血管平滑肌细胞凋亡与尿毒症血管钙化

目的 探讨尿毒症患者血管平滑肌细胞（VSMC）凋亡与血管钙化之间的关系及其与临床指标的相关性。 方法 在43例尿毒症患者行动-静脉内瘘手术时留取桡动脉0.5~1 cm。用茜素红染色判断血管中膜钙化，并根据茜素红染色结果将患者分为钙化组和无钙化组。以肾功能正常、年龄相匹配的因外周血管疾病行血管手术的4例患者的动脉为对照组。采用DNA 片段原位缺口末端标记技术(TUNEL 法)检测上述3组血管平滑肌细胞凋亡情况，结果用凋亡指数表示。用免疫组化的方法检测凋亡相关基因p53、Bcl-2的表达情况。临床指标包括血钙、血磷、钙磷乘积、全段甲状旁腺素（iPTH）、血浆白蛋白（Alb）、血红蛋白（Hb）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、C反应蛋白（CRP）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）。用Pearson相关分析计算凋亡指数与上述临床指标的相关性。 结果 尿毒症患者的血管中膜均可见到明显的VSMC凋亡，钙化组VSMC凋亡指数显著高于无钙化组（48.13±17.81比15.90±8.25，P ＜ 0.01）。而在对照组血管中膜只有极少量凋亡的VSMC。钙化组p53表达比无钙化组和对照组明显升高（31.22±14.25比20.67±7.35、4.17±2.61，P ＜ 0.01），Bcl-2表达比对照组明显降低（4.29±2.16比14.87±5.62，P ＜ 0.01)。VSMC凋亡指数与临床指标中的钙磷乘积、血磷和LDL水平呈正相关（P ＜ 0.05）。 结论 尿毒症患者桡动脉中膜存在VSMC凋亡，且VSMC凋亡发生在血管钙化之前。VSMC凋亡可能参与了尿毒症患者血管钙化的发生和发展。     

尿毒症患者桡动脉钙化与骨密度及血清骨代谢指标的关系

目的 观察尿毒症患者桡动脉钙化情况并分析其与骨密度及血清骨代谢指标改变的关系.方法 以67例尿毒症患者为对象,取内瘘手术切除的桡动脉段,von Kossa染色及透射电镜检测血管钙化情况;检测Scr、血钙、磷、甲状旁腺素(iPTH);测定腰椎、股骨颈骨密度(BMD);放射免疫法测定血清25羟维生素D3 (25OHD)、1,25羟维生素D3[1,25(OH) 2D];ELISA法测定成纤维生长因子(FGF) 23、骨特异性碱性磷酸酶(BAP)、骨钙素(BGP)与Ⅰ型胶原吡啶交联物(ICTP).以23例健康体检者为对照,仅接受血清及骨密度检查.结果 von Kossa染色见24例(35.8％)尿毒症患者桡动脉中膜明显钙沉积;电镜发现中膜平滑肌细胞由 收缩型向分泌型转化,胞内有较多含钙囊泡,基质胶原明显增加伴钙磷结晶附着,程度与钙化评分一致.与对照组比较,尿毒症患者血磷、iPTH、FGF23、BGP、ICTP显著增加(均P＜0.05),血钙、25OHD、1,25(OH)2D显著降低(均P＜0.01),腰椎、股骨颈BMD也显著降低(均P＜0.01).相关分析显示,桡动脉钙化与糖尿病、股骨颈及腰椎骨密度Z值、ICTP、FGF23相关(r=0.62、-0.43、-0.25、0.34、0.86,P=0.000、0.012、0.001、0.018、0.000),与iPTH无相关(r=-0.08,P=0.306).按iPTH水平分层后,低iPTH(＜150 ng/L)组、高iPTH(＞300 ng/L)组患者iPTH与钙化相关(r=-0.41、0.31,P=0.044、0.023).多元回归分析显示,股骨颈骨密度Z值、ICTP、FGF23是桡动脉钙化的独立危险因素(β=-0.221、0.181、0.260,P=0.021、0.024、0.036).结论 尿毒症桡动脉钙化与平滑肌细胞合成和分泌较多的含钙基质有关,骨密度降低、骨转化率异常、骨吸收增加、血清FGF23水平增加是其危险因素.     

尿毒症患者血管钙化研究新进展

心血管疾病 (CVD)是终末期肾病 (ESRD)患者的主要并发症 ,心肌、瓣膜、血管壁的异位钙化是ESRD患者CVD的重要因素之一。近来临床和实验研究显示高磷、炎症、脂质代谢异常、氧化压力、E 选择素的多态性等多种因素与血管钙化有关。本文就尿毒症患者心血管钙化机制的最新认识作一综述。     

尿毒症早期心血管钙化的机制及防治

心血管钙化是慢性肾脏病(chronic kidney diseases,CKD)患者常见的并发症.它在尿毒症早期出现,随尿毒症的进展而逐渐加重.及时诊治尿毒症早期患者血管钙化,对于尿毒症患者心血管疾病的防预、降低死亡率,延长生存时间均具有深远意义.本文对尿毒症早期患者血管钙化发病特点、发病机制及其治疗研究进展作一综述.     

尿毒症中高磷和心血管钙化研究新进展

高磷在尿毒症心血管钙化中扮演着非常重要的作用。它与尿毒症患者的存活率有着一定的联系。本文就近期研究中与其相关的一系列机制展开讨论。     

维持性血液透析患者主动脉钙化相关影响因素分析

目的：探讨维持性血液透析（MHD）患者主动脉钙化的相关影响因素。方法：采用胸部正位X线成像技术检测183例MHD患者主动脉钙化情况,将入选患者分为主动脉钙化组（A组）和主动脉无钙化组（B组）,透析前抽血检测血钙、血磷、全段甲状旁腺激素（iPTH）、C反应蛋白（CRP）和血清白蛋白（Alb）等指标,并计算钙磷乘积,比较两组年龄、透析龄和血清学指标的差异,将上述指标与主动脉钙化进行相关性分析,并对筛选出来的危险因素进行非条件Logistic回归分析。结果：A组和B组在年龄、透析龄、血磷、钙磷乘积和CRP水平方面,差异均有统计学意义（P〈0.01或P〈0.05）;MHD患者主动脉钙化的相关影响因素包括：年龄、透析龄、血磷、钙磷乘积及CRP;Logistic回归分析表明,年龄、透析龄和血磷是主动脉钙化的独立危险因素（P〈0.01）。结论：MHD患者主动脉钙化相当常见,主动脉钙化与年龄、透析龄、钙磷代谢和炎症状态有关。     

尿毒症血清诱导人脐动脉平滑肌细胞成骨样转化和钙化的研究

目的 研究尿毒症血清对原代培养人脐动脉平滑肌细胞（HUASMC）成骨样转化和细胞外基质钙沉积的影响。 方法 收集40例健康人、40例非透析尿毒症患者和45例透析尿毒症患者血清，检测有关生化指标。组织植块法原代培养HUASMC，分别给予健康人血清（对照组）、透析（透析组）和非透析（非透析组）尿毒症血清孵育。茜素红S钙沉积染色及甲氧-酚酞络合酮法检测细胞层钙盐含量。实时定量PCR、荧光定量法及Western 印迹分别检测骨特异性碱性磷酸酶（BAP）、骨桥蛋白（OPN）和骨形成蛋白2（BMP２）基因以及蛋白表达。 结果 血清生化检测结果显示尿毒症血清较健康对照存在高磷、高脂、高全段甲状旁腺激素（iPTH）、高C反应蛋白（CRP）、白细胞介素6（IL-6）和低胎球蛋白A（P < 0.05），而透析组血清的三酰甘油、CRP、IL-6较非透析组血清高（P < 0.05）。与健康对照组相比，透析组和非透析组尿毒症血清均使HUASMC钙盐沉积更显著，BAP、OPN以及BMP2的表达上调（P < 0.05），且透析组血清作用更明显。 结论 尿毒症血清体外能够诱导HUASMC成骨样转化和钙化，提示可能和尿毒症相关的血管钙化有关。透析并发的微炎性反应状态可能加速了这一过程。     

帕米膦酸钠对高磷诱发大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响

目的 观察高磷对大鼠血管平滑肌细胞（RVSMC）钙化的影响,探讨帕米膦酸钠对RVSMC钙化的保护作用及相关机制。 方法 培养RVSMC细胞融合后,实验分为3组：正常磷对照组（Pi 1.4 mmol/L）、高磷组（Pi 4.5 mmol/L）、不同浓度帕米膦酸钠处理组（Pi 4.5 mmol/L+帕米膦酸钠10-5、10-6、10-7 mol/L）。甲O-酚酞络合酮吸光光度法测定细胞外基质钙含量。BCA法测定蛋白含量,用蛋白含量标化钙含量,同时以von Kossa染色半定量钙化情况。Western印迹检测不同组细胞的转录因子核心结合因子α1（cbfα-1）、骨钙素的表达量。 结果 培养3 d后,与高磷组相比,帕米膦酸钠干预组细胞外基质钙含量均显著减少（均P < 0.05）;von Kossa染色显示帕米膦酸钠干预组钙质沉积（黑色颗粒）亦显著减少。Western印迹显示,培养3 d后帕米膦酸钠处理组cbfα-1、骨钙素的表达量均较高磷组显著减少（均P < 0．05）。 结论 帕米膦酸钠对高磷诱导的RVSMC钙化有保护作用,此作用可能与其阻断RVSMC向成骨细胞转化有关。     

尿毒症患者高级蛋白氧化产物与血管钙化的关系及其机制探讨

目的 研究CKDⅤ期患者血中高级蛋白氧化产物(AOPP)水平及其与动脉钙化的关系，并探讨AOPP可否诱导动脉平滑肌细胞向成骨细胞分化。 方法 50例CKDⅤ期患者为尿毒症组，10例肾功能正常的胸腺瘤患者作为对照组。测定血AOPP、钙、磷、甲状旁腺激素(iPTH)水平，同时分别取桡动脉和同级别的胸廓内动脉做组织学检查。体外用次氯酸处理的人血清白蛋白(AOPP-HSA)作用于主动脉平滑肌细胞（HASMC），以单纯人血清白蛋白(HSA)培养基和常规培养基作为对照，RT-PCR法检测核结合因子α-1(CBFα-1)及骨桥蛋白(OPN)水平。 结果 CKDⅤ期患者血浆AOPP水平明显高于对照组[(90.22±55.88) μmol/L 比 (35.79±4.31) μmol/L, P < 0.01]。50例桡动脉标本中44例有OPN沉积于中膜（88％），其中24例有明显的钙化(48％)，对照组无一例有OPN沉积及钙化。Pearson相关分析显示血清AOPP水平与桡动脉内膜中层厚度（IMT）(r ＝ 0.691，P ＜ 0.01）及管壁/管腔比值（r ＝ 0.354，P ＜ 0.05）呈正相关。血管钙化程度与AOPP（r ＝ 0.791，P ＜ 0.01）、血清磷（r ＝ 0.602，P ＜ 0.01）、iPTH水平（r ＝ 0.549，P ＜ 0.05）呈正相关。体外试验显示AOPP-HSA可诱导HASMC表达CBFα-1和OPN，而单纯HSA无此效应。 结论 CKDⅤ期患者普遍存在高AOPP血症和血管钙化，血AOPP水平与血管钙化密切相关。这可能与AOPP直接诱导动脉平滑肌细胞向成骨细胞分化有关。     

尿毒症患者桡动脉盐皮质激素受体表达与血管钙化的关系

目的 探讨尿毒症患者动脉血管壁醛固酮-盐皮质激素受体（Ald-MR）表达情况与血管钙化的关系。 方法 以初次行动静脉内瘘术的60例尿毒症患者为对象。术中取桡动脉远心端0.5 cm,van Kossa染色检测血管钙化程度及评分后,将尿毒症患者分为无钙化、轻中度钙化、重度钙化3组（A、B、C组）。免疫组化法检测桡动脉壁MR、11β-羟基类固醇脱氢酶2（11β-HSD2）、核心结合因子α1（Cbfα1）、骨桥蛋白（OPN）、胶原Ⅰ（ColⅠ）表达,计算其吸光度（A）值。原位杂交法检测血管壁醛固酮合成酶2（CYP11B2）mRNA表达。对照组为同期行脾切除术的8例患者,取脾动脉,检测指标同尿毒症组。测定各组患者血清钙、磷、肌酐、甲状旁腺激素（PTH）等指标,对MR表达与钙化积分、骨相关蛋白表达进行Pearson相关分析。 结果 尿毒症患者动脉血管钙化发生率为31.67%（19/60）。A、B、C组分别为41例、11例、8例。对照组患者无血管钙化。免疫组化结果显示,MR、11β-HSD2在对照组均无明显表达;MR表达在A、B、C组中逐步增加,A值分别为728±84、806±133、1288±223,C组显著高于A组（P < 0.01）;11β-HSD2表达在A、B、C组分别为2098±215、3110±373、1607±300,B组最高,C组显著下降,与B组差异有统计学意义（P < 0.01）。骨相关蛋白OPN、Cbfα1、ColⅠ在对照组动脉壁无明显表达;在A、B、C组表达逐步增加,C组显著高于A组（9405±1701比4563±480,1125±592比553±102,754±1871比1821±241,均P < 0.01）,且3种骨相关蛋白分布位置均与van Kossa染色中钙化物质沉积部位一致。原位杂交结果显示各组患者和对照组动脉血管壁均无CYP11B2 mRNA表达。相关分析结果表明,桡动脉MR表达与血管钙化积分、OPN、Cbfα1、ColⅠ表达呈正相关,相关系数分别为0.469、0.312、0.413、0.379,P值分别< 0.01、<0.05、<0.01、<0.01。 结论 尿毒症患者动脉MR表达上调,并与钙化程度、骨相关蛋白表达上调呈正相关,提示尿毒症患者动脉Ald-MR系统活性增强可能是动脉钙化的重要机制。     

普伐他汀抑制肿瘤坏死因子α介导的人脐动脉血管平滑肌细胞成骨样钙化

目的 研究普伐他汀干预对肿瘤坏死因子α（TNF-α）介导的人脐动脉血管平滑肌细胞（hUASMC）成骨样分化标志蛋白骨特异性碱性磷酸酶（BAP）、骨桥蛋白（OPN）和骨形成蛋白2（BMP-2）表达以及细胞外钙盐沉积的影响，并探讨普伐他汀在血管钙化防治中的潜在作用。 方法 植块贴壁法原代培养人hUASMC。予以TNF-α刺激和普伐他汀干预，甲O-酚酞络合酮方法测定细胞外基质钙盐沉积；实时定量PCR法观察血管平滑肌细胞BAP和OPN mRNA表达水平；免疫印迹法观察血管平滑肌细胞BAP、OPN和BMP-2蛋白表达水平。 结果一定浓度范围的普伐他汀呈浓度依赖方式抑制TNF-α对hUASMC的促增殖作用（r = －0.946，P < 0.01）；一定浓度范围的普伐他汀呈浓度依赖方式下调TNF-α介导上调的BAP、OPN mRNA表达（r = －0.972，P < 0.01）与蛋白的表达水平（BAP蛋白，r = －0.820，P < 0.01；OPN蛋白，r = －0.972，P < 0.01；BMP-2蛋白，r = －0.928，P < 0.01），抑制血管平滑肌细胞成骨样分化，减少细胞外基质钙盐的沉积（r = －0.973，P < 0.01）。 结论 普伐他汀可抑制TNF-α对hUASMC的促增殖作用，抑制细胞成骨样分化，减少细胞外基质钙盐的沉积。     

高磷对血管平滑肌细胞钙化的影响及阿托伐他汀的干预效应

目的 观察高磷对大鼠血管平滑肌细胞（RVSMC）钙化的影响，及探讨阿托伐他汀在RVSMC钙化中的保护作用及相关机制。 方法 用不同的试剂培养RVSMC，分别为正常磷组（Pi 1.4 mmol/L）、高磷组（Pi 2.0 mmol/L、2.6 mmol/L）、凋亡抑制组（Pi 2.6 mmol/L+ZVAD-FMK 0.1 μmol/L、Pi 2.6 mmol/L+ZVAD-FMK 1.0 μmol/L、Pi 2.6 mmol/L+ZVAD-FMK 2.0 μmol/L）和阿托伐他汀组（Pi 2.6 mmol/L+Statin 1 nmol/L、Pi 2.6 mmol/L+Statin 10 nmol/L、Pi 2.6 mmol/L+Statin 100 nmol/L）。甲O-酚酞络合酮方法测定平滑肌细胞钙含量，BCA法测定蛋白含量，用蛋白含量标化钙含量，同时以von Kossa染色观察细胞钙化情况。ELISA方法测定不同时间各组细胞的相对凋亡量。 结果 ⑴培养第3、 6、9 天时，Pi 2.0 mmol/L、Pi 2.6 mmol/L组与Pi 1.4 mmo1/L组相比，RVSMC钙沉积较多（P ＜ 0.05）。⑵培养第6 天时，Pi 2.6 mmol/L+ZVAD-FMK 1.0 μmol/L、Pi 2.6 mmol/L+ZVAD-FMK 2.0 μmol/L组与Pi 2.6 mmol/L组相比，RVSMC钙沉积较少（P ＜ 0.05）；Pi 2.6 mmol/L+Statin 10 nmol/L、Pi 2.6 mmol/L+Statin 100 nmol/L组与Pi 2.6 mmol/L组相比，细胞钙沉积较少（P ＜ 0.05）。von Kossa染色显示Pi 2.6 mmol/L组细胞有大量黑色颗粒沉积，而Pi 2.6 mmol/L+Statin 100 nmol/L组较少。⑶培养第3、6、9天时，Pi 2.6 mmol/L与Pi 1.4 mmol/L相比，细胞相对凋亡量较多（P ＜ 0.05）；培养第12、24小时，Pi 2.0 mmol/L、Pi 2.6 mmol/L组与Pi 1.4 mmol/L组相比，细胞相对凋亡量较多（P ＜ 0.05）；培养第6 天、第24小时时，Pi 2.6 mmol/L+Statin 10 nmol/L、Pi 2.6 mmol/L+Statin 100 nmol/L与Pi 2.6 mmol/L组相比，细胞相对凋亡量较少（P ＜ 0.05 )。 结论 高磷培养可诱导RVSMC体外钙化。阿托伐他汀对高磷诱导的RVSMC钙化有保护作用，此作用可能与其降低RVSMC凋亡有关。     

血管平滑肌细胞凋亡在腹主动脉瘤发病中的作用

目的：探讨腹主动脉瘤（AAA）中膜血管平滑肌细胞（VSMC）密度降低的机制。方法：选取人体肾下AAA及正常腹主动脉组织（NA）标本,采用免疫组化及原位末端DNA标记技术,测定中膜VSMC,凋亡细胞及其相关蛋白,计算机图像分析并计算VSMC密度及凋亡指数。结果：与NA相比,AAA中膜VSMC密度降低,VSMC凋亡指数及其相关蛋白P53,P21明显增加,而bcl-2无显变化。结论：VSMC凋亡在细胞水平参与腹主动脉结构损伤与重构,促进AAA形成。     

肿瘤坏死因子α介导人脐动脉血管平滑肌细胞成骨样钙化

目的 观察肿瘤坏死因子α（TNF-α）对体外培养人脐动脉血管平滑肌细胞（hUASMC）骨特异性碱性磷酸酶（BAP）、骨桥蛋白（OPN）和骨形成蛋白2（BMP-2）等成骨样分化标志蛋白表达以及细胞外钙盐沉积的影响。 方法 植块贴壁法原代培养人hUASMC。予以TNF-α刺激，甲O-酚酞络合酮方法测定细胞外基质钙盐沉积；Von Kossa法观察钙化染色；实时定量PCR法测定血管平滑肌细胞BAP和OPN mRNA表达水平；免疫印迹法观察血管平滑肌细胞BAP、OPN和BMP-2蛋白表达水平。 结果 一定浓度范围内的TNF-α可促进hUASMC增殖；增加细胞外基质钙盐沉积。TNF-α 50 μg/L刺激可在第3天上调血管平滑肌细胞BAP和OPN mRNA表达水平（BAP mRNA：1.908±0.034比1.000±0.033，OPN mRNA： 3.600±0.073比1.000±0.079，均P < 0.05）。TNF-α 50 μg/L刺激可在第5天上调血管平滑肌细胞BAP、OPN和BMP-2蛋白表达水平（BAP蛋白：3.394±0.083比1.000±0.030，OPN蛋白： 1.967±0.134比1.000±0.070，BMP-2蛋白：2.745±0.289比1.000±0.208， 均P < 0.05）。 结论 一定浓度范围的TNF-α可刺激hUASMC增殖；介导细胞成骨样分化；增加细胞外基质钙盐沉积，从而参与血管钙化的发生发展。     

体外高磷环境下血管平滑肌细胞转分化过程的研究

目的 观察体外高磷培养条件下,血管平滑肌细胞（VSMC）向类似成骨样细胞转分化的动态变化特点。 方法 Western印迹和免疫荧光法观察不同磷浓度（1.0、2.5、3.5 mmol/L）培养条件下,人VSMC的标志蛋白α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）以及成骨细胞特异性的核转录因子Cbfα1、相关骨基质蛋白（骨桥蛋白、I型胶原和骨钙素）的动态变化过程。实时荧光定量PCR法分析上述指标的基因表达水平。在此基础上,以硝酸银染色和茜素红染色了解细胞的钙盐沉积状况,最后通过电镜观察不同培养条件下细胞超微结构的改变。 结果 在无血清的培养条件下,高磷（2.5、3.5 mmol/L）刺激细胞12 h时,胞内 Cbfα1的表达就明显增加（P ＜ 0.05）;3 d后高磷组（2.5、3.5 mmol/L）细胞中I型胶原和骨桥蛋白的含量显著上调（均P ＜ 0.05）;第6天骨钙素的产生开始增加;15 d时高磷组（2.5、3.5 mmol/L）α-SMA的含量才显著下降（P ＜ 0.05）。实时荧光定量PCR结果显示,高磷环境培养1 d时,细胞中骨桥蛋白、I型胶原的mRNA水平显著升高（均P ＜ 0.05）;5 d时骨钙素的mRNA表达显著增加（P ＜ 0.05）;10 d时α-SMA的mRNA含量显著减少（P ＜ 0.05）。在高磷营养液中培养15 d时,细胞出现多处斑片状的钙盐沉积。电镜可见胞质内产生大量胶原纤维和钙化的基质囊泡。 结论 高磷可诱导VSMC向类似成骨样细胞转分化,这是一个复杂的、有多个环节、有序的动态变化过程。