几种固定化苯丙氨酸解氨酶方法的比较

目的：对不同方法固定化苯丙氨酸解氨酶（PAL）的偶联率或包被率以及固定化对PAL活性和稳定性的影响进行比较,以期得到较为方便、有效的固定化PAL。方法：（1）采用不同T：C比例的聚丙烯酰胺凝胶（PAG）包埋PAL;（2）分别用戊二醛和碘化－I－[环己基－3－（3－二甲氨丙基）]碳二亚胺（CDC）将PAL固定于Bio-Gel P-300;（3）分别用超声法、脱水再加水法、复乳法将PAL包被于三种脂类组成不同的质脂体;（4）对诱变选育出的含PAL活性酵母细胞进行丙酮处理。结论：（1）包埋法采用T：C比为8：30时固定化酶活性明显高于PAL活性酵母细胞进行丙酮处理。结论：（1）包埋法采用T：C法为8：30时固定化酶活性明显高于T：C比为8：19,两活性保留率分别为50．6％和17．1％;（2）载体偶联法以戊二醛将PAL固定于Bio-Gel P300优于用DCD固定化的酶,两活性保留率分别为27．2％和13．9％;（3）质脂体包被中以脱水再加水法对酶活性影响较小,脂类组成以磷脂酰胆碱;胆固醇：磷脂酰丝氨酸比值7：21：1最好;（4）固定化PAL活性酵母细胞能较好地抵抗人工肠液中胰蛋白酶的水解作用,亦能明显降低苯丙氨酸的浓度。     

银杏苯丙氨酸解氨酶(PAL)的基因克隆

目的通过克隆银杏苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因并深入研究其结构,利用生物技术改良叶用银杏品质.方法利用PAL氨基酸序列中的保守区设计的简并引物,应用PCR等分子克隆技术,首次成功地从银杏基因组中克隆出了PAL基因片断.结果及结论 PAL基因长度为1140bp,所得序列已登录在NCBI的GenBank中,核酸序列和推测的氨基酸序列的Accession分别为AY231176和AAO73468.     

深红酵母菌苯丙氨酸解氨酶的诱导及纯化

经Ｌ－苯丙氨酸诱导在深红酵母产生高于非诱导培养时６倍的苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）活性，并加以分离纯化，纯化９２．９倍，产率８．９８％。纯化过程中采用不同的亲和洗脱方式，结果表明：在Ｌ－苯丙氨酸－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ进行ＰＡＬ的亲和层析时，用５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８．８Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液平衡上柱后以Ｄ－苯丙氨酸洗脱为好。     

膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析

目的 对膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因进行克隆及序列分析。方法 应用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法,以膜荚黄芪根总RNA为模板克隆PAL基因。结果 所克隆的膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因命名为AmPAL,Genbank登录号为EF567076。序列分析表明,AmPAL全长为2 650 bp,含有一个完整的2 154 bp开放读码框。AmPAL是植物苯丙氨酸解氨酶家族的一个新成员,推测其编码718个氨基酸的多肽,相对分子质量为7.805×104,等电点为5.96,与豆科植物已知的PAL氨基酸序列的同源并且相似性都大于80%。结论 首次成功地从膜荚黄芪中克隆出了PAL基因,为有效利用该基因调控药用植物苯丙烷代谢途径奠定了基础。     

基因工程苯丙氨酸解氨酶对多发性骨髓瘤U266细胞的作用研究

目的 为寻找对多发性骨髓瘤新的治疗方法 ,从基因工程乳酸乳球菌提纯苯丙氨酸解氨酶(PAL),探讨PAL酶对多发性骨髓瘤U266细胞系的影响作用.方法 利用已构建成功的高表达PAL的基因工程乳酸乳球菌,结合物理、化学、生物学等方法 ,设计一种简便、高效提纯PAL酶的方法.培养人多发性骨髓瘤U266细胞系,在不同浓度基因工程PAL酶作用后.以MTT法检测细胞增生;流式细胞仪检测细胞凋亡;HPLC检测细胞培养液中苯丙氨酸(phe)浓度.结果 ①用本研究所设计方法 从基因工程乳酸乳球菌NZ3900/pNZ8149-palart中提取的PAL酶比活性可达同量原菌的92.5%;②0.1～2.0U/ml的PAL提取液作用24h后能显著抑制U266细胞生长,并呈剂量依赖性;③只添加提取过程所用试剂的对照组细胞生长无明显抑制;④0.1U/ml、0.2U/ml、2.0 U/ml的PAL酶作用24h后的MM细胞早期凋亡率分别为(21.92±0.95)%、(50.64±0.86)%、(90.86±2.91)%;⑤PAL酶作用24h后细胞培养液中phe浓度随PAL酶活性增加而降低.结论 本研究所设计方法 可从基因工程乳酸菌高效提取PAL酶;提取过程中的添加试剂对MM细胞生长无明显抑制作用;PAL酶能显著抑制MM细胞体外生长,诱导细胞早期凋亡;PAL酶可降低培养液中的phe水平,且phe浓度与MM细胞生长的抑制作用具有相关性.     

苯丙氨酸氨解酶的包被及其对家兔肠道苯丙氨酸吸收的影响

目的考察苯丙氨酸氨解酶(L-phenylalanine ammonia-lyase,PAL)的包被条件,并考察其对家兔肠道苯丙氨酸吸收的影响。方法绿豆芽(Phaseolus radiatusL.)来源的PAL通过光照、硫酸铵盐析和不同的柱层析等制备过程,使PAL纯化到电泳纯。酶活性的测定用紫外分光光度法,苯丙氨酸含量采用荧光比色法。结果PAL被纯化了74.6倍,并经聚丙烯酰胺凝胶(PAG)固定化(T∶C=8∶30)。该固定化酶比活0.153 U.g-1,固定化百分数为64%。将PAG固定化酶在人工胃液和人工胰液中保温不同时间后,发现该固定化PAL在1 h后全部失活。将PAG固定化的PAL过120目尼纶筛网制成微粒,再用硝酸纤维膜包被,在人工胃液中不同时间保温,发现酶活性可维持2.5 h,包被的酶颗粒在光镜下呈球形,直径2~11.4μm,自然干燥保存1个月不破坏。用硝酸纤维膜包被的PAL与L-苯丙氨酸同时注入家兔小肠腔内,与正常对照比较,PAL对苯丙氨酸有明显消除作用,吸收量减少,血苯丙氨酸浓度上升缓慢。结论该包被条件温和,PAL损失减少,预期可作为口服的酶制剂应用于临床。     

漆树酶的固定化研究

本文对我国特产资源生漆液中漆树酶的固定化进行了研究。考查了各种无机盐溶液处理不同无机载体,活化反应及漆树酶固定化条件对固定化漆树酶性能的影响。研究表明,经ZrCl_4处理后的多孔硅胶作载体的固定化漆树酶活力回收高、稳定性好、重复使用20次其保留活力仍有75%。同时对固定化漆树酶和自由态漆树酶的反应pH、温度、K_m值作了比较。对漆树酶通过过渡金属氢氧化物固定在无机载体土的机理也作了初步探讨。     

基因工程菌CTB2的固定化及其制备L—苯丙氨酸的研究

对以卡拉胶为载体固定化基因工程菌ＣＴＢ２制备Ｌ－苯丙氨酸进行了研究。比较了固定化细胞的最适温度和最适ＰＨ,考察了该固定化细胞的柱以应特性以及产物Ｌ－苯丙氨酸的分离方法。结果表明,固定化细胞的最适温度为３０℃,最ＰＨ为７．０,柱反应最佳空时速度ＳＶ＝０．１９ｈ＾－１底转化率为２０％,固定化酶半衰期大于３０ｄ。     

13C苯丙氨酸呼气试验检测健康成人苯丙氨酸代谢

目的　绘制正常成年人L - [1- 13 C]苯丙氨酸呼气试验时相曲线 ,初步探索年龄和性别因素对13 C苯丙氨酸呼气试验检测苯丙氨酸代谢的影响。方法　 12名健康成年人按性别和年龄分组 ( <4 0岁和 >4 0岁组 )进行比较。每位受试者口服给予 10 0mgL - [1- 13 C]苯丙氨酸 ,应用气体同位素比值质谱仪测量服药前和服药后至 36 0min各时间点13 C丰度。结果　健康成年人口服L - [1- 13 C]苯丙氨酸呼气试验13 C排除速率时相曲线呈单峰 ,峰值位于服药后 10～ 30min ,苯丙氨酸脱羧代谢动力学参数在不同年龄和性别间差异均无显著意义(P >0 .0 5 )。结论　所有受试者13 C排除速率时相曲线呈单峰 ;年龄和性别因素可能不会显著影响体内苯丙氨酸代谢结果     

不同病因高血压大鼠苯丙氨酸的代谢动力学

目的比较自发性高血压大鼠（ＳＨＲ）、肾动脉狭窄型高血压大鼠（２Ｋ１Ｃ）及相应的对照大鼠（ＷＫＹ）静注苯丙氨酸的药代动力学，方法 测定静注（＾２Ｈ）标记的苯丙氨酸后不同时间大鼠血液及不同组织中放射性计数，进行药代动力学拟合及计算。     

苯丙氨酸与对苯醌荷移反应的研究

目的:采用分光光度法研究苯丙氨酸与对苯醌的荷移反应。方法:将苯丙氨酸与对苯醌在pH=8.5的三酸缓冲溶液中,90℃水浴加热30 min的条件下发生反应,并对生成物进行分光光度法研究。结果:荷移络合物的λmax=339 nm,表观摩尔吸光系数ε=2.4×103 L/(moL.cm),在20μg/mL～60μg/mL的范围内符合比尔定律,回收率在99.7%~103.0%范围内,相对标准偏差在2.57%以内。结论:应用此方法测定苯丙氨酸样品含量与使用药典法测量结果一致。     

壳聚糖固定化胰蛋白酶的研究

目的虾蛄壳提取壳聚糖，将胰蛋白酶固定在该壳体聚糖上，方法以自制壳聚糖为载体，一氯醋酸为交联剂，将胰蛋白酶固定化，结果，固相酶的最适温度为５０℃，原酶为４５℃固相酶最适ｐＨ值为７．０，原酶为８．０，固相酶的表面米氏常数Ｋｍ＝１２ｍｍｏｌ／Ｌ，原酶Ｋｍ＝２３ｍｍｏｌ／Ｌ，结论该固定化酶活力较高，抗酸能力强，热稳定性和储存稳定性好，是良好的检验试剂。     

以甲壳胺为载体固定乙酰胆碱酯酶

目的 探讨以甲壳胺为载体固定乙酰胆碱酯酶的最佳条件及固定化酶的理化性质.方法 以戊二醛为交联剂,将乙酰胆碱酯酶固定在甲壳胺上,并分别测定固定化酶与溶液酶的活力.结果 固定化酶与溶液酶的最适温度相同,均为37℃;固定化酶与溶液酶最适pH分别为8.2、8.0;固定化酶在50℃仍有较高热稳定性,而溶液酶活力明显下降;固定化酶的米氏常数Km=0.84 mmol/L,溶液酶的Km=1.16 mmol/L;固定化酶活力回收为44.66%,在重复使用8次后仍能保持原有活力的50%.结论 该固定化酶与溶液酶相比,其热稳定性提高,与底物的亲和能力增大,且重复使用性较好.     

壳聚糖固定胰蛋白酶的研究

目的：从蟹壳中提取壳聚糖，将胰蛋白酶固定在从蟹壳中提取的壳聚糖上。方法：以自制壳聚糖为载体，戊二醛为双官能团交联剂，将胰蛋白酶固定化。结果：０．２ｇ壳聚糖（干）与４％戊二醛交联后再与５．０ｍｇ胰蛋白酶固定结合，效果较好。固定化酶的表现米氏常数Ｋ′ｍ＝１．５ｍｍｏｌ／Ｌ，而天然酶Ｋｍ＝７．６ｍｍｏｌ／Ｌ；固定化酶最适温度为８０℃，比天然酶提高了２０℃；固定化酶最适ｐＨ为７．０．而天然酶为８．０。该载体来源广，易提取，固定化酶的贮存稳定性很好，２个多月重复使用，酶活力未见明显下降