丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应（PCR）扩增丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS3基因，克隆至真核表达载体pcDNA3.1(－）中，构建HCV NS3基因真核表达载体pcDNA3.1(－）-NS3;以该质粒转染肝母细胞瘤细胞系epG2细胞，免疫印迹方法（Western blotting)检测转染细胞中HCV NS3蛋白的瞬时表达；与报告质粒pCAT3-promoter共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法（ELISA）检测细胞中氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性。结果显示，质粒pcDNA3.1(－）-NS3在HepG2细胞瞬时表达HCV NS3蛋白，共转染实验中pcDNA3.1(－）-NS3组的CAT表达活性是空质粒对照组的4．6倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白，并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS3蛋白反式激活的靶基因，为深入阐明HCV NS3蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究

应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5A（HCV NS5A）反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HCV NS5A蛋白反式激活相关基因。以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(－）-NS5A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(－）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaI酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到121个阳性克隆，经菌落PCR分析，得到115个200－1000bp的插入片段，对其中的90个片段测序，并进行同源性分析，显示31种在基因编码蛋白和15种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示，成功构建了HCV NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，该文库的建立为进一步阐明HCV NS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。     

乙型肝炎病毒X基因异质性及对其反式激活功能的影响

从慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染患者外周血中扩增X基因序列，克隆入pGEM-Teasy质粒，随机挑选克隆进行DNA测序以确定病毒的变异程度。结果提示，HBV长期带者体内有HBV准种共存，X区内存在热点缺失突变区。为了进一步探讨X区突变对X蛋白反式激活功能的影响，将野生株及不同缺失突变的X基因片段克隆入pcDNA3.1(-)载体的EcoRI位点，构建重组表达质粒，并分别与报告质粒pSV-lacZ共转染HepG2细胞，提取细胞裂解液，检测SV40启动子调控下的β－半乳糖苷酶表达活性。共转染结果显示：野生株X蛋白能够反式激活SV40病毒早期启动子。提示X区不同核苷酸缺失突变和点突变均在不同程度上降低了其反式激活作用。     

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应（PCR）扩增HBV X基因,克隆至真核表达载体pVR1012中,构建HBV X基因重组表达载体pVR102-X;以该质粒转染HepG2细胞,酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞X蛋白的瞬时表达,与报告质粒pSV-lacZ共转染H G2爱细胞,用试剂盒法检测β-半乳糖苷酶表达活性。结果质粒pVR102-X在HepG2细胞瞬时表达X蛋白,共转染实验中pVR102-X组β-半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的3．2倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表,并能够反式激活SV40病毒早期启动子。     

应用基因表达谱芯片筛选丙型肝炎病毒核心蛋白反式调节基因

应用基因表达谱芯片技术对HCV核心蛋白表达质粒pcDNA3.1(－）-core转染的HepG2细胞和空载体处理的相同细胞差异表达的mRNA进行检测。基因表达谱芯片所检测的1152条目的基因均与GenBank中登录的基因，HCV核心表达质粒转染的细胞有95条差异表达基因，其中45条基因表达增强，50条基因表达降低。这些核心蛋白反式调节基因与细胞增殖、分化、凋亡、信号转导及免疫调节密切相关。本实验结果为进一步阐明HCV核心蛋白致病（癌）的分子生物学机制提供了理论依据。     

乙型肝炎病毒X蛋白上调S100钙结合蛋白A11基因启动子表达活性研究

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBV-X蛋白)对S100钙结合蛋白A11(calgizzarin S100A11)启动子转录的激活作用。方法 以解放军第302医院基因治疗研究中心自行构建的HBV-X蛋白反式调节基因的cDNA文库抑制性消减杂交(SSH)技术的筛选结果及基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定S100A11的启动子区域(S100A11-p),聚合酶链反应(PCR)扩增S100A11-P,克隆至真核报告载体pCAT3中,构建pCAT3-S100-p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3．1(-)-X共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果 pCAT3-S100-p在HepG2细胞中能够指导CAT的表达;共转染实验中pCAT3-S100-p pcDNA3．1(-)-X组CAT的表达活性是pCAT3-S100-p的2．1倍。结论 所克隆的S100A11启动子有顺式激活下游基因的活性作用;HBV的X蛋白具有对S100A11的反式激活作用。本实验进一步验证了解放军第302医院基因治疗研究中心利用SSH技术及基因表达谱技术研究HBV-X蛋白反式激活作用的结果。     

乙型肝炎病毒前-S2蛋白对硫氧还蛋白还原酶1基因表达的上调作用研究

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)前-S2蛋白对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRDl)启动子转录的激活作用。方法 以302院传染病研究所基因治疗研究中心自行构建的乙型肝炎病毒前-S2蛋白反式调节的基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),PCR扩增TXNRD1p,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用ELISA法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3．1(-)-preS2共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果pCAT3-TXNRDlp和pcDNA3．1（-）-preS2瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的5．7倍、pCAT3-TXNRDlp的2．2倍。结论 该TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HBV的前-S2蛋白具有反式激活TXNRD1的作用。     

乙型肝炎病毒DNA多聚酶RNase H对细胞凋亡易感基因表达的上调作用

目的探讨乙型肝炎病毒DNA多聚酶(HBV DNA P)结构域蛋白RNase H对细胞凋亡易感基因(CAS)的转录激活作用。方法以HBV DNA P结构域蛋白RNase H的反式调节因子的基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定CAS的启动子区域(CASp),扩增CASp并克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-CASp报告载体。分别以该质粒单独或与pcDNA3.1(-)-RH共转染肝癌细胞系HepG2细胞,ELISA法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,并以pCAT3-Basic空载体、pCAT3-TXNRD1p分别转染HepG2细胞作为阴性和阳性对照。结果pCAT3-CASp和pcDNA3.1(-)-RH瞬时共转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-CASp的1.5倍,是pCAT3-Basic空载体的2.7倍。结论本实验进一步验证了我室利用基因表达谱技术研究RNase H蛋白反式激活作用的结果。我室克隆的CAS启动子具有顺式激活下游基因的活性;HBV的RNase H蛋白具有对CAS的反式激活作用。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP3的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因。方法 以HCV NSSA表达质粒pcDNA3．1(-)-NSSA转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现,其中有新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染了pcDNA3．1(-)-NS5A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为1572nt,编码产物由524aa组成,并测序证实,命名为NS5ATP3,在GentBank中注册,注册号为AF529364。结论 分子生物学技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了HCV NSSA反式激活作用的新型靶基因NS5ATP3,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因

应用抑制性消减杂技术构建丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCV核心蛋白反式激活相关基因。以HCV核心表达质粒pcDNA3.1(-)-core转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa I酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果显示,成功构建人HCV核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到233个白色克隆,进行菌落PCR分析,其中213个均得到100～1000bp插入片段。挑取63个插入片段测序分析,其中6个cDNA片段为未知序列,通过生物信息学分析获得其全长序列,已被GenBank收录。提示6个新的cDNA全长序列,可能是HCV核心蛋白反式激活靶基因。     

乙型肝炎病毒基因组中前-前-S-编码基因启动子序列的确定及转录活性的鉴定

为了解前-前-S编码区ORF上游是否具有启动子活性，选取其起始密码子ATG上游277bp的DNA序列，将其克隆至报告基因表达载体pCAT3中，构建pCAT3-前-前-S-promoter表达载体，以该质粒转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果发现，质粒pCAT3-前-前-S-pmrnoter能够激活CAT的表达，吸光度(A值)是pCAT3-basic的10倍，说明pCAT3-前-前-S-promoter具有启动子活性，为在HBV基因组DNA序列中界定、研究新的前-前-SORF提供了直接的实验依据。     

乙型肝炎病毒基因组中前-X-编码基因启动子序列的确定及转录活性的鉴定

利用长距离精确聚合酶链反应 (LA PCR)扩增慢性乙型肝炎患者血清来源的 5个全长的HBV基因组DNA ,在分析不同克隆之间的序列变异程度时 ,发现所获得的 5个克隆在X区之前可能还存在一个开放读码框架 (ORF) ,长度 16 8bp ,编码 5 6个氨基酸残基(aa) ,并将其暂时命名为前 X(pre X)。为了解前 X编码区上游DNA序列是否具有启动子活性 ,选取翻译起始密码子ATG上游 2 2 5bp的基因片段 ,将其克隆至报告基因表达载体pCAT3中 ,构建pCAT3 前 X promoter表达载体 ,以该质粒转染HepG2细胞 ,用ELISA法检测报告基因编码产物氯霉素乙酰转移酶 (CAT)的表达活性。结果发现 ,质粒 pCAT3 前 X promoter能够指导CAT的表达 ,吸光度 (A值 )是pCAT3的 3 5倍 ,提示pCAT3 前 X promoter中插入的DNA序列具有启动子活性 ,说明这一段基因序列中存在新的启动子区 ,为研究、界定前 X的ORF的存在提供了直接的依据。     

乙型肝炎病毒核心启动子区基因异质性及对其转录活性的影响

从慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染患者外周血中扩增核心启动子（CP) 基因序列，克隆入pGEM-Teasy质粒，随机挑选克隆进行DNA测序以确定病毒的变异程度。结果提示，HBV长期携带者体内有准种共存，CP区内存在热点缺失突变及散在点突变。为了进一步探讨CP区基因异质性对其转录活性的影响，将野生株及不同缺失突变的CP基因片段克隆入pcDNA3.1(-)载体的EcoRI位点，筛选反向克隆，经KpnI和XhoI双酶切后克隆入氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因表达载体pCAT3-basic上，构建重组报告质粒。以Lipo-fectamine PLUS转染试剂转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，用ELISA方法检测CAT表达量，反映了CAT基因上游启动子的转录活性。结果显示，成功构建了重组报告质粒，与野生株比较，HBV CP区准种群的存在不同程度地降低了CP基因的转录活性。     

不同基因型HBx对乙型肝炎病毒复制的影响

目的探讨A、B、C和D四个基因型乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis Bvirus Xprotein,HBx）对乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus,HBV）复制的影响。方法构建含A、B、C和D四种基因型HBx的真核表达载体和提前终止HBx表达的突变型单倍体HBV表达系统,共转染至人肝肿瘤细胞系HepG2细胞,利用荧光素酶报告系统检测不同基因型HBx对HBV核心启动子的激活作用,利用酶联免疫法（ELISA）检测培养上清中HBV表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）的表达情况,利用特异性引物PCR方法检测细胞中HBV前基因组RNA（pgRNA）和总RNA（pgRNA,2.2kb和0.8kbRNA）的转录情况。结果 A、B、C和D四种基因型HBx的表达均可显著激活HBV核心启动子活性,但不同基因型HBx的激活作用不同。除C基因型外,A、B和D三种基因型HBx均可显著增强HBsAg和HBeAg的胞外分泌水平。检测HBV复制中间产物发现,C基因型HBx对HBVpgRNA和总RNA转录水平的影响显著低于A、B和D基因型。结论不同基因型HBx对HBV复制的影响不同,为进一步研究HBV基因型与HBV复制能力以及临床病理表现的关系打下基础。