嗅黏膜神经干细胞的体外培养和向酪氨酸羟化酶阳性神经元的分化

目的:建立体外培养和诱导嗅黏膜神经干细胞向酪氨酸羟化酶阳性神经元分化的方法,探讨该细胞的干性和分化特性。方法:首先用含10%胎牛血清的DMEM/F-12混合培养基培养成年大鼠嗅黏膜细胞,当细胞贴壁后将培养基更换为含表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor,bFGF),不含血清的干细胞培养基,以促进干细胞增殖形成神经球。将神经球取出用干细胞培养基悬浮培养以纯化扩增神经干细胞。应用干细胞相关蛋白Nestin及CD133的抗体对神经干细胞进行免疫荧光染色,观察上述蛋白在细胞的表达。用Neurobasal培养基(含B27、NGF、ATRA及SHH)培养扩增后的神经干细胞,诱导其向神经元分化。用神经丝蛋白(neurofilament-200,NF-200)和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)抗体对分化的细胞进行免疫荧光染色;用免疫印迹法检测上述细胞裂解样品内的相应标志蛋白的电泳条带。结果:嗅黏膜神经干细胞高表达Nestin及CD133两种神经干细胞标志蛋白;干细胞经诱导分化后其形态具有神经元特征,并且高表达NF和TH两种神经细胞标志蛋白。结论:贴壁/悬浮序贯培养方法可体外纯化扩增嗅黏膜神经干细胞,该细胞可分化为酪氨酸羟化酶阳性神经元。     

用组织块法培养成年和老年鼠神经干细胞

目的　探索体外培养扩增成年及老年动物室管膜下区 (SVZ)神经干细胞的实用方法。方法　取 8、14及 2 4三个月龄SD大鼠SVZ组织块置含bFGF的DMEM/F12 +B2 7培养液培养 ,Nestin免疫组化法鉴定细胞表型。结果　各月龄的SVZ组织块均能长出Nestin阳性的神经小球及神经干细胞 ,培养 7～ 10天产生的神经球最多 ,神经干细胞状态最佳。结论　用含bFGF的培养基培养成年和老年大鼠SVZ组织块能产生较多的神经干细胞 ;此法是一种具有实用价值的培养、扩增神经干细胞的手段。     

骨髓神经组织定向干细胞的分离培养鉴定

目的:为临床中枢神经系统疾患的细胞移植及组织工程修复周围神经提供一种应用广泛、可来源于自体、无免疫排斥和伦理道德等问题的移植用种子细胞。方法:采用DMEM/F12(1∶1)无血清神经干细胞培养液,通过先贴壁、后悬浮的方法从大鼠骨髓中分离、培养单克隆生长的神经组织定向干细胞(neural tissue-committed stem cells,NTC-SCs),通过免疫细胞化学检测NTCSCs细胞球CXCR4和Nestin蛋白,以及细胞球自然分化后神经元β-TublinⅢ、MAP2ab以及神经胶质细胞CNPase、GFAP等蛋白的表达。结果:NTCSCs细胞球表达神经干细胞标志蛋白Nestin和组织定向干细胞标志蛋白CXCR4;NTCSCs细胞球在含15%胎牛血清的DMEM培养液中可自然分化,免疫荧光显示神经元和神经胶质蛋白β-TublinⅢ、MAP2ab、CNPase、GFAP等标志物阳性。结论:本研究提供了一种操作简便、成本低廉的NTCSCs的分离培养方法,NTCSCs作为种子细胞为脑、脊髓等神经系统疾患和创伤的修复和治疗提供了广阔的应用前景。     

联合应用EGF和NGF对成年大鼠海马神经干细胞分化的影响

目的探讨联合应用表皮生长因子(EGF)和神经生长因子(NGF)对成年大鼠海马神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子、B27的无血清细胞培养技术体外培养成年大鼠海马神经干细胞,单克隆培养细胞行Nestin免疫细胞化学染色,诱导分化1w后细胞行GFAP和NSE免疫细胞化学染色;根据培养基中所加营养因子的不同将第4代细胞分为4组培养:EGF组、EGF+NGF组、NGF组、对照组,此4组细胞培养1w后行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例后进行统计学分析。结果单克隆培养后克隆球表达Nestin,诱导分化1w后细胞表达NSE、GFAP。与空白对照组相比,EGF组、NGF组和EGF+NGF组细胞分化为神经元的比例较高(P<0.05),其中EGF+NGF组细胞的比例最高。结论单独或联合应用EGF、NGF可以促进成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化。     

EGF培养条件下NGF与BDNF对大鼠海马神经干细胞向神经元分化的差异

目的探讨在表皮生长因子(EGF)培养条件下,相同浓度神经生长因子(NGF)与脑源性神经生长因子(BDNF)对成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化比例的差异。方法用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、EGF、B27的无血清细胞培养技术体外培养成年大鼠海马神经干细胞,单细胞克隆后行Nestin免疫细胞化学染色,诱导分化1周,行GFAP和NSE免疫细胞化学染色;根据培养液中所加营养因子的不同将单细胞克隆传代细胞分为5组培养:EGF组、NGF组、BDNF组、EGF+NGF组、EGF+BDNF组,此5组细胞培养1周,进行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例后进行统计学分析。结果:单细胞克隆培养后克隆球细胞表达Nestin,诱导分化1周,细胞表达NSE、GFAP;与EGF组、NGF组、BDNF组相比,EGF+NGF组和EGF+BDNF组细胞分化为神经元的比例较高(P<0.05),其中EGF+BDNF组细胞的比例最高。结论在EGF培养条件下,BDNF促进成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化的能力高于NGF。     

小鼠胚胎皮质、海马来源的神经干细胞在体外增殖特性的比较研究

目的探讨皮质、海马来源的神经干细胞增殖特性的异同,为神经干细胞基础和临床研究在取材部位上提供参考资料。方法无菌条件下分别分离E11-15天小鼠胚脑皮质和海马,经胰酶消化及机械吹打制成单细胞悬液后,在含B27和bFGF的DMEM/F1224孔板中培养扩增,倒置显微镜观察比较生长状况,免疫细胞化学染色技术鉴定神经干细胞,采用BrdU掺入法检测不同部位来源NSCs的增殖情况。结果小鼠胚胎脑皮质与海马均存在神经干细胞,皮质部位神经干细胞比海马部位神经干细胞更易培养,也更易成球,前者神经球数目、BrdU阳性细胞率也明显高于后者。结论同样条件下皮质神经干细胞比海马神经干细胞更易培养和增殖。     

表皮生长因子对胶质瘤干细胞增殖与侵袭的影响

目的研究表皮生长因子(EGF)对胶质瘤干细胞生物学行为影响。方法胰蛋白酶消化法进行胶质瘤细胞原代培养,然后将培养基更换为含有EGF、bFGF、B27的DEME/F12培养基,培养后获得悬浮生长的肿瘤球细胞。悬浮生长的肿瘤球进行免疫荧光及分化实验。CCK-8方法检测EGF对胶质瘤干细胞增殖能力影响。Transwell方法检测EGF对胶质瘤干细胞侵袭能力影响。Western blotting实验研究EGF对胶质瘤干细胞中金属基质蛋白酶(MMP)-2表达影响。结果悬浮生长肿瘤球为胶质瘤干细胞。EGF促进胶质瘤干细胞增殖和侵袭,同时提高胶质瘤干细胞MMP-2表达。结论 EGF促进胶质瘤干细胞的增殖和侵袭与调控MMP-2信号通路相关。     

用组织块法培养成年、老年鼠神经干细胞

体外组织块培养成年、老年哺乳动物室管膜下区 ( SVZ)神经干细胞的研究甚少。本研究的目的是探索体外培养神经干细胞的实用方法及扩充神经干细胞作为移植或基因转移的供体细胞来源。取 8、1 4及 2 4月龄 SD大鼠 (雌雄不拘 ) SVZ组织块作体外培养 ,在 DMEM/F1 2 B2 7培养液中加入 b FGF( 2 0 ng/ml) ,促进其组织块形成神经小球 ,刺激神经干细胞增殖 ,并用 Nestin免疫组化鉴定。结果显示 ,培养 7～ 1 0 d产生的神经小球数量多 ,细胞生长状态佳 ,绝大多数细胞为 Nestin阳性的神经干细胞 ,此期的神经干细胞较适宜于作细胞移植或基因转…     

胎鼠大脑皮质神经干细胞的分离培养和鉴定:有向多种成体神经干细胞分化的潜能吗?

背景:脑室周围白质软化是早产儿脑损伤的主要类型,迄今尚无防治方法。对丢失大量少突胶质细胞的白质进行神经干细胞移植,理论上应是治疗脑室周围白质软化最为理想的方案。目的:体外培养制备具有多向分化潜能的胎鼠神经干细胞,以供后期实验经脑室移植应用。方法:取孕12~14d胎鼠大脑皮质组织,剪成1.0mm3小块制备单细胞悬液分离纯化,待形成细胞球后加入含小牛血清的DMEM/F12培养基进行诱导分化培养。观察神经干细胞的原代、传代培养情况,免疫组化法对神经干细胞分化情况进行鉴定。结果与结论:培养的神经干细胞活力为(94.3±2.2)%,原代培养3d形成神经球,体外传至10代左右,神经球的细胞团增殖速度明显减慢,部分细胞老化。各代神经球均呈巢蛋白染色阳性,可确认为神经干细胞。进一步对第4代神经球诱导分化培养后,免疫组化结果分别呈GFAP,β-tublin和O4阳性。提示所制备的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,并具备向神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞分化的潜能。     

大鼠大脑皮质神经前体细胞的分离培养及其增殖分化鉴定

目的:体外分离和培养大鼠大脑皮质神经前体细胞并进行增殖和分化鉴定。方法:分离2周龄大鼠皮质神经前体细胞,在含EGF、bFGF和GDNF的NSC培养基中进行体外培养,使用免疫细胞荧光染色技术对细胞的分化特性进行鉴定。结果:EGF、bFGF和GDNF可促进神经前体细胞的增殖及神经球的克隆形成,并获得了Nestin阳性的神经前体细胞,其可分化为分别表达β-Ⅲtubulin、GFAP和GalC的阳性细胞。结论:体外分离和培养的大脑皮质神经前体细胞,在含EGF、bFGF和GDNF的NSC培养基中培养,具有增殖分化的能力,有望应用于神经系统疾病的细胞移植治疗。     

大鼠胚胎神经干细胞的纯化、诱导分化及鉴定

探讨胚胎神经干细胞 (Neural stem cell,NSCs)的体外纯化扩增、保存标记、诱导分化及其鉴定方法。将14 .5 d胎龄大鼠大脑额叶皮质 NSCs在无血清 DMEM/ F12 (含 2 0 ng/ ml b FGF,2 0 ng/ m l EGF及 B2 7辅助培养液 )培养 ,利用有限稀释法将悬浮生长的单个细胞所形成的克隆球挑选出来、通过亚克隆连续传代大量扩增而纯化 ,免疫组化鉴定 nestin抗原阳性 ;选取部分 NSCs冻存、复苏后 nestin抗原阳性 ;用 Brd U孵育 NSCs,被 Brd U标记的 NSCs及其血清诱导分化后仍均呈 Brd U阳性。用血清或饲养层诱导 NSCs分化为大量表达 Tubulin- (神经元特异性抗原微管蛋白 3)阳性的神经元和 GFAP(神经胶质纤维酸性蛋白 )阳性的神经胶质细胞。由该实验可知有限稀释单细胞克隆连续传代是分离纯化、大量扩增胚胎期大脑 NSCs的简单有效方法。饲养层细胞也能诱导 NSCs分化为神经细胞。 Brd U可标记、示踪神经系统疾病动物模型 NSCs的实验治疗。掌握 NSCs的体外纯化培养、保存标记、诱导分化及鉴定方法可为进一步研究 NSCs的生物学特性及神经系统疾病的治疗提供新方法。     

胚鼠神经干细胞培养与鉴定

目的　体外获取高浓度神经干细胞 (NSC)。方法　加入bFGF培养E12天大鼠胚脑的全部细胞 ,用荧光免疫组化法显示。结果　加bFGF的神经干细胞 (Neuralstemcell,NSC)大量分裂 ,形成大量的细胞分裂球 ,传到 4代时 ,90 %以上的细胞表达nestin。对照组分裂的细胞少 ,维持到第二代细胞逐渐死亡。结论　bFGF对胚胎E12天大鼠脑细胞的NSC有明显的促分裂作用 ,应用此种方法可获得高浓度的NSC     

无血清培养新生Wistar大鼠神经干细胞及免疫荧光鉴定

目的在无血清条件下,分离培养新生1d的Wistar大鼠神经干细胞,观察其生长及分化情况,并对其生物学特性进行鉴定。方法取新生1d的大鼠海马组织,机械分离法分离神经干细胞,加入含有表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、B27的DMEM/F12无血清培养基中培养、增殖。倒置显微镜下观察神经干细胞的增殖分化情况,采用免疫荧光染色鉴定其生物特性。结果从新生大鼠海马组织分离培养的神经干细胞在无血清培养基中不断增殖,免疫荧光染色显示巢蛋白呈阳性表达。诱导分化后,免疫荧光染色可见高分子量神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白和髓鞘碱性蛋白阳性表达细胞。结论无血清条件分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。     

小鼠胚胎大脑皮质与中脑神经干细胞培养与分化比较的研究

目的比较小鼠胚胎脑皮质与中脑来源的神经干细胞在培养与分化方面的差异，为更好的研究和利用神经干细胞提供实验依据。方法无菌条件下分别分离鼠胚大脑皮质与腹侧中脑，经胰酶消化及机械吹打成单细胞后接种于含有B27、bFGF的DMEM／F12培养基，培养扩增；倒置显微镜观察比较生长状况；机械方法传代；10％血清接种分化；免疫荧光细胞化学方法染色鉴定神经干细胞及其子代细胞的分化方向，并作比较。结果小鼠胚胎脑皮质与中脑均存在神经干细胞，其免疫细胞化学鉴定均呈Nestin阳性，并都能分化为神经元和胶质细胞；但皮质部位所含神经干细胞明显多于中脑，也更宜成球；有血清条件下分化，皮质神经干细胞未见分化为酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元；中脑神经干细胞则可少量分化为TH阳性神经元结论同样条件下皮质神经干细胞比中脑神经干细胞更易增殖与培养，两者在有血清条件下分化为TH阳性神经元能力方面有差异。     

新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及分化研究

研究新生大鼠海马区脑组织中神经干细胞体外培养方法,为治疗神经系统疾病寻找合适的细胞来源。取新生SD大鼠的海马区脑组织,采用accutase结合机械分离法获取神经干细胞,在含有B－27、碱性成纤维生长因子和表皮生长因子的DMEM／F12无血清培养液中培养;Accutase酶消化后传代培养,取第3代细胞行抗巢蛋白免疫荧光染色鉴定并以含10％胎牛血清培养液诱导分化,神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色检测NSCs向神经元及胶质细胞分化的能力。分离的新生大鼠海马区脑组织中细胞,在无血清培养液中形成大量的神经球,部分神经球出现融合及贴壁分化现象,细胞呈典型NSCs 形态。经巢蛋白染色鉴定,大部分为阳性细胞。神经细胞球经含有胎牛血清培养液培养后,可分化为神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白表达阳性的细胞。从新生大鼠海马组织分离培养的NSCs具有自我更新和增殖能力,在含胎牛血清培养液中具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。     

体外培养获取高纯度神经前体细胞

目的　获取较高纯度的神经前体细胞 (NPC)。方法　加入 30ng/mlbFGF培养E12天大鼠皮质、海马和隔区的NPC ,用免疫组化与免疫荧光组化方法将其显示。结果　加bFGF组的NPC不断分裂 ,形成大量的分裂球并维持到第 4代 ;绝大部分细胞 (约 98%以上 )表达Nestin ,约有 6 0 %为BrdU和Nestin免疫荧光双标阳性细胞。对照组的分裂球维持时间较短 ,随培养时间延长细胞向外迁移生长 ;第 2代约有 6 0 %细胞表达Nestin ,40 %为BrdU和Nestin免疫荧光双标阳性细胞。结论　bFGF对E12天大鼠脑组织的NPC有明显的促分裂作用 ,选用胎龄较小的胚脑组织加入适量的bFGF培养可获取较高纯度的NPC。