瘤体内直接注射白介素2质粒复合物治疗小鼠肝癌

目的研究瘤体内直接注射白介素2质粒/阳离子脂质体复合物治疗小鼠肝癌的效果.方法将小鼠白介素2表达质粒(VR1110)与阳离子脂质体(Transfectam)按适当比例混合而形成复合物(VR1110/Transfectam).通过瘤体内直接注射此复合物治疗小鼠肝癌模型,并和卡介苗(BCG)的治疗相比较.结果瘤体内注射VR1110/Transfectam后,可在肿瘤组织中检测到小鼠IL-2 mRNA的表达.VR1110/Transfectam治疗组以及VR111/Transfectam/BCG治疗组肿瘤生长较其它组明显减慢,均显著提高小鼠的生存率(R＜0.05),但二者相差不明显.结论瘤体内直接注射VR1110/Transfectam复合物对小鼠肝癌的治疗作用明显,效果优于卡介苗,且方法简单,适合临床应用.     

白细胞介素2质粒复合物治疗后小鼠肝癌的组织学变化

目的 探讨瘤体内直接注射白细胞介素2质粒／阳离子脂质体复合物治疗小鼠肝癌的效果和机制。方法 将小鼠白介素2表达质粒（VR1110）与阳离子脂质体（Transfectam)按适当比例混合而形成复合物（VR1110／Transfectam)。通过瘤体内接注射此复合物治疗小鼠肝癌模型,观察治疗后肿瘤积变化、组织学变化及表达情况。结果 瘤体内注射VR1110／Transfectam后,可在肿瘤组织中检测到小鼠IL－2mRNA的表达。VR1110／与Tansfectam治疗组肿瘤生长较其它对照组明显减慢,第1次治疗后第12天肿瘤体积明显小于其它组（P＜0．05）。治疗组小鼠均可见肿瘤组织大量坏死,炎性细胞浸润,及CD4^ 、CD8 淋巴细胞。结论 瘤体内直接注射VR1110／Transfectam复合物对小鼠肝癌的治疗作用明显,增强了小鼠机体对肝癌细胞的免疫学反应。     

转染外源p53基因在荷瘤裸鼠人肠癌细胞中表达的检测

采用直接注射外源ＤＮＡ－脂质体复合物的方法分别在荷瘤裸鼠人肠癌组织中转染外源正义ｐ５３ｃＤＮＡ和反义ｐ５３ｃＤＮＡ的重组表达质粒及非整合型哺乳动物表达载体ｐＲＥＰ９，并以注射等量生理盐水为对照，然后应用链菌素亲生物蛋白－过氧化酶免疫组化法检测肿瘤组织中突变型ｐ５３蛋白的表达。结果表明：体外培养ＳＷ１１１６细胞中约有５０％为突变型ｐ５３蛋白阳性；转染反义ｐ５３ｃＤＮＡ表达质粒组的裸鼠移植瘤细胞ｐ５３蛋白阳性率为２５％，而注射生理盐水、转染ｐＲＥＰ９及正义ｐ５３ｃＤＮＡ表达质粒组阳性率分别为６６．７％，７７．８％，６６．７％；前者与后三者之间有显著住差异（Ｐ＜０．０１，Ｘ［２］检验），但各组间肿瘤大小并无显著性差异。据此认为，肿瘤体内直接转染外源反义ｐ５３基因能封闭肠癌ＳＷ１１１６细胞中突变型ｐ５３基因的表达。     

装载siRNA的纳米阳离子脂质体在小鼠体内的药代动力学研究

目的:探讨siRNA药物的体内药代动力学评价方法,并分析脂质体作为药物载体的优势。方法:采用前期已构建的siRNA表达质粒及装载了该质粒的纳米隐形阳离子脂质体,将实验分为裸siRNA质粒组和siRNA质粒脂质体组,分别进行DNaseⅠ酶切和血清中稳定性的检测。再将20μg siRNA裸质粒及siRNA质粒脂质体通过尾静脉注射进入小鼠体内,分别在注射后0 min、5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、12 h、24 h取血,采用实时荧光定量PCR方法(qPCR)对小鼠体内裸质粒及质粒脂质体进行定量检测,计算各时间点siRNA质粒的浓度。结果:裸质粒在DNaseⅠ中仅20 min就全部降解,质粒脂质体降解较缓慢,到24 h仍有(20.16±2.47)%的DNA残留;裸质粒在80%血清中20 min时仅残留(11.03±0.92)%,在1 h时基本全部降解,质粒脂质体在80%血清中24 h时仍残留(10.26±1.04)%,与裸质粒组相比,脂质体作为载体使siRNA表达质粒在DNaseⅠ及血清中的稳定性显著提高(P<0.05)。在小鼠体内脂质体包裹的质粒半衰期约为2 h,而裸质粒仅为6 min,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:利用qPCR方法可以完成siRNA脂质体的体内检测。阳离子脂质体能够保护核酸类药物进入体内,是一种高效的递送载体,同时脂质体能够提高药物的体内稳定性,延长药物的作用时间。     

PML-RARα系列重组质粒在BALB／c小鼠体内表达分析

目的检测PML-RARα融合基因疫苗在小鼠体内的转录和表达。方法用成功构建的重组质粒（PML-RARα-hIL-2）免疫小鼠，于第0周、2周、4周在双侧股四头肌各注射1次，分离注射部位肌肉，用RT-PCR检测目的基因在小鼠骨骼肌中的转录；应用免疫组织化学染色法检测重组质粒蛋白表达。结果小鼠注射部位肌肉中检测到PML-RARα及hIL-2基因的转录，并可检测到hIL-2蛋白的表达。结论所构建的PML-RARα系列重组质粒可以在小鼠体内有效地表达基因产物，具有DNA疫苗的基本特性。     

IL-24对B16细胞生长抑制作用的体内外实验研究

目的:构建白细胞介素24(Interleukin24,IL24)真核表达质粒,研究其体内外表达对肿瘤细胞的生长抑制作用。方法:采用重组DNA技术构建IL24真核表达质粒pEGFPIL24。用脂质体法将重组质粒及空载体体外转染B16细胞,再经激光扫描共聚焦显微镜(LSM)观察其表达,用MTT法检测B16细胞的体外增殖能力,用流式细胞仪检测细胞周期。小鼠实体瘤模型研究基因转染对肿瘤的体内生长抑制作用。结果:pEGFPIL24转染B16细胞后,LSM可观察到IL24在细胞中的表达。转染IL24基因的B16细胞体外增殖能力明显受到抑制,细胞被阻滞在G2/M期。与对照组相比,IL24基因治疗组肿瘤在体内的生长受到明显抑制,P<0.05。结论:IL24基因转染的肿瘤细胞体外生长受抑。于荷瘤小鼠的瘤内注射pEGFPIL24可抑制肿瘤生长,提示IL24具有明显的体内外抗肿瘤作用。     

不同剂量rhGM-CSF cDNA直接注射小鼠骨骼肌的表达

将表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的重组真核表达质粒(pCG1),以30μg和60μg的剂量分别直接注射小鼠骨骼肌,观察不同剂量的质粒(pCG1)在小鼠体内分泌表达rhGM-CSF的情况。ELISA检测表明,注射60μg质粒DNA的小鼠血液中测得的rhGM-CSF含量与对照组相比有显著差别,而注射30μg质粒DNA的小鼠血液中rhGM-CSF含量与对照组相比无显著差别。以60μg质粒DNA直接注射骨骼肌后第15～20天左右表达量最高,平均约91ng/ml。生物学活性检测结果显示,注射60μg质粒DNA的小鼠血液能维持GM-CSF依赖的TF-1细胞的生长。这提示用质粒DNA直接注射小鼠骨骼肌时,质粒DNA必须达到足够的量。     

不同剂量rhGM-CSF cDNA直接注射小鼠骨骼肌的表达

将表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的重组真核表达质粒(pCGl)．以30μg和60μg的剂量分别直接注射小鼠骨骼肌，观察不同剂量的质粒(pCGl)在小鼠体内分泌表达rhGM-CSF的情况。ELISA检测表明．注射60μg质粒DNA的小鼠血液中测得的rhGM-CSF含量与对照组相比有显著差别，而注射30μg质粒DNA的小鼠血液中rhGM-CSF含量与对照组相比无显著差别。以60μg质粒DNA直接注射骨骼肌后弟15～20天左右表达量最高。平均约91ng／ml。生物学恬性检测结果显示，注射60μg质粒DNA的小鼠血液能维持GM-CSF依赖的TF-1细胞的生长。这提示用质粒DNA直接注射小鼠骨骼肌时,质粒DNA必须达到足够的量．     

脂质体介导mIL-12基因与MHCⅠ基因联合对小鼠实验性肝癌的治疗作用

背景与目的：白细胞介素-12及MHCⅠ基因均已单独用于肿瘤基因治疗,为探索两者的抗肿瘤协同效应,本研究探讨小鼠白细胞介素-12（mIL-12)基因与同种异型的MHCⅠ（小鼠为H-2K）基因联合治疗Balb/C小鼠实验性肝癌。方法：分别应用含mIL-12基因,C57BL/6小鼠H-2K^bcDNA及绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的真核表达质粒载体pcDNA3。体外经新型脂质体LipofectAMINE2000(LF2000)介导转染小鼠肝癌细胞株MM45T.Li,检测转染细胞外源基因的表达,将经LF2000介导pcDNA3/mIL-12与pcDNA3/H-2K^b转染的MM45T.Li细胞,注射于小鼠皮下,观察致瘤性的变化,在荷瘤Balb/C小鼠瘤内注射上述脂质体-DNA复合物,观察瘤体生长情况及小鼠生存期的改变。结果：LF2000介导pcDNA3/GFP转染MM45T.Li细胞的最佳条件为脂质体与DNA为3：1（μg：μg）,转染效率达30%,经LF2000介导pcDNA3/mIL-12与pcDNA3/H-2K^b转染的MM45T.Li细胞,RT-PCR检测有mIL-12和H-2K^bcDNA的特异扩增片段,WesternBlot检测显著有57kDaH-2K^b蛋白表达,ELISA检测mIL-12分泌量达48ng/ml/10^6细胞,经LF2000介导pcDNA3/mIL-12与pcDNA3/H-2K^b转染的MM45T.Li细胞,其致瘤性下降;荷瘤Balb/C小鼠瘤内注射该脂质体-DNA复合物,FACS检测显示小鼠脾脏淋巴细胞中CD3^ ,CD4^ 和CD8^ 的数量治疗组较对照组高,肿瘤生长相对缓慢,且pcDNA3/mILp-12与pcDNA3/H-2K^b联合治疗具有一定的正协同效应。结论：mIL-12基因与MHCⅠ基因联合治疗小鼠肝癌具有正协同效应,增强了抗肿瘤效果。     

pEgr-Endostatin-EGFP抑制黑色素瘤生长及血管生成

目的 检测pEgr-Endostatin-EGFP质粒的表达特性和pEgr-Endostatin-EGFP基因-放射治疗小鼠黑色素瘤的作用。方法pEgr-Endostatin-EGFP重组质粒用脂质体方法转染B16细胞,采用Western blot方法检测Endostatin表达。建立小鼠荷瘤模型,注射质粒并给予5Gy X射线照射,共3次,18天观察肿瘤生长情况,并采用免疫组织化学方法检测肿瘤血管生成。结果 转染了pEgr-Endostatin-EGFP质粒的B16细胞和转染并接受照射的B16细胞组可以检测到Endostatin蛋白表达。C57BL/6J小鼠给予pEgr-Endostatin-EGFP质粒注射并接受肿瘤X射线照射,可以显著抑制肿瘤生长(P<0.01),而且肿瘤局部血管生成明显降低(P<0.01)。结论 本研究数据为肿瘤基因-放射治疗提供了新的治疗方案。     

瘤内注射pSTbAT-脂质体复合物对裸鼠移植瘤抑制效应的实验研究

目的:构建血管生成抑制因子arresten基 因的真核表达载体,并观察瘤内注射质粒DNA 脂质 体复合物对裸鼠移植瘤生长的影响。方法:利用 PCR方法,由重组质粒pGEM Arr中扩增出基因;将 该基因定向克隆于真核表达载体中。20只裸鼠皮 下注射HepG 2细胞,成瘤后以成功构建的质粒 DNA 脂质体复合物瘤内注射,治疗后采用免疫组化 方法检测肿瘤血管密度,并利用arresten基因瘤内注 射的方法对抑制肿瘤的效果进行分析。结果:我们 成功构建arresten基因真核表达载体(pSTbAT)。实 验组肿瘤生长速度较对照组慢(实验组平均15.3个 阳性血管/10个视野,对照组平均112.5个阳性血 管/10个视野)。结论:瘤内注射arresten基因质粒 DNA复合物能抑制裸鼠移植瘤的血管生成,并能抑 制移植瘤的生长。     

pSecTag2B-mIL-18真核分泌表达载体的构建及其抗肿瘤作用研究

目的:探索小鼠IL-18基因治疗肿瘤的方法和疗效。方法:构建pSecTag2B-mIL-18真核分泌表达载体,并用其转染HT-29细胞,RT-PCR和ELISA检测IL-18表达情况;将转染pSecTag2B-mIL-18质粒的HT-29培养上清,加入到小鼠T淋巴细胞培养液,ELISA、RT-PCR检测T淋巴细胞分泌IFN-γ;脂质体包被的pSecTag2B-mIL-18裸质粒,采用肌肉注射法转入Balb/c小鼠,检测IL-18蛋白表达情况;在Balb/c小鼠接种小鼠co-lon-26肿瘤细胞的同时,将表达载体pSecTag2B-mIL-18转入,观察抑制肿瘤生长的情况。结果:1)经酶切和测序鉴定,pSecTag2B-mIL-18真核分泌表达载体所表达的基因序列经比对完全正确。2)pSecTag2B-mIL-18转染HT-29细胞后,IL-18在mRNA和蛋白水平高表达。3)转染后的HT-29培养上清可刺激小鼠T淋巴细胞高水平分泌IFN-γ。4)用裸质粒肌肉注射法将pSecTag2B-mIL-18转入Balb/c小鼠,证明质粒均能够在小鼠肌肉中表达,且表达的蛋白均能分泌到外周血液循环中。5)接种co-lon26细胞的Balb/c小鼠,将pSecTag2B-mIL-18转入小鼠,结果表明IL-18单独应用能明显抑制肿瘤的生长。结论:pSecTag2B-mIL-18裸质粒肌肉注射具有显著的抗肿瘤作用。     

双基因（VP3、IL-18）联合致小鼠骨肉瘤S-180细胞凋亡的效应

目的探讨VP3、IL-18双基因抑制骨肉瘤S-180的联合抑瘤作用。方法将VP3、IL-18基因插入pVAX1表达载体的pCMV启动子之下的EcoRI位点，构建成pVVP3及pVVp3-IL18。将该重组质粒与单独表达凋亡素基因的重组质粒分别注射荷S-180肿瘤细胞的BALB／C小鼠，比较抑瘤趋势和抑瘤率。结果联合应用VP3基因和IL-18基因的重组病毒治疗组的抑瘤率（46．16％）高于单独应用VP3基因组的抑瘤率（19．56％），两组比较有统计学差异（P〈0．05）。结论凋亡素基因具有凋亡诱导效应及体内的抑瘤效应。凋亡素基因VP3与IL-18基因有协同抑瘤效应，联合基因治疗骨肉瘤可提高抑瘤效果。     

IL-12基因联合吡柔比星治疗裸鼠膀胱癌移植瘤的实验

目的 探讨联合应用白细胞介素12(IL-12)质粒和吡柔比星（THP）对人膀胱癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法 将人EJ膀胱癌细胞株裸鼠腋下接种,成瘤后设4组（每组6只）：联合组于骨骼肌注射IL-12真核表达质粒pcAGGS-mIL-12和腹腔注射THP;IL-12组骨骼肌注射pcAGGS-mIL-12;THP组腹腔注射THP;对照组肌肉及腹腔注射0.9%氯化钠溶液,以上注射每周2次,共4次。观察各组裸鼠肿瘤大小变化。4周后处死荷瘤鼠。免疫组织化学法检测肿瘤内VEGF 表达。ELISA法测定血液及肿瘤组织中IL-12和γ-干扰素(IFN-γ)的表达。结果 联合组肿瘤生长明显抑制,瘤重及体积明显小于其他组。ELISA法表明IL-12组和联合组 IL-12和IFN-γ都高表达。免疫组织化学法表明联合组VEGF基因表达量明显低于其他组（P<0.05）。结论 联合应用IL-12真核表达质粒pCAGGS-mIL-12和THP,对人膀胱癌裸鼠移植瘤的抑制作用明显强于单独应用IL-12和THP。     

Adenovirus-mediated gene transfer to orthotopic hepatocellular carcinomas in athymic nude mice

Gene therapy may become an option for the treatment of malignant tumors such as hepatocellular carcinoma (HCC), once safe and efficient vector systems have been established. Due to their stability in vivo, recombinant adenoviral vectors are promising vectors for gene delivery to HCC. To study the characteristics of gene delivery into HCCs by recombinant adenoviral vectors in vivo, we established an in situ HCC model in the livers of athymic nude mice by intrahepatic injection of human HCC cells. Recombinant adenovirus vectors expressing beta-galactosidase (Ad2CMV beta gal) were injected via the tail vein of mice bearing HCC or directly into intrahepatic tumors. Levels of beta-galactosidase expression in tumor tissue and surrounding normal liver were analyzed by histochemistry or for quantification by a chemiluminescence assay in tissue homogenates. Following tail vein injection, high levels of beta-galactosidase expression were found in the liver, but virtually no gene expression could be detected in the tumor tissue. In contrast, after direct injection of Ad2CMV beta gal into intrahepatic HCCs, high levels of beta-galactosidase expression were detected in the tumor tissue. However, single transduced hepatocytes scattered throughout the normal liver could also be identified. These results indicate that barriers such as the endothelial lining of the tumor vasculature impair the efficiency of adenoviral vectors for gene delivery into HCCs by intravenous administration, which can be overcome by direct injection into the tumor tissue. However, due to the observed transduction of disseminated hepatocytes following intratumoral administration, additional HCC-specific targeting to further enhance the safety of adenoviral vectors may be required.     

TGFβ1质粒DNA直接瘤内注射地小鼠肿瘤生长的影响

目的探讨裸ＤＮＡ质粒ＰＭＡＭｎｅｏ－ＴＧＦβ１小人直接注射后的表达及其对肿瘤生长的影响。方法 肺腺癌细胞株ＬＭ３小鼠背部皮下接种,两周后瘤。瘤体内多点多次直接注入质粒ＤＮＡＰＭＡＭｎｅｏＴＧＦβ１,并设空质粒和生理盐水注射组为对照,观察肿瘤生长情况。于第８周将小鼠处死,取新鲜的铰瘤组织提取ＲＮＡ,行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交,并病理制片观察肿瘤组织结构的变化。结果ＴＧＦβ基因治疗组肿瘤生长速度增快,但各     

脂膜微泡对超声介导裸鼠移植瘤EGFP基因转染的影响

Objective:To investigate the feasibility of ultrasound (US) mediated enhanced green fluorescent protein (EGFP)gene delivery in subcutaneous transplanted tumors of human cervical carcinoma (Hela) and the contribution of lipid shell microbubble (LSMB) on gene transfection.Methods:LSMB and plasmid were injected into nude mice by tail vein followed local US irradiation (P LSMB US group).US exposure parameter was set at 2.0 W/cm2,2 min,duty cycle 20%.EGFP expression was evaluated by imaging for 7 days.Nude mice undergoing plasmid injection alone (P group),plasmid injection and US exposure (P US group),plasmid and LSMB injection (P LSMB group) were used as controls.Frozen section and histological examinations were conducted.Expression of EGFP was scored.Kinetics of protein expression post transfection and localization in vivo were evaluated.Results:Plasmid injection with LSMB plus US exposure strongly increased gene transfer efficiency.Strong EGFP expression was mainly seen in LSMB P US group.It was significantly higher than any of the following groups,P group,US P group,or LSMB P group (P＜0.01).In vivo expression level of post-US 3 days was significantly higher than any other time points (P＜0.01).There was not significant expression level of EGFP in other organs or tissues regardless of US exposure.No tissue damage was seen histologically.Conclusion:The combination of LSMB and US exposure could effectively transfer plasmid DNA to transplanted tumors without causing any apparently adverse effect.LSMB could be effective as a non-viral vector system in in vivo gene delivery.It would be a safe gene delivery method and provide an alternative to current clinical gene therapy.     

阳离子脂质体介导pE-CEA-cd-tk对CEA阳性肺癌的杀伤作用

目的：增强E.coli cd/HSV-1 tk自杀基因的细胞毒性，实现阳离子脂质体介导pE-CEA-cd-tk/5-FC GCV体系靶向杀伤CEA阳性肺癌，方法：PCR法分别扩增出CMV增强子，CWA启动子，cd-tk，构建真核表达载体pE-CEA-cd-tk;MTT法检测pE-CEA-cd-tk/5-FC GCV体系的体外细胞毒性，体内实验采用肺腺癌细胞SPC－A－1裸鼠皮下移植瘤模型，通过肿瘤局部或鼠尾静脉注射脂质体／pE-CEA-cd-tk复合物，腹腔注射GCV＋5－FC前体药物进行治疗。结果：阳离子脂质体介导pE-CEA-cd-tk/5-FC GCV体系体外可靶向杀伤CEA阳性肺癌细胞，这种杀伤作用存在显著的细胞差异；体内可抑制小鼠皮下肺肿瘤结节的生长，荷瘤鼠存活期延长。结论：阳离子脂质体介导pE-CEA-cd-tk/5-FC GCV体系体内外对CEA阳性肺癌均具有较强的杀伤作用，有望用于CEA阳性肺癌的治疗。     

B7-1/GFP基因真核表达载体的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达

Objective： To construct eukaryotic expression vector containing B7-1/GFP geneand study its expression in osteosarcoma cell line LM8. Methods： By using gene cloning technique, eukaxyotic expression vector pEGFP-C1 was used to construct the murine B7-1 recombinant plasmid （pEGFP-C1/B7）. Recombinant plasmid was transfected into LM8 cells with liposome and was confirmed by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing. The expression of the fusion protein was detected using fluorescence microscope and Western blot analysis. Results： The recombinant eukaryotic expression plasmid pEGFP-C1/B7 was successfully constructed, which was confirmed by DNA sequencing, RT-PGR and restriction enzymes analysis. The green fluorescent protein could be detected in the transfected LM8 with fluorescence microscope. The expected B7-1 and green fluorescent protein （GFP） fusion protein was detected by RT-PCR and Western blot. Conclusion： The eukaryotic expression vector containing B7-1/GFP gene was constructed successfully, and it could be expressed in LM8 after transfection.