超顺磁氧化铁标记对大鼠脂肪干细胞向肝样细胞诱导分化的影响

目的 研究超顺磁氧化铁(SPIO)标记对大鼠脂肪干细胞(ADSCs)向肝样细胞诱导分化的影响.方法 0.25％Ⅱ型胶原酶消化SD大鼠脂肪组织,获取原代ADSCs.采用多聚赖氨酸(PLL)介导SPIO(25 μg/ml)标记ADSCs,以肝细胞生长因子(HGF)作为主要诱导因子,分成标记-诱导组、未标记-诱导组、标记-未诱导组及未标记-未诱导组,后2组分别作为对照.光学显微镜检测标记细胞内的铁摄取.台盼兰染色评价ADSCs的细胞活力.SPIO标记-诱导组和未标记-诱导组细胞均向肝样细胞诱导分化.分别在诱导前、诱导后7、14、21d糖原染色分析肝样细胞内糖原储存;免疫细胞化学染色和RT-PCR分析肝样细胞内白蛋白(ALB)的表达.结果 ADSCs胞浆内铁标记率为100％.SPIO标记组与未标记组的细胞活力差异无统计学意义(P＞0.05).标记诱导组与未标记诱导组在诱导后14d细胞胞浆糖原染色均为阳性;诱导21d后,2组细胞胞浆内染色阳性的细胞增多.14、21 d ALB mRNA和蛋白表达水平逐渐增强.结论 SPIO标记对大鼠ADSCs的生长及其向肝样细胞诱导分化无明显影响.     

超顺磁氧化铁和EGFP双标NGF基因修饰中脑神经干细胞的建立

目的:建立超顺磁氧化铁(SPIO)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双标神经生长因子(NGF)基因修饰中脑神经干细胞。方法:以质粒pcDNA3-hNGF、pEGFPN1共转染第三代大鼠胚胎中脑神经干细胞并用SPIO标记。荧光显微镜检测EGFP的表达;免疫细胞化学、Western Blot鉴定NGF的表达;普鲁士蓝染色、透射电镜鉴定SPIO标记。结果:EGFP在基因转染12h后开始表达;免疫细胞化学、Western Blot表明细胞能正确表达NGF;普鲁士蓝染色显示细胞标记率达100%,透射电镜显示SPIO颗粒位于吞饮小泡和胞浆内。结论:建立了SPIO、EG-FP双标记NGF基因修饰中脑神经干细胞,为进一步开展细胞移植治疗帕金森病的研究奠定基础。     

转铁蛋白受体基因对神经干细胞体外增殖和分化的影响研究

目的研究转铁蛋白受体基因(TfR)对神经干细胞(NSCs)体外增殖和分化的影响。方法分别将转铁蛋白受体基因神经干细胞(TfR-NSCs)和正常神经干细胞加入神经干细胞分化液分化7 d后,免疫荧光观察细胞分化及分别计算两种细胞胶质细胞和神经元细胞的分化率;CCK-8法检测其细胞在1 d、2 d、3 d时的A值来观察细胞增殖能力。结果转铁蛋白受体基因神经干细胞和正常神经干细胞均可分化成神经元和胶质细胞,且二者分化率未见明显差异(P0.05);转基因神经干细胞的增殖能力未受抑制(P0.05)。结论转铁蛋白受体基因神经干细胞的增殖分化未受明显影响,为下一步转铁蛋白受体转基因神经干细胞的应用提供支持。     

循证晚期妊娠母儿血清转铁蛋白受体与铁蛋白的相关性

目的 研究晚期妊娠妇女血清及胎儿脐血中铁蛋白、转铁蛋白受体水平的变化并探讨其相关性.方法 根据血红蛋白(Hb)水平的不同各选取30例孕足月妇女定为观察组(100g/L～110g/L)、正常组(≥110g/L).采用双抗体夹心法和透射免疫比浊法分别测定母血和脐血铁蛋白、转铁蛋白受体水平.结果 观察组母血铁蛋白、转铁蛋白受体水平分别为(12.28±1.84)μg/L和(4.18±0.82)mg/L,脐血铁蛋白、转铁蛋白受体水平分别为(163.47±36.27) μg/L和(8.71±1.02)mg/L,与正常组的差异有显著性(P＜0.01);母血中铁蛋白、转铁蛋白受体水平呈负相关(P＜0.01).结论 通过对母血、脐血铁蛋白、转铁蛋白受体的测定可以了解孕妇、胎儿体内的铁营养状态,早期发现铁缺乏;铁蛋白、转铁蛋白受体的负相关调节,使妊娠晚期补充铁剂的治疗更安全.     

超顺磁氧化铁制备及在生物医学领域的应用

背景：超顺磁氧化铁在生物医学领域应用非常广泛,尤其是靶向诊断和治疗方面。 目的：总结超顺磁氧化铁的理化性质、制备方法、表面改性、产品检测及其在生物医学领域的应用。 方法：以“superparamagnetic iron oxide,preparation,coprecipitation,surface modification,magnetic resonance imaging contrast agent,fluorescent tracing,targeted therapy”为检索词,检索2000至2012年Sciencedirect、PubMed数据库的文献;以“超顺磁氧化铁,制备,表面改性,磁共振,荧光示踪,靶向诊断,靶向治疗”为检索词,检索2006至2014年CNKI、万方数据库的文献。 结果与结论：超顺磁性纳米颗粒能够通过实验室的方式制备出来,制备方法包括水热法、气相沉淀法、机械球磨法、液相微介质电加热法、溶胶-凝胶法、乳化法、共沉淀法等,并且能够通过表面改性及修饰使其具备不同的特性,应用于生物医学的多个领域,如磁共振对比剂、荧光示踪、纳米颗粒靶向治疗、磁热疗及生物分离等。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料;骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性;组织工程     

超顺磁性氧化铁和DAPI双标记骨髓间充质干细胞

背景：骨髓间充质干细胞目前已经成为重要的组织工程种子细胞,而若想深入研究其在体内外增殖、分化的规律,首先需要解决如何能高效、安全地标记骨髓间充质干细胞。 目的：观察超顺磁性氧化铁及DAPI对大鼠骨髓间充质干细胞的双标记效果及其对细胞存活、增殖以及凋亡的影响。 方法：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,用超顺磁性氧化铁及DAPI双标记后分别用普鲁士蓝染色法和激光共聚焦显微镜观察其铁标记率及荧光标记率。用锥虫蓝检测细胞活力;MTT法检测标记干细胞增殖力;Calcein-AM/PI以及AO/PI双染细胞,检测细胞存活率以及凋亡率。 结果与结论：超顺磁性氧化铁及DAPI在体外双标记大鼠骨髓间充质干细胞效率高,可达100%;锥虫蓝染色显示标记细胞的存活率为97%;MTT法检测发现双标记干细胞组的活力以及增殖力与未标记干细胞组相比差异均无显著性意义(P > 0.05);Calcein-AM/PI染色,未标记细胞及双标记细胞的存活率分别为96%和95%;AO/PI染色,未标记及双标记细胞的凋亡率均为1%。提示超顺磁性氧化铁和DAPI双标记大鼠骨髓间充质干细胞后,对于干细胞的存活、增殖以及凋亡无影响。     

超顺磁性氧化铁纳米粒子标记人骨髓和脐带间充质干细胞

背景：优化人源细胞安全、有效的标记参数及细胞移植后的定位是评价其治疗效果至关重要的环节。 目的：比较核磁影像对比剂超顺磁性氧化铁纳米粒子体外标记人骨髓和脐带间充质干细胞的细胞活率、标记效率及核磁共振T2*WI成像的效果,优化标记细胞处理细节。 方法：培养第3代人骨髓和脐带间充质干细胞,以5-30 mg/L菲立磁(Feridex Ⅳ)结合硫酸鱼精蛋白标记细胞。 结果与结论：人骨髓和脐带间充质干细胞标记前后细胞的存活率接近(P > 0.05)。以5-30 mg/L菲立磁标记骨髓间充质干细胞的阳性标记率差异无显著性意义(P > 0.05);而5 mg/L菲立磁标记脐带间充质干细胞的阳性标记率与20和30 mg/L菲立磁标记的差异有显著性意义(P < 0.05);10 mg/L菲立磁标记脐带间充质干细胞的阳性标记率低于骨髓间充质干细胞(P < 0.05)。当≥20 mg/L菲立磁标记细胞时,2种来源的细胞悬液中均出现不易洗脱和过滤去除的氧化铁颗粒。标记后细胞在3.0T MR GRE T2*WI扫描均见随菲立磁的浓度升高,信号强度减弱。提示这2种组织来源的间充质干细胞,以10 mg/L的菲立磁-硫酸鱼精蛋白复合物标记是安全有效的,可用临床T2* WI的MR成像观察。     

超顺磁性氧化铁标记对骨髓间充质干细胞多向分化诱导的影响

研究兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)经超顺磁性氧化铁(SPIO)标记后,体外成骨、成脂及成软骨诱导能力的变化。体外贴壁培养和扩增兔BMSCs,采用SPIO(25μg/ml)联合硫酸鱼精蛋白转染剂标记兔BMSCs,分别采用适宜的成骨、成脂及成软骨诱导培养液对磁标记BMSCs进行体外定向诱导培养3周,诱导过程中观察细胞形态学变化。3周后对成骨定向诱导组进行钙结节茜素红染色和碱性磷酸酶(ALP)组化染色;对成脂肪定向诱导组行油红-O染色;对成软骨定向诱导组行番红O染色、II型胶原免疫组化染色检测观察胞外基质糖胺多糖、II型胶原的分泌和表达。利用Image-Pro Plus图像分析系统对免疫细胞化学染色进行光密度半定量分析。结果表明:超顺磁性氧化铁粒子标记BMSCs后普鲁士染色和电镜检查显示细胞胞浆内含致密铁颗粒;磁标记BMSCs在成骨、成脂及成软骨潜在多向分化诱导能力上与对照组未标记细胞相比无统计学差异。提示,SPIO联合硫酸鱼精蛋白转染剂能成功标记BMSCs,超顺磁性氧化铁标记对兔BMSCs体外多向分化诱导能力无明显影响,合理应用这种新型细胞标记技术将促进对组织工程种子细胞的研究。     

磁共振对超顺磁性氧化铁标记的大鼠间充质干细胞成像的研究

目的:探讨磁共振对超顺磁性氧化铁(SPIO)纳米颗粒体外标记大鼠间充质干细胞进行成像的可行性.方法:多聚赖氨酸修饰的Fe3O4纳米颗粒.分别培养大鼠间充质干细胞至对数生长期,更换为分散多聚赖氨酸修饰的Fe3O4纳米颗粒的培养液,取所培养的细胞进行电镜超微结构观察.磁共振T1WI、FSE T2WI、FIESTA T2*WI三个序列对培养6 h的细胞群成像.结果:同一条件下培养6 h.见有多聚赖氨酸修饰的Fe3O4纳米颗粒进入大鼠间充质干细胞的细胞质内.对培养6h的细胞群磁共振成像中.标记后的大鼠间充质干细胞在FSE T1WI、FSET2WI、FIESTA T2WT三个序列中均可显示SPIO信号.其中在FSE T2WI上各标记细胞的EP管信号均较T1WI信号改变明显.结论:超顺磁性氧化铁纳米颗粒可以标记大鼠间充质干细胞,应用磁共振可以对其进行监测.     

超顺磁性氧化铁微粒磁标记骨髓间充质干细胞效率实验研究

目的探讨不同浓度超微超顺磁性氧化铁微粒（USPIO）与多聚左旋赖氨酸（PLL）标记大鼠骨髓问充质十细胞（BMSCs）的磁标记效率及对细胞生长活力的影响,寻找最佳配比浓度。方法实验采用6周龄Wister近交系大鼠,150g芹右．雄性。用贴壁法分离培养BMSCs。使用6nmUSPIO—PLL复合物标记BMSCs。实验分6组,对照组为未标记的BMSCs（A组）。按照PLL的有无及PLL质量浓度梯度（0、0．25、0．50、0．75、1．00μg／mL）分为5个实验组（B～F组）;其中每个实验组再根据不同浓度铁离子与PLL结合（USPIO的终质量浓度分别为25、50、100、150μg/mL）。使用电子显微镜及光学显微镜观察标记后的BMSCs及BMSCs内的USPIO微粒。BMSCs活力测定采用台盼蓝排除实验。BMSCs生长曲线绘制采用MTT法。MRI观察体外标记后BMSCs的显影。火焰法测量BMSCs内铁含量,验证铁含量与MRI信号的关系。统计学分析采用方差分析。,结果台盼蓝染色证实90％以上标记后BMSCs均拒染台盼蓝。根据BMSCs生长曲线判断单纯使用铁离子质量浓度达到200μg／mL时或PLL用量达1．00μg／mL会对BMSCs的生长产生一定的抑制作用。火焰法测得单独USPIO标记BMSCs与USPIO—PLL标记BMSCs铁含量差异有统计学意义（P〈0．05）。T2WI及SWI序列图像从B组至F组信号强度逐级下降,反映出铁离子的变化情况。结论使用USPIO（100μg／mL）结合PLL（0．75μg／mL）标记BMSCs即对细胞活性和生长无不利影响．且标记BMSCs的信号强度较强。     

超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞的实验研究

目的探讨超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIO）标记青山羊骨髓间充质干细胞的方法,并确定标记颗粒在细胞内的具体位置,评价标记效果。方法抽取骨髓离心,分离间充质干细胞制成单细胞悬液传代培养及扩增,用SPIO标记第三代骨髓间充质干细胞,显微镜下观察发现细胞内胞吞入大量SPIO颗粒后消化培养细胞,离心成团,于2.5%戊二醛固定,透射电镜常规制样,镜下观察并采集图像。结果电镜下骨髓间充质干细胞的超微结构保存良好,胞质内出现大量电子密度高的SPIO颗粒,呈小团状或点状分布,主要位于溶酶体内及滑面内质网、线粒体及胞浆中的膜性结构上,细胞膜表面和核膜上也可见少量的散在颗粒。结论透射电镜下显示用SPIO标记骨髓间充质干细胞阳性率高,超微结构保存良好,准确定位了SPIO在胞内的位置,此法可为干细胞移植的示踪提供依据。     

超顺磁性氧化铁标记人Flk-1+CD31-CD34-间充质干细胞对细胞增殖及向神经细胞分化的影响

目的 探讨磁共振增强剂超顺磁性氧化铁(SHO)标记人Flk-1 CD31-CD34-间充质干细胞(hMSCs)对细胞增殖及向神经细胞分化的影响.方法 实验组hMSCs与含SPIO 50 mg/L及多聚赖氨酸(PLL)1.5 mg/L的培养基孵育过夜(12～18 h).通过生长曲线测定、台盼蓝染色及流式细胞仪检测评价SPIO对hMSCs增殖能力、细胞活性及细胞表面标志物的影响.经神经诱导后,通过免疫荧光法测定神经细胞特异性标志物的表达.结果 连续测定7 d细胞活性,活细胞率均超过90%,对照组及实验组生长曲线符合对数生长模式.两组细胞均表达CD44、CD105及Flk-1,而CD31、CD34为阴性.神经诱导后,神经特异性标志物的荧光A值在两组间无统计学差异.结论 SPIO作为磁共振活体示踪剂是安全、有效的.     

Expression of transferrin receptor and ferritin following ferumoxides-protamine sulfate labeling of cells: implications for cellular magnetic resonance imaging

Ferumoxides-protamine sulfate (FE-Pro) complexes are used for intracellular magnetic labeling of cells to non-invasively monitor cell trafficking by in vivo MRI. FE-Pro labeling is non-toxic to cells; however, the effects of FE-Pro labeling on cellular expression of transferrin receptor (TfR-1) and ferritin, proteins involved in iron transport and storage, has not been reported. FE-Pro-labeled human mesenchymal stem cells (MSCs), HeLa cells and primary macrophages were cultured from 1 week to 2 months and evaluated for TfR-1 and ferritin gene expression by RT-PCR and protein levels were determined using Western blots. MTT (proliferation assay) and reactive oxygen species (ROS) analysis were performed. FE-Pro labeling of HeLa and MSCs resulted in a transient decrease in TfR-1 mRNA and protein levels. In contrast, Fe-Pro labeling of primary macrophages resulted in an increase in TfR-1 mRNA but not in TfR-1 protein levels. Ferritin mRNA and protein levels increased transiently in labeled HeLa and macrophages but were sustained in MSCs. No changes in MTT and ROS analysis were noted. In conclusion, FE-Pro labeling elicited physiological changes of iron metabolism or storage, validating the safety of this procedure for cellular tracking by MRI.     

In vivo MRI using positive-contrast techniques in detection of cells labeled with superparamagnetic iron oxide nanoparticles

Positive-contrast techniques are being developed to increase the detection of magnetically labeled cells in tissues. We evaluated a post-processing positive-contrast technique, susceptibility-gradient mapping (SGM), and compared this approach with two pulse sequences, a gradient-compensation-based "White Marker" technique and an off-resonance-based approach, inversion recovery on-resonance water suppression (IRON), for the detection of superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticle-labeled C6 glioma cells implanted in the flanks of nude rats. The SGM, White Marker and IRON positive-contrast images were acquired when the labeled C6 glioma tumors were approximately 5 mm (small), approximately 10 mm (medium) and approximately 20 mm (large) in diameter along the largest dimension to evaluate their sensitivity to the dilution of the SPIO nanoparticles as the tumor cells proliferated. In vivo MRI demonstrated that all three positive-contrast techniques can produce hyperintensities in areas around the labeled flank tumors against a dark background. The number of positive voxels detected around small and medium tumors was significantly greater with the SGM technique than with the White Marker and IRON techniques. For large tumors, the SGM resulted in a similar number of positive voxels to the White Marker technique, and the IRON approach failed to generate positive-contrast images with a 200 Hz suppression band. This study also reveals that hemorrhage appears as hyperintensities on positive-contrast images and may interfere with the detection of SPIO-labeled cells.     

多聚左旋赖氨酸协同超顺磁性氧化铁标记大鼠C6脑胶质瘤细胞

目的 观察多聚左旋赖氨酸(PLL)协同超顺磁性氧化铁(SPIO)对大鼠C6胶质瘤细胞的标记率及对标记细胞生物活性的影响.方法 将未标记的C6胶质瘤细胞设为对照组,25 mg/L SPIO(A组)、25mg,LSPIO+0.75mg,LPLL(B组)、50mg,LSPIO+1.5mg,LPLL(C组)标记的C6胶质瘤细胞设为实验组.各组细胞处理后分别培养6、24及48 h进行MTS细胞活性检测;普鲁士蓝染色评定标记率;3.0 T MRI GRE/30° T2*WI序列对各组细胞体外成像,比较R2*值及信号强度差异.结果 各实验组细胞处理后48 h均未见细胞活性显著降低(均P>0.05).普鲁士蓝染色显示B组、C组细胞标记率均达到98%以上,而A组约为70%,SPIO与PLL混合标记细胞随SPIO浓度增高染色程度逐渐加深.3.0T MRI体外细胞成像对标记细胞有较敏感的信号变化,对照组及A、B、C组R2*值分别为11.76±5.74、12.13±4.39、61.22±27.85、90.07±35.59,对照组与A组间R2*值差异无统计学意义(P>0.05);B、C组分别与其它各组间比较差异均有统计学意义,且此两组之间差异亦有统计学意义(均P<0.01).结论 PLL可增强SPIO对C6脑胶质瘤细胞的标记作用并对标记细胞活性未产生明显影响.3.0T MRI GRE/30°T2*WI序列对离体标记细胞有较敏感的信号变化,R2*值随着细胞内SPIO浓度的增加而增大.25 mg/L SPIO+0.75 mg,L PLL可获得满意的体外标记效果.     

可溶性转铁蛋白受体与血清铁蛋白在慢性炎症性疾病合并缺铁性贫血诊断中的价值比较

目的：探讨可溶性转铁蛋白受体（Soluble tranferrin receptor,sTfR）与血清铁蛋白（Serum ferritin,SFer）在慢性炎症性疾病合并缺铁性贫血（Iron deficiency anemia,IDA）诊断中的价值。方法：随机选取我院2009年8月至2011年6月收治的29例患有慢性炎症性疾病伴IDA患者,31例慢性炎症性疾病无贫血患者,以及28例健康人,进行SFer,sTfR检测。结果：sTfR在慢性炎症性疾病合并IDA组明显升高,与慢性炎症性疾病无贫血组比较有显著性差异（P〈0.01）;SFer在慢性炎症性疾病合并IDA组有降低,与慢性炎症性疾病无贫血组比较无显著性差异（P〉0.05）。结论：血清sTfR的测定较SFer更能准确反映体内铁贮存情况,对慢性炎症性疾病合并IDA的诊断具有指导意义。     

An unusual case of iron deficiency anemia is associated with extremely low level of transferrin receptor

A case study of a female patient, diagnosed with iron deficiency anemia, was unresponsive to oral iron treatment and only partially responsive to parenteral iron therapy, a clinical profile resembling the iron-refractory iron deficiency anemia (IRIDA) disorder. However, the patient failed to exhibit microcytic phenotype, one of the IRIDA hallmarks. Biochemical assays revealed that serum iron, hepcidin, interluekin 6, and transferrin saturation were within the normal range of references or were comparable to her non-anemic offspring. Iron contents in serum and red blood cells and hemoglobin levels were measured, which confirmed the partial improvement of anemia after parenteral iron therapy. Strikingly, serum transferrin receptor in patient was almost undetectable, reflecting the very low activity of bone-marrow erythropoiesis. Our data demonstrate that this is not a case of systemic iron deficiency, but rather cellular iron deficit due to the low level of transferrin receptor, particularly in erythroid tissue.