新生牛血清对大鼠脂肪来源细胞生长的影响

目的探索新生牛血清对大鼠脂肪来源细胞生长状态的影响。方法用新生牛血清代替传统的胎牛血清对脂肪来源细胞进行体外培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态,与胎牛血清培养条件下的脂肪来源细胞形态进行比较。结果新生牛血清培养条件下的大鼠脂肪来源细胞镜下呈短梭形或多角形,与胎牛血清培养的脂肪来源细胞形态相似,但细胞在P2～P3代即出现了衰老趋势。结论新生牛血清对体外培养的脂肪来源细胞的活力有负面影响,可能不适用于脂肪来源细胞的培养。     

骨髓间充质干细胞培养条件的改良及其定向分化

目的：探讨建立大鼠骨髓间充质干细胞（ BMSCs）快速、有效的体外分离纯化方法。方法全骨髓离心贴壁法分离大鼠BMSCs;分别采用同种异体血清培养基（同种异体血清组）、胎牛血清培养基（胎牛血清组）、无血清培养基（无血清组）培养BMSCs,传代后换用胎牛血清培养;12、24、48、72 h和5 d首次换液;绘制P3代BM-SCs生长曲线;免疫荧光鉴定BMSCs CD44和vimentin的表达;诱导BMSCs的骨向、内皮向分化;茜素红检测钙结节表达;免疫荧光鉴定血管内皮样细胞CD31和vWF的表达。结果（1）同种异体血清组及胎牛血清组细胞形态均一,生长速率相似。（2）P3代BMSCs生长曲线显示：同种异体血清组与胎牛血清组倍增速率相似,均快于无血清组。（3）P3代BMSCs免疫荧光染色显示：同种异体血清组与胎牛血清组CD44、vimentin表达均高于无血清组。（4）成骨诱导14 d后,茜素红染色可见大量橘红色钙化结节形成。（5）内皮诱导14 d后,内皮样细胞表面标志物CD31、vWF阳性。结论改良培养条件后所获得的骨髓细胞具有间充质干细胞的表型和功能特点。     

鼠脂肪干细胞的分离、培养和鉴定*

目的：研究脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）的分离、培养和鉴定的方法，为组织工程、细胞疗法、基因疗法提供可靠的细胞来源。方法：采用反复贴壁法从小鼠脂肪组织中分离、纯化脂肪干细胞，观察其细胞形态，MTT法测定其生长曲线，流式细胞仪对干细胞表面标志物进行鉴定，采用不同诱导液对脂肪干细胞进行诱导，鉴定其多系分化能力。结果：接种后第2 d，大多数呈纺锤形，少数呈三角形、多角形等形状。至第5 d左右，呈成纤维细胞样梭形细胞。至第9～10 d，细胞呈均一的梭形；传代细胞形态与原代细胞类似，但生长速度加快，生长曲线为“S”形曲线。经测定 CD90 阳性细胞达到 96.6%；CD44 阳性细胞数达到85.3%；CD11b、CD45阳性细胞均为 0.5%。经油红O染色检测，诱导的干细胞胞质中的脂滴被染为红色；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色表现为细胞内灰黑色或黑色颗粒，Von Kossa染色表现为细胞内可见黑色的矿化结节；用阿尔新蓝染色检测，将软骨结节样结构染成蓝色。结论：反复贴壁法可以从小鼠脂肪组织中分离出ADSCs，具备干细胞的各项特征，为干细胞的临床应用提供丰富的干细胞来源。     

胎盘来源间充质干细胞诱导分化为成骨细胞的实验研究

目的：掌握体外分离、培养扩增胎盘间充质干细胞的方法,探讨其成骨细胞定向诱导分化的能力。方法：用IV型胶原酶消化人胎盘组织,获得单个核细胞,接种于10%新生牛血清（FBS）低糖培养基中（DMEM）,贴壁后常规换液、传代,流式细胞仪检测其表面标志,用β 甘油磷酸钠,维生素C,地塞米松联合诱导,使胎盘贴壁细胞分化为成骨细胞,诱导后10?d检测碱性磷酸酶（ALP）活性,并行茜素红染色。结果：培养7～14?d后有少量贴壁细胞生长,逐渐呈成纤维细胞状,表达CD29、CD44和CD105,不表达CD34、CD45、CD19;在成骨诱导10?d后细胞ALP活性明显增强,茜素红染色可见钙盐沉积。结论：胎盘组织可能是新的间充质干细胞来源。     

人体脂肪干细胞培养及成骨诱导分化

目的 通过成人脂肪体外分离培养脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）研究其生理特性及在特定培养条件下向成骨分化,探讨脂肪源性干细胞作为骨组织工程的种子细胞的前景.方法 从成人脂肪中利用胶原酶消化法分离并体外培养干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,CCK8检测细胞活性,P3代脂肪干细胞通过成骨诱导液诱导向骨细胞分化,BCIP/NBT比色法染色检测碱性磷酸酶（AKP）,茜素红染色检测钙结节形成,RT-PCR检测碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OP）表达变化.结果 成人脂肪间质来源的ADSCs,能稳定传代,增殖能力旺盛;流式细胞检测证实其特异表达相关干细胞表面标记物;成骨诱导后表现出呈典型的成骨细胞形态;ALP染色阳性,茜素红染色阳性,诱导培养0、3、7、14、21、28天后RT-PCR定量检测证实细胞中ALP、OP阳性表达.结论 成人脂肪中可分离得到ADSCs,其稳定表达特异性的表面抗原,并且经过相应诱导培养后可向骨细胞分化,阳性表达OP、ALP,可作为优良的骨组织工程的种子细胞来源.     

体外培养人牙髓干细胞的生物学特性

目的 研究体外培养的人牙髓干细胞的生物学特性.方法 收集因正畸拔除的第一前磨牙,用酶消化法分离能够形成克隆且具有高增殖力的细胞,细胞以低密度接种传代培养;免疫荧光法检测第3代细胞表面标志的表达;取第4代细胞,用含有20%胎牛血清、地塞米松、β甘油磷酸钠和维生素C的培养液诱导3周,茜素红染色观察诱导后细胞矿化情况,免疫荧光法检测牙本质涎蛋白(DSP)表达,改良Kaplow氏法检测诱导前后碱性磷酸酶的表达.结果 诱导前细胞表达Stro-1、Cbfa-1、和Ⅰ型胶原,碱性磷酸酶呈弱表达,不表达DSP;诱导后细胞表达DSP,碱性磷酸酶呈强表达,并可见钙结节形成.结论 分离所得细胞具有较高的增殖和分化能力,与间充质干细胞具有相似的表面标志,并在诱导后表达DSP而具备牙髓干细胞的特征.     

体外培养人牙髓干细胞的生物学特性

目的研究体外培养的人牙髓干细胞的生物学特性。方法收集因正畸拔除的第一前磨牙,用酶消化法分离能够形成克隆且具有高增殖力的细胞,细胞以低密度接种传代培养;免疫荧光法检测第3代细胞表面标志的表达;取第4代细胞,用含有20%胎牛血清、地塞米松、β甘油磷酸钠和维生素C的培养液诱导3周,茜素红染色观察诱导后细胞矿化情况,免疫荧光法检测牙本质涎蛋白(DSP)表达,改良Kap low氏法检测诱导前后碱性磷酸酶的表达。结果诱导前细胞表达Stro-1、Cbfa-1、和Ⅰ型胶原,碱性磷酸酶呈弱表达,不表达DSP;诱导后细胞表达DSP,碱性磷酸酶呈强表达,并可见钙结节形成。结论分离所得细胞具有较高的增殖和分化能力,与间充质干细胞具有相似的表面标志,并在诱导后表达DSP而具备牙髓干细胞的特征。     

脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定

目的分离培养脐带血间充质干细胞并检测其生物学特性。方法在无菌条件下用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞,接种含10％胎牛血清的DMEM培养基中。单个核细胞行贴壁培养后,进行细胞形态学观察,绘制细胞生长曲线,分析细胞周期,检测细胞表面抗原。结果采用Percoll（1．073g／mL）分离的脐血间充质干细胞大小较为均匀,梭形或星形的成纤维细胞样细胞。细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期,至第9天后数量减少;流式细胞检测表明50％～70％细胞为CD29和CD45阳性。结论体外分离培养脐血间充质干细胞生长稳定,可作为组织工程的种子细胞。     

脐带血间充质干细胞分离培养体系的优化筛选

目的对人脐带血间充质干细胞的分离方法、培养条件进行优化筛选。方法在无菌条件下用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞,接种含10%胎牛血清的DMEM培养基中。单个核细胞行贴壁培养后,进行细胞形态学观察,绘制细胞生长曲线,分析细胞周期,检测细胞表面抗原。结果采用Percoll（1.073g/mL）分离的脐血间充质干细胞大小较为均匀,梭形或星形的成纤维细胞样细胞。细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期,至第9天后数量减少;流式细胞检测表明50%～70%细胞为CD29和CD45阳性。结论体外分离培养脐血间充质干细胞生长稳定,可作为组织工程的种子细胞。     

肾癌OS-RC-2细胞CD133的表达及意义

目的: 培养肾癌干细胞球,研究其表面分子特性.方法: 肾癌细胞悬浮于含有表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的无血清培养基中培养,培养7天后收集细胞球,流式细胞仪检测CD133及CD34的表达.结果: 悬浮培养2天后出现肾癌干细胞球,培养7天后干细胞球明显增多,流式细胞仪检测发现表达CD133+CD34-细胞约占(8.33±1.26)%,对照肾癌细胞组表达CD133+CD34-细胞只占(1.24±0.36)%;干细胞球通过含10%胎牛血清培养基继续培养,又恢复原来的生长特点.结论: 利用无血清悬浮培养方法得到的肾癌干细胞球高表达干细胞表面分子标记CD133.     

脂肪干细胞的分离培养及成心肌诱导

目的 探讨脂肪干细胞的分离培养以及成心肌细胞分化的可能性,为脂肪干细胞治疗缺血性心脏病的应用提供理论依据。方法自SD大鼠提取脂肪组织,用酶消化法分离脂肪干细胞,培养于a-MEM培养基中。显微镜下观察细胞生长情况及形态特征,流式细胞仪检测脂肪干细胞表面分子的表达情况。用5-氮胞苷对脂肪干细胞进行诱导,显微镜下观察细胞生长情况及形态变化,免疫组织化学方法检测心肌特异性抗体-αActin的表达。结果分离培养的脂肪干细胞形态近似梭形,流式细胞仪检测结果显示CD90及CD105高表达,而CD34及CD45极低表达。经5-氮胞苷诱导后的脂肪干细胞呈类似心肌细胞的形态学特征,免疫组织化学检测结果见心肌特异性标志物-αActin表达阳性。结论脂肪干细胞具有较强的分化为心肌样细胞的能力,可以应用于缺血性心脏病细胞治疗的研究。     

成人脂肪源间充质干细胞培养上清对人脐血间充质干细胞体外培养及扩增的支持作用

目的：研究人脂肪间充质干细胞培养上清对人脐带血（HUCB）中所含有间充质干细胞（MSCs）的影响。方法：取脐带血,肝素抗凝,Percoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,低糖DMEM培养获得贴壁细胞层。与人脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育。流式细胞仪检测表面抗原。结果：脐带血的单个核细胞与人脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育经体外培养贴壁后出现形似纤维状细胞形态并表达与MSCs相关的抗原（CD13,CD44,CD71,CD166）,但不表达造血细胞抗原（CD34,CD45）,这与源于骨髓的MSCs一致。结论：人脐血间充质干细胞与脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育,对脐血间充质干细胞体外分离培养及扩增有支持作用。     

人羊膜间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的建立人羊膜间充质干细胞分离、培养及鉴定方法。方法采用低速旋转-胰蛋白酶-胶原酶消化法分离人羊膜间充质干细胞（hAMSCs）,采用免疫细胞化学和流式细胞术分析其表型特征,使用含10％FBS低糖-DMEM培养基培养。结果从羊膜分离的hAMSCs数为（6．72±1．21）×10^7/份（n=12）,所分离的kAMSCs明显表达间充质细胞标志物波形蛋白,不表达上皮细胞标志物角蛋白CK19,高表达CD29和CD44。培养10天hAMSCs数量可增殖167倍。结论建立了人羊膜间充质干细胞分离、培养及鉴定方法,hAMSCs具有骨髓间充质干细胞的表型特征。     

大鼠脂肪干细胞分离培养及细胞表型的研究

目的：分离、培养和冻存大鼠脂肪干细胞,并对其相关的细胞表型进行研究,为利用脂肪干细胞治疗梗阻性肾病肾纤维化等实验提供依据。方法取大鼠3只,经消毒麻醉,采集其腹股沟处脂肪组织分离培养其中的脂肪干细胞,用相差倒置显微镜观察细胞生长方式及形态变化。取第三代细胞用流式细胞仪作细胞免疫表型的鉴定。冻存复苏后再次检测干细胞生长情况及表型。结果大鼠脂肪组织中含有大量间充质干细胞,原代培养的ASCs呈小圆形或星形,经传代后的脂肪干细胞形态比较均一,呈长梭形,个别略呈多角形、漩涡样生长。其细胞表型为CD29、CD44高表达,CD73、CD105中等程度表达,CD34极低表达。脂肪干细胞经低温冻存3个月,复苏后,生长活力和存活率与冻存前未见明显区别,CD44和CD29检测与冻存前表达率也一致。结论建立了一种脂肪干细胞的有效分离、培养及保存方法,并对其表面标志物进行鉴定,为利用脂肪干细胞进行进一步的实验研究提供了依据。     

人脂肪源性基质细胞体外培养的实验研究

目的:探索人脂肪源性基质细胞(hADSCs)原代培养方法.方法:取成人脂肪,采用原代消化细胞培养法培养,对培养细胞进行形态学研究,测定生长曲线,对第2代细胞进行免疫细胞化学染色,鉴定其表面分子CD44.结果:成人脂肪组织中含有大量间充质干细胞,约70%～80%的细胞表达CD44.结论:建立了一种人体脂肪组织分离、培养hADSCs的简便方法.     

不同来源的间充质干细胞线粒体结构及活性鉴定

目的 培养脂肪、骨髓、牙髓及脐带4种不同来源的间充质干细胞,并鉴定其线粒体结构和活性。方法通过流式细胞术、透射电子显微镜及细胞代谢分析仪等技术分别检测各种间充质干细胞的纯度、内部线粒体的超微结构及呼吸耗氧量。结果脂肪、骨髓、牙髓及脐带4种间充质细胞均成纤维状贴壁生长,同时表达CD73、CD90及CD105,不表达CD34、CD11b、CD19、CD45及HLA-DR;ASC与BMSC较DPSC与UCDSC线粒体结构成熟,代谢水平高。结论脂肪、骨髓、牙髓及脐带来源的细胞均具有间充质干细胞的特点,但其线粒体结构和活性等方面存在差异。     

人脂肪间充质干细胞的原代培养及体外成骨成脂诱导分化

目的: 建立体外分离培养获得人脂肪间充质干细胞（human adipose derived mesenchymal stem cells,hADSCs）的方法,并观察其形态、免疫表型、生物学特性。初步探讨其体外成骨过程中出现成脂现象的原因及机制。方法 ： 剖宫产手术获得腹部皮下脂肪,0.15%Ⅰ型胶原酶消化法获得人脂肪间充质干细胞并进行体外培养。行MTT细胞增殖实验绘制增殖曲线,使用流式细胞及细胞免疫荧光技术检测细胞表面抗原,行成骨成脂分化鉴定其分化潜能。通过RT PCR技术检测成骨成脂过程中过氧化物酶体增殖物激活受体γ 2（peroxisome proliferator activated receptorγ 2,PPARγ 2）和骨桥蛋白mRNA表达情况。结果 ： 通过分离培养,获得了大量旋涡状生长的人脂肪间充质干细胞。MTT法显示细胞增殖能力强。流式细胞鉴定结果显示,CD29、CD73、CD105、CD166高表达,CD31、CD34、CD45、HLA DR低表达。细胞免疫荧光结果与之相符。hADSCs在特定诱导条件下,具有成骨成脂分化潜能。在成骨分化过程中同时伴有成脂发生。RT PCR结果显示,与对照组相比,成脂诱导组PPARγ 2 mRNA有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,成骨诱导组骨桥蛋白,PPARγ 2 mRNA均有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义（P<0.01）。结论： 建立了一种分离培养hADSCs简单可靠的方法。获得的细胞具有贴壁生长、增殖活性强、干细胞表型以及多向分化等特征。hADSCs体外成骨过程中,三酰甘油的形成对成骨具有一定的促进作用。     

骨髓和脂肪源多潜能间充质干细胞的比较研究

①目的比较骨髓源间充质干细胞和脂肪源间充质干细胞的生物学特性。②方法分离人的骨髓源间充质干细胞和脂肪源间充质干细胞进行体外培养，通过绘制生长曲线，比较细胞的增殖能力；利用流式细胞仪分析细胞表型，并与诱导培养比较细胞的分化潜能进行比较。③结果脂肪源间充质干细胞与骨髓源间充质干细胞具有相当的生物学特性，且在增殖能力方面优于骨髓源间充质干细胞。④结论人脂肪组织可能成为一种新的间充质干细胞来源。     

大鼠骨髓间充质干细胞多向分化潜能的研究

 目的 分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MSCs）,并行多向分化潜能的鉴定。方法 经Percoll梯度分离法获得大鼠骨髓单个核细胞。贴壁培养后,通过倒置显微镜进行细胞形态学观察,并采用流式细胞术进行分析。传至第3代后,分别进行成脂肪细胞、神经元样细胞、血管内皮样细胞的诱导,并行免疫组织化学鉴定。结果 骨髓间充质干细胞大小较为均匀,基本上呈梭形或星形的上皮样细胞,传代培养后的细胞体积增大,成纤维样细胞逐渐增多。经反复传代纯化的MSCs检测CD71、CD29呈阳性表达并证实骨髓间充质干细胞经诱导后分化为脂肪细胞、神经元样细胞、血管内皮样细胞。结论 在体外,大鼠骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,可作为组织工程的种子细胞。     

克隆化的人骨髓间充质干细胞系的建立及其生物学特性的研究

目的:分离人骨髓间充质干细胞(hMSCs),建立克隆化扩增的细胞系并初步鉴定其分化特性和细胞的分子标记.方法:利用间充质干细胞贴壁生长的特性,显微镜下挑取原代单个成纤维样生长单位中的细胞,逐步扩大培养,最终得到克隆化扩增的hMSCs.选择有利于其生长的血清,低密度培养,传70%～80%生长汇合时传代保种.RT-PCR检测其Oct-4、SDF1、CD49a、CK19、c-met基因的表达;流式细胞术检测细胞表面抗原CD34、CD45、CD14、CD44、CD29、CD90、HLA-1和HLADR;体外向骨、软骨、脂肪细胞方向诱导分化鉴定其分化潜能.结果:建立了人骨髓间充质干细胞系并在体外实现了克隆化扩增,该细胞系在体外连续培养达60个细胞倍增时间仍保持多向分化的潜能.细胞不表达CD34、CD45、CD14、HLA-DR,但表达Oct-4、SDF-1、CD49a、CK19、c-met、CD44、CD29、CD90、HLA-1.体外能诱导出骨、软骨、脂肪细胞.结论:得到了一个可稳定传代的克隆化扩增的人骨髓间充质干细胞系,该细胞系在体外可以分化为骨、软骨、脂肪细胞,并表达Oct-4、CK19和c-met.