问号钩端螺旋体胶原酶在钩体病豚鼠模型的肺组织中的表达

目的通过克隆、表达问号钩端螺旋体赖型赖株的胶原酶基因colA(LA0872),以及制备抗胶原酶的多克隆抗体,观察胶原酶在钩体病豚鼠模型的组织中的表达,为研究其致病机制奠定基础。方法以问号钩端螺旋体赖型赖株基因组DNA为模板,用PCR扩增colA,产物克隆到表达载体pET-28b(+)中,构建含colA的重组质粒;将重组质粒转入E.coli Rosetta(DE3)菌株内,IPTG诱导表达后用Ni-NTA His-Bind亲和层析柱纯化重组蛋白;用纯化的重组蛋白免疫家兔制备抗胶原酶的多克隆抗体;Max Vision二步法染色检测胶原酶在感染钩端螺旋体的豚鼠肺组织中的分布。结果克隆表达目的基因,并成功制备了抗胶原酶的多克隆抗体。免疫组化显示在出血的肺组织中存在胶原酶。结论钩体病豚鼠模型的肺组织中有胶原酶的表达,并且存在于有钩端螺旋体分布的部位。本研究为进一步探讨胶原酶在钩端螺旋体侵袭和宿主组织出血中所起的作用奠定了基础。     

问号钩端螺旋体colA基因产物胶原酶活性及其致病机制研究

目的了解不同问号钩端螺旋体(简称钩体)血清群colA基因分布和序列保守性、表达产物胶原酶活性以及感染细胞时colA基因表达水平变化和产物分泌情况。方法采用PCR及其产物测序法检测我国主要流行的7个问号钩体血清群代表株中colA基因并了解其序列保守性。构建问号钩体黄疸出血群赖型赖株colA基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提取表达的目的重组蛋白rColA。采用分光光度法检测rColA水解I~IV型天然胶原蛋白及Azocoll和Pz-肽合成底物能力并测定其Km和Kcat值。采用实时荧光定量RT-PCR和Western Blot分别检测问号钩体赖株感染HUVEC、BEAS-2B、L-02、HEK293细胞时colA-mRNA水平变化及ColA分泌情况。结果不同血清群问号钩体均能扩增出全长colA基因片段,其核苷酸和氨基酸序列相似性高达99.4%~100%。所构建的colA基因表达系统能有效表达rColA。rColA能不同程度地水解上述6种底物,但水解III型胶原蛋白能力最强(P0.05),其Km和Kcat值分别为2.16mg/mL和35.6h-1。问号钩体赖株感染各靶细胞时colA-mRNA水平显著升高(P0.01),问号钩体-细胞共培养物上清中可检出ColA。结论问号钩体colA基因为序列保守、分布广泛的胶原酶编码基因,感染细胞时该基因产物表达上调并外分泌,从而在问号钩体感染宿主过程中发挥实际作用。     

问号钩端螺旋体赖株基因组中一个新溶血基因的表达及功能鉴定

目的对问号钩端螺旋体赖株基因组中LA0202基因进行克隆表达并对重组蛋白的溶血活性进行初步鉴定。方法以问号钩端螺旋体赖株基因组DNA为模板,PCR扩增LA0202基因并重组到原核表达载体pET28b(+),重组质粒经限制性核酸内切酶酶切并经测序鉴定后,在大肠埃希菌BL21中诱导表达重组蛋白。制备绵羊血平板对表达的重组蛋白进行溶血活性鉴定。RT-PCR检测钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因的转录。结果在大肠埃希菌中成功表达LA0202基因,表达的重组蛋白具有溶血活性。RT-PCR结果显示钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因发生了转录。结论问号钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因发生了转录,LA0202可能为一个新的溶血素基因。     

两株不同毒力株钩端螺旋体37℃培养条件表达谱的差异

目的 钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株毒力株56601（中赖）与钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株减毒株（法赖）在遗传背景上具有很大的相似性，但毒力却差别很大。本研究利用钩端螺旋体的cDNA芯片在全基因组水平上研究毒力差别的机制。方法 利用钩端螺旋体的cDNA芯片，在37℃培养条件下以钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株毒力株56601（中赖）为测试株，以钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株减毒株（法赖）为对照株，测试了芯片表达谱的变化。结果 在37℃培养条件下，毒力株和减毒株的表达谱具有明显的差别。毒力株上调表达的基因有101个，下调表达的有71个。这些差异表达的基因在功能上可分为12类。结论 这些差异表达的基因可能在钩端螺旋体毒力株致病力方面发挥一定的作用。     

钩端螺旋体lipL21基因真核表达质粒的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的构建钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL21基因片段的真核表达重组质粒．利用脂质体体外转染HeLa细胞，探讨其在体外真核细胞中的表达情况，为寻找新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子提供实验依据。方法应用PCR技术从钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组模板中扩增lipL21基因，纯化回收后克隆入pUCM-T载体，再亚克隆入真核表达载体poD-NA3．1（＋），运用脂质体2000将重组体pcDNA3．1（＋）-lipL21转染入HeLa细胞，细胞免疫组化法观察目的基因的表达。结果双酶切及测序鉴定证明成功构建了lipL21真核表达重组体pcDNA3．1（＋）-lipL21，DNA测序显示重组质粒含有561bp的目的基因片段，读码框架正确，无碱基错配及移码突变。重组质粒pcDNA3．1（＋）-lipL21体外在HeLa细胞中能有效表达目的蛋白LipL21。结论成功构建了钩端螺旋体lipL21基因真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-lipL21，且能够在体外真核细胞中表达；为进一步筛选新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子奠定了一定的实验基础。     

螺旋体传染病

梅毒螺旋体荧光定量PCR检测方法的建立和初步临床应用；钩端螺旋体病患的临床观察及护理；梅毒螺旋体外膜蛋白Gpd在Hela细胞中的表达及鉴定；重组钩端螺旋体外膜蛋白酶联免疫吸附（ELISA）检测方法的建立；问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB2和fliR的克隆及原核表达系统的构建；浙江省首次在蜱中检测到莱姆病螺旋体DNA片段。[编按]     

钩端螺旋体的分子分型方法

钩端螺旋体（Leptospira,简称钩体）,属于螺旋体目螺旋体科钩端螺旋体属,分为两个种：双曲钩端螺旋体（Leptospira biflexa）和问号钩端螺旋体（Leptospira interrogans）;前者为腐生性钩端螺旋体,通常对人和动物不致病;后者为寄生性、     

不同毒力钩端螺旋体引起的细胞因子表达的差异

目的通过比较不同毒力钩端螺旋体引起豚鼠细胞因子表达的差异,探讨钩端螺旋体病的炎症反应及其发病机制。方法豚鼠腹腔内分别注射致病性钩端螺旋体赖型有毒株Lai株,赖型无毒株IPAV株,以及非致病性钩端螺旋体Patoc型Patoc1株,观察豚鼠各脏器的病理改变;EnVision二步法检测钩端螺旋体在各脏器中的分布;应用Real-ti me RT-PCR法检测豚鼠血液中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-12、MCP-1mRNA的表达。结果钩端螺旋体IPAV株和Patoc1株不能引起豚鼠组织病变,但是在感染早期引起细胞因子的高表达;而Lai株可以引起典型的钩端螺旋体病病变,但是在感染早期引起细胞因子较低表达。结论致病性钩端螺旋体赖型毒力株Lai株引起的细胞因子的表达明显低于非致病钩端螺旋体Patoc型Pa-toc1株和赖型无毒株IPAV株,可能与钩端螺旋体病炎症反应轻微有关,有利于钩端螺旋体逃避宿主的免疫反应,在体内繁殖扩散。     

问号钩端螺旋体fliN基因原核表达及其产物的鉴定

目的克隆问号钩端螺旋体(简称钩体)黄疸出血群赖型赖株鞭毛相关基因fliN并构建其原核表达系统,鉴定表达产物的免疫性。方法提取钩体株基因组DNA,高保真PCR扩增全长fliN基因片断,T-A克隆后测序。按常规方法构建fliN基因原核表达系统,并用IPTG诱导目的重组蛋白rFliN表达。采用SDS-PAGE结合Bio-Rad凝胶图象分析系统检测rFliN表达量,Ni-NTA亲和层析法提纯rFliN。采用兔抗问号钩体黄疸出血群赖株全菌抗血清的Western blot鉴定rFliN及其免疫反应性。结果与报道的相应序列比较,所克隆的fliN基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%。IPTG诱导原核表达系统pET32a-fliN-E.coliBL21DE3的rFliN表达量约占细菌总蛋白的30%,rFliN提纯后仅见单一的蛋白条带。rF-liN能与抗血清发生免疫结合反应。结论本研究成功地构建了高效表达目的重组蛋白的问号钩体fliN基因原核表达系统,RFliN有良好的免疫反应性,为深入研究FliN致病及免疫保护作用奠定了基础。     

螺旋体传染病

钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32的重组表达及纯化——范薇等(北京军事医学科学院实验动物中心100071)；《军事医学科学院院刊》，2004，28(5)：420-423[目的：构建L32-pQE32重组质粒，诱导表达重组钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32，对重组蛋白进行纯化。方法：采用PCR法从钩端螺旋体DNA中获取编码LipL32的基因片段，     

螺旋体传染病

问号钩端螺旋体lipL41基因表达及重组抗原分析——阮萍等（浙江绍兴理学院医学院312000）：《中华流行病学杂志》，2005，26（8）：608．612[目的：构建问号钩端螺旋体（钩体）ltB／ctB-lipL4／1融合基因及其原核表达系统。方法：采用连接引物聚合酶链反应（PCR）构建ltB-lipL41／1和CtB-lipL41／1融合基因，常规方法构建其原核表达系统。     

螺旋体传染病

洪雅县钩端螺旋体病流行特征分析；问号钩端螺旋体lipL21基因改建及其表达产物免疫原性变化和定位；梅毒螺旋体TpN15重组抗原的克隆与表达;杭州市莱姆病血清流行病学调查;     

问号钩端螺旋体溶血素基因特征分析

目的　预测问号钩端螺旋体黄疸出血型赖株致病因子———溶血素基因 ,并对其编码蛋白结构特征进行深入分析。方法　使用NCBI ,Swissprot/TrEMBL ,ProDom ,Pfam ,Jpred2 ,TMpred ,SignalP ,ClustW对问号钩端螺旋体黄疸出血型赖株溶血素基因诠释 ,所编码蛋白进行在线分析 ,并使用Bioedit软件进行氨基酸同源性比较分析。结果　确定了问号钩端螺旋体黄疸出血型赖株 9个溶血素基因 ,分为两大类 :鞘磷脂酶类溶血素基因和非鞘磷脂酶类溶血素基因。并对溶血素基因编码蛋白二级结构、结构域、跨膜区域、信号肽及进化等进行了分析。结论　多种类型多条溶血素基因同时存在于钩端螺旋体菌中 ,暗示溶血素基因和钩端螺旋体致病性之间有密切的关系 ,可能在致病过程中起重要作用     

问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121的初步研究

目的　探讨问号赖型钩端螺旋体抗原基因的特点。方法　应用６ 种常见内切酶（ＢａｍＨＩ,Ｂｇｌ Ⅱ,ＥｃｏＲⅠ,Ｈｉｎｄ Ⅲ,ＰｓｔⅠ,Ｐｖｕ Ⅱ）对从问号赖型钩端螺旋体０１７ 株的基因文库中筛选出来的重组质粒ｐＤＬ１２１ 外源基因进行酶谱分析,同时用Ｄｉｇｏｘｉｎ 标记的ｐＤＬ１２１ 外源基因片段作探针对不同种属的致病性钩端螺旋体和非致病性钩端螺旋体基因进行杂交分析。结果　显示问号赖型钩端螺旋体重组质粒ｐＤＬ１２１ 外源基因没有６ 种内切酶的酶切位点,重组探针与致病性钩体（ｓｅｒｏｖａｒｌａｉｓｔｒａｉｎ０１７,ｓｅｒｏｖａｒ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓｓｔｒａｉｎ ５６６１０ ,ｓｅｒｏｖａｒ ｐｏｍｏｎａｓｔｒａｉｎ ５６６０８）有杂交信号,与非致病性钩体（ｓｅｒｏｖａｒ ｐａｔｏｃ ｓｔｒａｉｎ Ｐａｔｏｃ Ⅰ,ｓｅｒｏｖａｒｉｌｌｉｎｉｓｔｒａｉｎ ３０５５）无杂交信号,亦不识别大肠杆菌。结论　重组质粒ｐＤＬ１２１ 外源基因可能是问号赖型钩端螺旋体的一个新基因,进一步测序分析将揭示该基因本质,同时因该重组探针能鉴别致病性钩体和非致病性钩体,提示其可用于钩端螺旋体病的早期诊断及钩端螺旋体的鉴定和分类。     

钩端螺旋体赖株豚鼠感染模型的建立和免疫组化法对钩体抗原的检测

目的　建立钩端螺旋体赖型赖株感染豚鼠的动物模型 ,并用免疫组化法检测钩端螺旋体抗原在组织中的分布。方法　不同剂量钩端螺旋体赖株通过腹腔内注射感染豚鼠 ,观察豚鼠发病情况 ,及时解剖死亡豚鼠 ,HE染色观察肝、肾、肺等器官病变 ,EnVision二步法染色检测肝、肾、肺组织中钩体抗原。结果　感染后豚鼠发病 ,死亡与感染的钩端螺旋体剂量明显相关 ,大体标本及HE染色光镜下均出现典型钩体病病变。免疫组化显示在肝、肾、肺组织中均存在钩体抗原。结论　通过钩端螺旋体赖株腹腔注射的方法成功地建立了豚鼠动物模型。应用EnVision二步法染色 ,可有效显示组织中的钩体抗原。为进一步研究钩端螺旋体发病机制奠定了基础。     

3株钩端螺旋体外膜蛋白基因的序列分析

目的 探讨钩端螺旋体外膜蛋白基因在钩体遗传分类中的作用。方法 对我国的2株问号钗体赖型56601株和爪哇型56602株的外膜蛋白基因Ompl1进行PCR扩增,得到外膜蛋白基因并进行了全基因序列分析,测序的2株钩体与流感伤寒型RH52株进行了核苷酸序列比较和推导的氨基酸序列比较。结果 赖型56601和爪哇型56602株钩体Ompl1基因核苷酸序列与流感伤塞型RH52株的同源性分别为89％和80％,的外膜蛋白氨基酸序列的同源性分别为92％和88％。由此可以看出56601株、56602株与RH52株分别属于不同的血清群,这与Yasuda的遗传分类相。结论 我国的赖型56601株和爪哇型56602株及流感伤寒型RH52株Ompl1基因的核苷酸序列存在一定差别,利用Ompl1基因可对钩端螺旋体进行分类和鉴定。     

贵州省3株钩端螺旋体分离株PFGE分型与基因种鉴定

目的应用脉冲场电泳（PFGE）分型技术和16S rRNA基因测序分析技术分别对贵州省3株动物宿主钩 端螺旋体分离菌株进行分子分型和基因种鉴定,了解贵州省钩端螺旋体的分子流行病学特征。方法应用 DNA限制性内切酶Not I对钩端螺旋体染色体DNA酶切后,用PFGE将DNA片段分离,采用BionumericsV4.0将3 株钩体菌株PFGE图谱与中国15群15型参考菌株进行聚类分析;同时,应用PCR扩增几乎全长的钩体16S rRNA基因片段,并将扩增产物进行双向序列测定,并与GenBank数据库已注册的核酸序列进行同源性比对 、确定基因种、分析亲缘进化关系。结果来自贵州省的3株动物宿主分离钩体菌株PFGE带型命名为LepNot I 002和LepNot I 003,经聚类分析,3株菌株与黄疸出血群黄疸出血型赖株的相似性大于95%。16S rRNA 基因测序和分析表明,3株贵州分离钩体菌株之间的同源性为100%,与致病性钩体问号钩端螺旋体种（L. interrogans）不同血清型参考菌株的同源性达100%。结论3株贵州动物分离钩体菌株经PFGE分型鉴定与黄 疸出血群赖型赖株的相似性大于95%,经16S rRNA基因测序分析鉴定为L. interrogans种,上述两种方法 对贵州省钩体分离菌株的鉴定结果一致,有助于贵州省钩端螺旋体病的主动监测、暴发调查和传染源追踪 。     

钩端螺旋体血小板激活因子乙酰水解酶基因特征分析

目的　由于钩端螺旋体病的主要特征之一是组织器官广泛性出血 ,出血部位发生在黏膜、脏器、浆膜和皮肤等处 ,严重者出现大面积肺弥散性出血、咳血 ,是危重钩端螺旋体病早期最常见的死因 ,其致病机理仍不清楚。本文使用生物信息学软件分析钩端螺旋体基因LA2 14 4 (血小板激活因子乙酰化酶 ,PafAH)所编码蛋白的结构和功能 ,并探讨其在致病过程中的作用。方法　使用NCBI ,Swissprot/TrEMBL ,ProDom ,Pfam ,Jpred2 ,SWISS -MODEL ,TMpred ,SignalP ,ClustW对问号钩端螺旋体黄疸出血型赖株全基因组ORF基因诠释 ,编码蛋白进行在线分析 ,并使用Bioedit软件进行氨基酸同源性比较分析。结果　确定了问号钩端螺旋体黄疸出血型赖株血小板激活因子乙酰化酶基因 ,该基因编码蛋白质与哺乳动物 pafAH在一级结构上相似性达 4 2 % ,以牛脑 pafAH(Ib)γ亚基 (1WAB/PDB)为模件模拟该蛋白三级结构 ,发现两者立体结构与非常相似 ,催化位点完全相同 ,均由Ser-His-Asp组成催化三合体。结论　该基因可能与钩体染色体所编码的胶原酶基因 ,溶菌酶基因 ,YopM基因 ,VwA基因协同在钩端螺旋体病出血过程中起作用 ,最终导致弥散性出血和咳血     

螺旋体传染病

梅毒螺旋体嵌合抗原的克隆表达及其临床应用；梅毒螺旋体Tp0453重组蛋白的表达纯化及免疫活性研究；钩端螺旋体疫苗鉴别试验及其国家参考品的建立；中国莱姆病螺旋体PD91重组外膜蛋白A的动物免疫效果分析；两种检测梅毒螺旋体抗体方法的比较；重庆市钩端螺旋体病流行因素监测分析。[编按]     

螺旋体传染病

问号钩体趋化相关基因特征分析——霍丽等（上海上海第二医科大学基础医学院病理学教研室200025）：《上海第二医科大学学报》，2005，25（1）：33．35[目的：预测问号钩体黄疸出血群赖型赖株的趋化信号传导途径。并深入分析趋化相关基因。方法：使用ProtParam tool,NCBI／Blastp进行蛋白参数分析和结构域分析，使用Clustalw软件进行多序列对比。与大肠埃希菌K-12趋化相关基因进行比较。