新型脱细胞骨基质-壳聚糖复合支架的生物相容性研究

[目的]评价新型脱细胞骨基质-壳聚糖(ABECM/CS)骨组织工程复合多孔支架的生物相容性和安全性,为临床应用提供实验依据.[方法]采用联合脱细胞方法对猪股骨进行处理后制备脱细胞骨基质/壳聚糖骨组织工程复合支架.分离、培养兔骨髓间充质干细胞传代后进行实验.采用MTT法观察材料浸提液于1、3、5、7d时进行细胞毒性实验观察细胞的活性;将材料浸提液与稀释血混合离心后观察红细胞溶血情况,检测OD值计算相对溶血率;将材料浸提液经静脉注入兔体内进行热原实验,在规定时间内观察兔体温变化.[结果]细胞毒性实验显示,培养1、3、5、7d后各时间段内三组OD值两两比较(P＞0.05)无显著差异,表明材料无毒性.在溶血实验中观察实验材料的溶血率为3.0％,在标准值溶血率5％范围内,提示无溶血现象发生.热原实验结果显示每只兔体温升高均低于0.6℃,且3只兔体温升高总度数低于1.4℃,符合热原检测规定,复合材料无致热作用.[结论]经联合脱细胞处理制备的ABECM/CS复合支架无细胞毒性、无溶血反应、无热原性,具有良好的生物相容性和安全性,可作为构建组织工程骨的支架载体材料.     

去抗原异种松质骨材料的生物相容性研究

目的研究去抗原异种松质骨支架材料的生物相容性,为其在骨缺损修复领域中的临床应用提供实验依据。方法对去抗原异种松质骨支架材料进行急性毒性实验、热源实验、溶血实验、凝血实验、兔肌肉内种植实验和兔桡骨骨缺损修复实验研究。结果去抗原异种松质骨支架材料无毒性、无热源性、不引起溶血和凝血反应,植入兔肌肉后逐渐发生生物降解并被纤维组织取代,兔骨缺损区植入后可被骨组织取代。结论去抗原异种松质骨支架材料具有良好的生物相容性,是理想的骨支架材料。     

可塑形脱细胞软骨基质材料的制备及性状研究

目的 利用牛膝关节透明软骨进行脱细胞处理,制备新型可塑形生物材料,探讨脱细胞软骨基质作为组织工程载体材料的可行性. 方法 采集新鲜牛膝关节,切取关节表面透明软骨,冻干后低温粉碎为软骨微粒,胰酶、Triton X-100及低张Tris-HC1溶液联合作用进行脱细胞处理,冷冻干燥塑形,紫外线交联后制备脱细胞软骨基质材料.采用组织学、免疫组织化学、扫描电镜、孔隙率测定及生物力学检测等对材料的理化性状进行观察分析.取4只成年新西兰白兔骨髓制备BMSCs,传至第3代进行实验.观察浓度分别为100%、10%及1%的材料浸提液培养BMSCs 0、24、48及72 h后相对乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放率,以含5?S的DMEM培养基作为阴性对照,观察细胞毒性作用;并将浓度为1×107 个/mL的BMSCs单细胞悬液与材料复合培养,观察细胞黏附情况. 结果 制备的脱细胞软骨基质材料呈白色多孔状结构.HE染色示材料由纤维状的软骨微粒形成网状结构,基质内无细胞成分残留;阿尔新蓝染色示微颗粒呈蓝色.材料Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性.扫描电镜材料为多孔状海绵结构,孔径30～150μm.压汞法测定材料平均孔隙率为89.37%,平均孔径为90.8μm.力学分析示脱细胞软骨基质材料的压缩模量为(17.91±0.98)MPa,未经脱细胞处理的软骨微粒材料压缩模量为(15.12 ±0.77)MPa,差异无统计学意义(P>0.05);与正常牛关节软骨的(26.30±1.98)MPa比较差异均有统计学意义(P<0.05).细胞毒性实验显示,培养0、24、48及72 h,100%、10%、1%浓度材料浸提液条件培养基和阴性对照DMEM培养基相对LDH释放率差异无统计学意义(P>0.05).细胞黏附实验显示细胞可黏附于材料上,生长状态良好. 结论 牛关节软骨经脱细胞处理后,制成的多孔状脱细胞软骨基质材料,既保持了软骨基质中的主要成分,又具有良好的理化性质和生物相容性,可作为组织工程研究的一种新型载体材料.     

复合类新型骨基质材料生物相容性研究

目的 评价一种新型无机—有机复合类骨基质材料(NBM)的生物相容性。方法 应用组织培养技术对NBM体外复合兔成骨细胞培养1—14天，然后进行形态学观察、细胞增殖、细胞蛋白含量与碱性磷酸团(ALP)活性测定；对NBM采用同种兔体内植入观察2、4和8周，通过倒置显微镜、扫描电镜及组织学观察其体内成骨情况。结果 体外培养时NBM对成骨细胞的体外增殖和ALP的表达无明显抑制作用，成骨细胞与材料可良好黏附、增殖，并分泌大量细胞外基质成分；而细胞—材料复合体肌内植入后4周可见大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润，8周仍未见新生骨组织生成。结论 NBM材料的体内外生物相容性差异可能与NBM免疫原性有关，体内植入后引起宿主免疫反应，影响体内成骨。无机—有机复合材料引起的移植免疫排斥反应应引起组织工程研究的注意。     

生物衍生骨支架材料的组织相容性研究

目的 了解不同处理方法制得的3种生物衍生骨支架材料的组织相容性。方法 将物理化学方法处理制得的复合型完全脱蛋白骨（composite fully deproteinized bone,CFDB)、部分脱蛋白骨（partially deproteinized bone,PDPB)、部分脱钙骨（partially decalcified bone,PDCB)3种材料各10块分别植入兔肌肉内及骨膜下，进行一般观察、血清抗体检测、局部细胞免疫评估、常规HE染色，观测3种材料对机体的毒性作用、免疫效应及骨膜成骨的影响。结果 3种材料均无毒性作用，且能引导周围组织长入材料内；3种材料对骨膜成骨无不良影响，且能促进骨膜形成的软骨或类骨组织钙化形成新骨，并有一定的骨结合能力；3种材料引起机体免疫反应强弱为：PDCB＞PDPB＞CFDB。结论 CFDB、PDPB、PDCB3种天然生物衍生骨材料皆有良好的生物相容性。     

尿道种子细胞与生物可降解材料的生物相容性研究

目的 观察生物可降解材料聚β-羟基丁酸酯(PHB)与种子细胞即兔膀胱移行上皮细胞及平滑肌细胞间的生物相容性,探讨其作为种子细胞载体构建组织工程化尿道的可行性.方法 经过传代培养,分别在PHB与上皮细胞共同培养2、7 d,与平滑肌细胞共同培养1、5 d,每组各取6个样本,用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的增殖情况,并利用扫描电镜检测细胞在材料上的空间生长情况,评估移行上皮细胞和平滑肌细胞与聚β-羟基丁酸酯的生物相容性.结果 平滑肌细胞能够在该材料上正常生长,各组间A值差异无统计学意义(P>0.05);而移行上皮细胞在该材料上只有少量生长,且实验组与对照组间A值差异有统计学意义(P<0.05),而A、B两实验组间A值差异无统计学意义(P>0.05).结论 聚β-羟基丁酸酯与平滑肌细胞具有良好的生物相容性,但其对移行上皮细胞的生长具有一定的抑制作用,生物相容性不甚理想.     

异种脱钙骨基质颗粒的生物相容性实验研究

目的 评价制备的异种脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)植入体内的生物相容性,为进一步实验研究和临床应用提供依据.方法 取猪四肢长管状骨皮质骨经理化处理后,制备脱脂脱钙(材料A)和脱脂脱钙去细胞(材料B)两种粒径为250～810 μm的DBM颗粒和浸提液,骨颗粒脱脂脱钙后测钙、磷含量.采用标准的毒理学方法进行急性毒性实验、皮肤刺激实验、热原实验、溶血实验、细胞毒性实验和肌肉植入实验.结果 未脱钙皮质骨钙、磷含量分别为(189.09±3.12)mg/g和(124.73±2.87)mg/g:DBM颗粒的钙、磷含量分别为(3.48±0.09)mg/g和(3.46±0.07)mg/g;DBM颗粒钙、磷含量分别为未脱钙皮质骨的1.87%和2.69%.急性毒性实验:各组小鼠活动正常,7 d内小鼠无死亡,各组动物未见中毒症状或不良反应;7 d后各组小鼠体重日平均增加差异无统计学意义(P>0.05).皮内刺激实验观察显示,注射材料A、B浸提液和生理盐水处无明显红斑、水肿和皮肤坏死,极轻微刺激.热原实验两组动物体温升高最高均为0.4℃,符合<0.6℃的国家标准.材料A浸提液的溶血率为1.14%,材料B为0.93%,符合<5%的国家标准.异种DBM的细胞毒性为0～1级.肌肉内植入实验显示动物术后生存良好,各植入部位均未见组织坏死、积液及化脓感染.术后不同时间点植入材料A、B组局部细胞免疫定量评分比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 DBM颗粒的毒性程度为无毒,皮肤无刺激,无热原性,溶血率<5%,对细胞无明显毒性,具有良好的生物相容性和一定的骨诱导性.     

生物衍生骨支架材料的体外细胞相容性实验研究

目的 评价不同处理方法制备的生物衍生骨支架材料的细胞相容性。方法 将支架材料,即复合型完全脱蛋白骨（CFDB）、部分脱蛋白骨（PDPB）和部分脱钙骨（PDCB）与人胚骨膜来源的成骨细胞体外复合培养,采用倒置相差显微镜、激光共聚焦显微镜、扫描电镜、流式细胞仪及碱性磷酸酶（ALP）活性检测,观察支架材料的细胞相容性。结果 三种材料上皆有细胞附着生长,三种材料对细胞增殖影响大小为PDCB＞PDPB＞CFDB;三种材料对成骨细胞的细胞周期影响较小,未见异倍体细胞;三种材料对成骨细胞ALP活性的影响大小依次为PDCB＞PDPB＞CFDB。结论 CFDB、PDPB及PDCB无细胞毒性、无致瘤性,皆有良好的细胞相容性,以CFDB为最好。三种材料皆可用于骨组织工程的支架材料。     

衍生肌腱支架材料的细胞相容性研究

目的 探讨衍生肌腱支架材料（tendon derivation biomaterials，TDBM）与肌腱细胞的细胞相容性及肌腱细胞在此三维支架上培养的生物学行为，为肌腱组织工程新型支架材料的应用提供依据。方法将肌腱细胞与TDBM体外复合培养，设置单纯肌腱细胞培养为对照组，进行形态学观察，并检测细胞增殖、细胞周期、细胞DNA倍体水平及肌腱细胞凋亡率。通过^3H-脯氨酸（^3H-Proline）掺入试验了解材料对肌腱细胞胶原合成的影响。结果 肌腱细胞在TDBM上呈梭形生长，TDBM组细胞第2天进入对数增长期，倍增时间为3d，而单纯肌腱细胞培养对照组倍增时间为3．75d。TDBM组与单纯肌腱细胞培养对照组比较，^3H-Proline掺入值差异无统计学意义（P〉0．05），说明细胞功能未受影响。与支架材料复合培养的肌腱细胞DNA指数为0．96，增殖指数较对照组高10．1％，提示肌腱细胞在三维胶原支架上生长速度快，增殖能力强。结论TDBM具有良好的细胞相容性，可作为肌腱细胞的有效载体应用于组织工程化肌腱的构建。     

血管细胞外基质和膀胱平滑肌细胞的生物相容性研究

目的探讨血管细胞外基质(VECM)和膀胱平滑肌细胞的细胞相容性和组织相容性,为临床应用提供依据。方法制备兔VECM,分离培养兔膀胱平滑肌细胞,并以1×10~6个细胞/ml种植于VECM上,相差显微镜和扫描电镜观察细胞的黏附及生长。制备VECM和乳胶的提取液,分别作为实验组和阳性对照组,以培养基为阴性对照组,以无细胞的单纯培养基作为空白对照组。取2～4代对数生长期的膀胱平滑肌细胞,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定VECM浸提液对培养平滑肌细胞的细胞毒性；将VECM植入异体兔皮下,观察其组织相容性。结果兔膀胱平滑肌细胞能在体外培养扩增；接种1h后已有部分细胞黏附于VECM上,随时间推移,细胞逐渐增多,并伸展成梭形；培养第1、3、5天,实验组细胞增殖率分别为95．61%、98．34%、102．91%；阴性对照组为100．00%；阳性对照组分别为35．14%、38,95%、32．66%；实验组细胞增殖率明显高于阳性对照组,差异有统计学意义(P＜0．01),与阴性对照组比较差异无统计学意义(P＞0．05)。动物皮下埋植实验无排斥反应发生。结论VECM具有良好的生物相容性,是一种较好的泌尿道修复支架材料。     

Biocompatibility of acellular human pericardium

BACKGROUND: Previous studies have shown successful decellularization of human pericardium without affecting the major structural components and strength of the matrix. The aim of this study was to assess the biocompatibility and reseeding potential of the acellular human pericardial scaffold. MATERIALS AND METHODS: Pericardia were treated sequentially with hypotonic buffer, sodium dodecyl sulfate, and a nuclease solution. The presence of cellular attachment factors after decellularization was evaluated using immunohistochemistry. The scaffold was seeded with dermal fibroblasts and cellular attachment to and numbers of cells penetrating were assessed over time. Biocompatibility was also evaluated following subcutaneous implantation into a mouse model for three months. RESULTS: After decellularization, the scaffold stained positively for fibronectin, but collagen IV and laminin staining was reduced. Seeded fibroblasts attached to the mesothelial surface and were visualized in the tissue within a week of seeding. The majority of fibroblasts in the tissue were viable and there was evidence of remodeling of the matrix. Analysis of the explanted tissues from mice showed that fresh/frozen and glutaraldehyde-fixed pericardia were encapsulated with a thick layer of inflammatory cells and fibrous tissue. In contrast, the decellularized scaffold was infiltrated with myofibroblasts, CD34+ cells and macrophages, indicating a healthy repair process. Compared with the glutaraldehyde-fixed tissue, the calcium content of the fresh/frozen and decellularized pericardia was negligible. CONCLUSIONS: The pericardial scaffold was biocompatible in vitro and in the mouse model in vivo.     

骨骼肌无细胞基质的制备及其生物相容性研究

目的细胞外基质是脂肪组织工程材料的研究热点之一。通过探讨骨骼肌无细胞基质的制作方法及生物相容性,为其在脂肪组织工程中的应用奠定基础。方法取健康成年小香猪新鲜骨骼肌组织,横切成厚2～3 mm的组织块,采用低渗-去垢剂法脱细胞处理。处理后采用HE染色、Masson三色染色、免疫组织化学染色及扫描电镜检测骨骼肌无细胞基质是否有细胞成分残留,并观察其基本结构;应用MTT法检测骨骼肌无细胞基质细胞毒性。取乳腺癌患者自愿捐赠脂肪组织,分离培养人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs),从形态学、流式细胞学和成脂、成骨分化能力方面进行鉴定。将骨骼肌无细胞基质与第3代hADSCs共培养,于培养后第1、3、5、7天通过细胞活性检测材料上细胞黏附、扩散和增殖情况,了解其与细胞之间的相互作用。结果 HE、Masson、免疫组织化学染色及扫描电镜观察显示骨骼肌无细胞基质肌纤维去除完全,无细胞核残留,基质结构保留完整;大量连接成网状的胶原纤维呈多孔隙样结构,规则排列。MTT检测示骨骼肌无细胞基质细胞毒性为1级,细胞相容性好。细胞活性检测示hADSCs在骨骼肌无细胞基质上能很好地伸展,且能与周围基质黏附,进入基质内部并相互交织。结论经脱细胞处理的骨骼肌无细胞基质具有良好生物相容性,可能作为脂肪组织工程的支架材料。     

骨髓间充质干细胞复合脱细胞血管基质构建组织工程血管的初步研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞复合脱细胞血管基质构建组织工程血管的可行性。方法：采用胰蛋白酶、乙二胺四乙酸和曲拉通X-100对兔主动脉进行脱细胞处理，制备成脱细胞血管基质；体外分离和扩增人骨髓间充质千细胞，并将其作为种子细胞种植于脱细胞血管基质上，复合构建组织工程化人工血管。结果：制备的脱细胞血管基质由胶原、弹力纤维等组成，未见细胞成分残留；体外扩增的人骨髓间充质干细胞种植于脱细胞血管基质上可生长增殖。结论：骨髓间充质干细胞与脱细胞血管基质支架材料复合可成功构建组织工程血管，有望为血管缺损的修复提供一种全新的技术方法和手段。     

Human acellular dermal wound matrix: evidence and experience

A chronic wound fails to complete an orderly and timely reparative process and places patients at increased risk for wound complications that negatively impact quality of life and require greater health care expenditure. The role of extracellular matrix (ECM) is critical in normal and chronic wound repair. Not only is ECM the largest component of the dermal skin layer, but also ECM proteins provide structure and cell signalling that are necessary for successful tissue repair. Chronic wounds are characterised by their inflammatory and proteolytic environment, which degrades the ECM. Human acellular dermal matrices, which provide an ECM scaffold, therefore, are being used to treat chronic wounds. The ideal human acellular dermal wound matrix (HADWM) would support regenerative healing, providing a structure that could be repopulated by the body's cells. Experienced wound care investigators and clinicians discussed the function of ECM, the evidence related to a specific HADWM (Graftjacket^® regenerative tissue matrix, Wright Medical Technology, Inc., licensed by KCI USA, Inc., San Antonio, TX), and their clinical experience with this scaffold. This article distills these discussions into an evidence‐based and practical overview for treating chronic lower extremity wounds with this HADWM.     

脱细胞软骨基质来源的多孔支架复合山羊髓核细胞体内初步构建组织工程髓核的实验研究

[目的]探讨脱细胞软骨基质多孔支架复合PKH26标记的山羊髓核细胞体内异位构建组织工程髓核的可行性.[方法]制备脱细胞软骨基质来源的多孔支架,扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察、天狼星红染色、HE染色观察、MTT毒性检测;分离山羊髓核细胞,通过倒置显微镜观察、番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色进行鉴定;将PKH26标记的山羊髓核细胞接种支架上,体外培养3d后进行LIVE/DEAD活性染色,将细胞支架复合物置入裸鼠皮下,培养6周,病理切片,荧光显微镜下观察,进行番红O、Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组化染色.[结果]扫描电镜观察支架孔隙相连通且分布均匀,天狼星红染色支架呈黄绿相间色,HE支架淡染,MTT检测细胞增殖曲线无统计学差异(P＞0.05);P1代髓核细胞呈软骨样细胞形态,番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色均阳性,PKH26标记后的细胞呈红色荧光;体外LIVE/DEAD染色细胞呈绿色荧光,体内培养6周后,带红色荧光的细胞填满支架孔隙,番红O、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,Ⅰ型胶原免疫组化染色弱阳性.[结论]以脱细胞软骨基质多孔支架复合山羊髓核细胞在体内能够形成组织工程髓核样组织.     

口腔黏膜细胞与膀胱黏膜下脱细胞基质复合物构建组织工程化尿道的实验研究

目的 探讨以兔口腔黏膜细胞与同种异体膀胱黏膜下脱细胞基质(BAMG)复合物构建组织工程化尿道的可行性.方法 新西兰雄性兔24只,距尿道外口2.0 cm剥离尿道黏膜(2.0 cm×0.8 cm)后,随机分实验组和对照组,每组12只.切取实验组兔口腔黏膜组织分离细胞,在有灭活的3T3细胞培养皿上进行培养扩增,将培养获得的第2代口腔黏膜细胞种植于BAMG(2.2 cm×1.0 cm)上,植入实验组兔尿道缺损区域;对照组单纯采用无细胞植入的BAMG修复尿道.分别于术后1、2、6个月观察动物排尿情况,行尿道造影,8 F尿管插管确定有无狭窄;随后处死实验兔,取修复段尿道黏膜组织行组织学检查.结果 细胞培养获得的口腔黏膜细胞形态均一,生长良好;组织形态学、扫描电镜观察见口腔黏膜细胞与BAMG具有良好的相容性.实验组兔术后1、2、6个月伤口愈合良好、排尿通畅,无尿瘘发生,组织学和尿道造影检查显示带细胞修复的尿道形态完整、清晰宽敞,无狭窄发生;术后6个月植入的口腔黏膜细胞仍然存在,并明显扩增.对照组兔则出现排尿困难、尿道狭窄,光镜下发现黏膜及黏膜下存在严重的炎症反应.结论 兔口腔黏膜细胞与同种异体BAMG复合后,可成功用于尿道缺损的修复,构建组织工程化尿道.     

应用脱细胞异体真皮移植增粗阴茎的临床研究

目的：研究应用脱细胞异体真皮移植增粗阴茎的效果、手术并发症及移植物应植入的最佳解剖层次。方法：应用脱细胞异体真皮植入增粗阴茎25例,A组13例,移植物植入Buck’s筋膜深面,白膜浅面;B组12例,移植物植入Dartos筋膜深面,Buck’s筋膜浅面。结果：术后阴茎中段周径增大1．1～3．2cm,A、B两组均无阴茎畸形、勃起功能障碍、脱细胞真皮外露等并发症发生,A组4例早期出现龟头麻木,3个月后恢复正常,B组无类似病例。结论：应用脱细胞异体真皮移植增粗阴茎效果明显,手术创伤小,无供区损伤,但植入Buck’s筋膜深面可引起术后早期龟头麻木。     

神经组织工程基体材料的研制及其生物相容性研究

目的 研究一种脊髓、外周神经组织工程基体材料——具有轴向微管胶原-氨基多糖基质的制备方法,并对其生物相容性进行检测,为脊髓、外周神经节段性损伤提供一种新型修复材料。方法 将注有胶原-硫酸软骨素-6悬浊液硅胶管逐步浸入冷淋液中,浸入速度控制在5×10-4-10×10-8m·s-1之间,冷凝成冰晶圆柱体,冻干,观察不同浸入速度所制材料内部微孔/管排列规律及走行方向,并测量其孔径大小。将所制材料埋植于小鼠肌袋内,观察局部组织形态学改变、并对小鼠血生化和免疫等指标进行检测。结果 浸入速度<2×10-5m·s-1时,材料内微孔走向多呈轴向相一致的微管状规律排列;此材料埋植至小鼠体内后,早期表现为轻微炎症反应,并逐渐减轻,4周后基本消失,肝肾组织细胞的形态和功能正常,埋植部位皮肤切口7 d后愈合良好。结论 所研制的胶原-氨基多糖基质具有不同直径轴向微管的特性和良好的生物相容性,可作为神经组织工程基体材料用于节段性脊髓及周围神经损伤的修复。