝的连接方向和连接方式。结果7个家系中F0-8、F0-10和F0-11的后代中阳性个体比例明显低于50%,3个原代小鼠DNA中hFⅨ基因拷贝数分别只有子代中的66.2%、18.8%和28.3%。F0-11小鼠各脏器中嵌合比差异极大,且未见胚系特异性分布。不同个体间整合拷贝数差异极大,最少的F0-69为单拷贝,最多的F0-10有43个拷贝。而整合位点分析发现外源基因在随机分布中仍呈现一定的趋向性。PCR和测序结果证明所有小鼠中外源基因多拷贝均为头尾连接,连接的机制以粘性末端介导的连接为主,F0-13中还存在同源序列配对、断裂、修复介导的头尾连接。结论在整合有hFⅨ基因的转基因小鼠中多拷贝外源基因多以粘性末端介导的头尾连接方式整合在染色体的某些特定区域。     

A cre-lox recombination system for the targeted integration of circular yeast artificial chromosomes into embryonic stem cells

The ability to produce embryonic stem (ES) cell lines containing different yeast artificial chromosomes (YACs) integrated into the same location in the genome provides a system for comparing the bio-logical effects of YAC transgenes without the confounding influences of integration site and copy number. A targeting system was developed for the directed integration of circular YACs into mouse ES cells. The system combines Cre-lox recombination technology, specifically a positive-selection integration system, with circular YAC lipofection technology to achieve single copy targeted integration of a transgene. Three independent germline competent ES cell lines [lox-containing ES lines (designated LES)] were created that contain a '-neo-lox' cassette integrated at different sites within the ES genome. A plasmid containing YAC vector sequences and a complementary '-neo-lox' cassette was used to circularize two linear YACs containing genomic DNA from human chromosome 21. The circularized YACs were then targeted to the lox sites of the LES cell lines. Polymerase chain reaction and Southern analysis demonstrated that 21% (5 of 24) of lox-recombinants contain a full-length intact YAC. This system will make the study of YAC transgenic mice more reliable and reproducible, allowing the potential for direct comparison of different transgenes expressed from the same site within the genome.     

Targeted integration into a rRNA locus results in uniform and high level expression of transgenes in Leishmania amastigotes

This report describes the construction of a DNA cassette for integration into a genomic small sub-unit rRNA locus of Leishmania mexicana by homologous recombination. Reporter genes encoding beta-galactosidase or green fluorescent protein and the gene conferring hygromycin resistance were integrated downstream of a RNA polymerase I-driven rRNA promoter. To ensure high expression of the marker proteins in the intracellular, amastigote stage, transgene coding sequences were followed by the intergenic region of the L. mexicana cysteine proteinase B 2.8 gene which provides processing signals required for high level expression in this life-cycle stage. Integration of the DNA cassette was also efficiently obtained in L. major. We show that either beta-galactosidase or the green fluorescent protein were abundantly, stably and uniformly expressed in promastigotes and amastigotes of both Leishmania sp. The transgenic lines allow parasite detection at high sensitivity in the tissues of infected mice and will be useful to follow infections in macrophages in culture and in animal hosts.     

Reciprocal homologous recombination in or near antibody VDJ genes

To determine if rearranged heavy chain variable (VDJ) genes can recombine with each other by crossing over of DNA strands, we constructed a transgene that contained a promoter, VDJ gene, reporter gene to detect crossover events, intron enhancer, matrix attachment region, and constant gene for IgM (Cμ). Following immunization of transgenic mice, hybrid molecules were isolated from B cell DNA which contained the transgene recombined with the endogenous IgH locus. Reciprocal products of crossovers were detected by plasmid rescue and PCR amplification, and they were sequenced. Recombination occurred somewhere within 147 bp of homology that contained the J_H4 gene segment and 3′ flanking DNA. The recombined transgenes had a 20-fold increase in mutation in the VDJ region compared to nonrecombined transgenes, which indicates that DNA sequences 3′ of the Cμ gene in the endogenous IgH locus are necessary for full activity of the mutator mechanism. The recovery of recombinants between VDJ transgenes and endogenous VDJ genes raises the possibility that reciprocal recombination may somatically diversify rearranged genes between maternal and paternal alleles.     

条件化转染MT基因小鼠模型的建立

目的建立四环素诱导调控的MT转基因小鼠模型。为血管瘤试验研究及MT致瘤机理研究奠定基础。方法通过PCR方法从鸡的基因组序列中克隆绝缘子元件；构建四环素诱导调控的条件化转基因质粒，并将其调控元件和受控元件串联成一个载体，在两元件之间插入绝缘子，以减轻两者之间的相互干扰。为提高转基因的表达效率，在转基因盒的上游亦插入绝缘子元件；将MT基因亚克隆至此载体；转基因载体功能行细胞瞬转试验及半定量逆转录-PCR验证后，将其在体外扩增、酶切、回收，行小鼠受精卵原核注射，获得转染MT基因阳性小鼠；强力霉素体外诱导部分阳性鼠MT基因表达，使其具有血管瘤表型。结果绝缘子元件成功克隆；成功构建条件化转基因载体；体外试验证实目的基因的表达受强力霉素的严格调控；通过原核注射，获得5只转基因阳性鼠；2只行体外诱导2月后。1只出现血管瘤表型，逆转录．PCR检测证实MT表达。其余3只阳性小鼠在传代建系中。结论条件化MT转基因小鼠模型成功构建，此小鼠模型能够为血管瘤的试验研究及MT致瘤机理的体内研究提供一定的基础。