从脐血和骨髓中诱导成骨样细胞的体外研究

目的：探讨脐血和骨髓单个核细胞(monocytes，MNC)体外培养过程中的生长特性及诱导贴壁细胞向成骨细胞分化。方法：分离脐血和骨髓MNC，按培养基不同分成3组：分别为Mesencult^TM无血清培养基。CellGRO培养基 100mL／L胎牛血清。DMEM／F12培养基 100mL／L FBS。体外培养以获得贴壁细胞。观察不同培养条件下细胞扩增的效果。获得的贴壁细胞培养基中加入地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸，诱导细胞向成骨细胞分化。检测诱导后细胞成骨细胞标志物碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨钙素的表达。结果：脐血和骨髓MNC在含有血清的培养基中可以获得更多的贴壁细胞。骨髓MNC贴壁细胞形态均一，呈典型的成纤维细胞样，而脐血贴壁细胞未获得典型的成纤维细胞样细胞，混有大量的圆形细胞。骨髓中获得的细胞可以持续传代10代以上仍保持良好的增殖状态；脐血贴壁细胞最多可以传代2次，细胞总数和纤维样细胞均逐代减少。诱导后的脐血和骨髓细胞均呈碱性磷酸酶阳性，免疫组化染色显示Ⅰ型胶原和骨钙素表达阳性。结论：骨髓MNC体外培养可以获得典型的间充质干细胞且可以持续多代扩增，向成骨细胞诱导后，形态和标志物检测都呈典型的成骨细胞样。脐血MNC体外培养可获得贴壁细胞，但不呈间充质干细胞样，向成骨细胞诱导后，虽形态与成骨细胞不相似，但成骨细胞的标志物表达均呈阳性。     

两种来源的单个核细胞的培养比较

[目的] 观察体外分离培养的两种来源（脐血与骨髓）的单个核细胞，探讨其培养特点和差异。[方法] 体外分离、纯化和培养脐血与骨髓中单个核细胞（MNC），观察其形态和生长特性。[结果] 分离18份脐血，脐血标本的个体差异非常大，只有12份获得了贴壁细胞，MNC体外培养可以获得贴壁细胞，但形态不均一，主要为破骨样细胞和纤维样细胞，传代不超过二次。分离12份骨髓，均获得了贴壁细胞，MNC体外培养可以获得形态均一的纤维样间充质干细胞（MSC），可多次传代。[结论] 脐血不能获得典型的间充质样干细胞，骨髓中存在典型的间充质干细胞。     

骨髓间充质干细胞成骨方向诱导过程中的基因表达

背景:目前骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化演变中的基因表达模式尚不明确.目的:观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,验证骨髓间充质干细胞是否向成骨细胞成熟分化.方法:抽取2月龄新西兰大白兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法培养获得骨髓间充质干细胞,用矿化诱导培养基(DMEM/F12、地塞米松1×10<'-8> mmol/L、β-磷酸甘油钠0.01 mol/L、维生素C 0.05 g/L)进行成骨诱导培养,用反转录一聚合酶链反应方法检测诱导培养后第一二代骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,并对该骨髓间充质干细胞表面抗原CD44进行鉴定.结果与结论:经矿化诱导培养基诱导培养后,第一二代骨髓间充质干细胞阶段性表达碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因;第1代骨髓间充质干细胞抗原CD44阳性率达44.4%.提示兔骨髓间充质干细胞在体外矿化诱导培养中逐渐向成骨细胞分化,分别于诱导后第一二代细胞中阶段性顺序表达成骨细胞特异性基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素,该细胞己具备成骨细胞特征,为揭示骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中基因表达机制提供了实验依据.     

体外诱导脐血间充质干细胞分化为成骨细胞

背景:脐血间充质干细胞在特定的诱导条件下可以分化成为多种类型的细胞,易于体外培养扩增,但脐血中间充质干细胞的建立时间长、频率低是其主要缺点.目的:体外分离培养脐血间充质干细胞,并诱导其向成骨细胞方向分化.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008 06/2009 01在青岛大学医学院试验室完成.材料:脐血取自足月正常分娩的产妇,由青岛市立医院妇产科提供.方法:采用percoll密度梯度法体外分离培养人脐血间充质干细胞,当细胞汇合90%单层细胞后胰蛋白酶消化传代.取第3代脐血间充质干细胞,以1×106密度接种,当细胞达50%～60%融合时,加入含0.1 μmol/L地塞米松、10mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C的DMEM成骨细胞诱导液;对照组加入普通低糖DMEM培养液培养.主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞生长及增殖情况,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,细胞生长曲线分析,透射电镜观察细胞超微结构,von Kossa染色和碱性磷酸酶染色检测向成骨细胞诱导分化情况.结果;原代培养的脐血间充质干细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,传代后细胞形态均一,呈梭形旋涡状排列.第3代脐血间充质干细胞高表达CD29,CD44,CD13,不表达CD34.生长潜伏期为两三天,第三四天进入对数增殖期,1个月后进入平台期.胞核呈类圆形或不规则形,核膜清晰,有一两个核仁,染色质较粗,胞质中细胞器丰富,细胞表面有微绒毛.第3代脐血间充质干细胞成骨诱导7 d后逐渐汇合呈铺路石状,14 d后von Kossa染色出现钙化结节,碱性磷酸酶染色呈阳性;对照组未见钙化结节,碱性磷酸酶染色呈阴性.结论:采用percoll密度梯度法可成功从人脐血中分离出间充质干细胞,并在体外诱导分化为成骨细胞.     

脐血间充质干细胞的分离培养及生物学特性

背景：脐血富含干细胞,刺激后进入细胞周期的速度以及自泌生长因子的能力均强于骨髓及外周血干细胞。目的：建立一种分离纯化、培养扩增脐血间充质干细胞的方法,并观察体外培养脐血间充质干细胞的生物学特性。方法：密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,分离纯化脐血间充质干细胞。观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,应用流式细胞仪测定细胞周期,以免疫组织化学法（SP 法）测定 CD29,CD44,CD34。采用体积分数 20%马血清诱导脐血间充质干细胞分化为脂肪细胞,以油红 O 染色鉴定;0.1 μmol/L 地塞米松,10 mmol/L β-甘油磷酸钠和 50 μmol/L 抗坏血酸诱导脐血间充质干细胞分化为成骨细胞,以碱性磷酸酶染色鉴定。结果与结论：分离获得了高纯度贴壁生长的间充质干细胞,间充质干细胞呈梭形,细胞传代稳定,在体外连续传代培养 9 代,未发生形态学改变,无衰老征象。第 3 代间充质干细胞体外可以分化为脂肪细胞和成骨细胞。提示采用淋巴细胞分离液密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,可以获得纯度较高的脐血间充质干细胞,脐血间充质干细胞体外增殖和传代能力强。     

脐血间充质干细胞的分离培养及生物学特性

背景:脐血富含干细胞,刺激后进入细胞周期的速度以及自泌生长因子的能力均强于骨髓及外周血干细胞。目的:建立一种分离纯化、培养扩增脐血间充质干细胞的方法,并观察体外培养脐血间充质干细胞的生物学特性。方法:密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,分离纯化脐血间充质干细胞。观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,应用流式细胞仪测定细胞周期,以免疫组织化学法(SP 法)测定 CD29,CD44,CD34。采用体积分数 20%马血清诱导脐血间充质干细胞分化为脂肪细胞,以油红 O 染色鉴定;0.1 μmol/L 地塞米松,10 mmol/L β-甘油磷酸钠和 50 μmol/L 抗坏血酸诱导脐血间充质干细胞分化为成骨细胞,以碱性磷酸酶染色鉴定。结果与结论:分离获得了高纯度贴壁生长的间充质干细胞,间充质干细胞呈梭形,细胞传代稳定,在体外连续传代培养 9 代,未发生形态学改变,无衰老征象。第 3 代间充质干细胞体外可以分化为脂肪细胞和成骨细胞。提示采用淋巴细胞分离液密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,可以获得纯度较高的脐血间充质干细胞,脐血间充质干细胞体外增殖和传代能力强。     

不同传代倍数胎儿间充质干细胞的成骨分化能力观察

目的:观察不同传代倍数胎儿骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞的能力,为骨髓间充质干细胞在骨组织工程中的应用提供部分实验参数。方法:实验于2004-03/10在安阳市人民医院检验科和安阳肿瘤医院临床实验室完成。采用全髓直接接种法分离培养13～18周胎龄水囊引产新鲜胎儿股骨骨髓(获提供者知情同意标本用于此实验)。贴壁细胞达90%以上融合时消化传代。传代细胞部分以1×109L-1的细胞密度接种于含体积分数为0.1的胎牛血清的L-DMEM的培养基中继续培养,传代;部分在培养基中添加成骨诱导剂地塞米松,β-甘油磷酸钠及抗坏血酸向成骨细胞诱导分化。如此连续传10代。倒置显微镜下观察细胞形态、细胞化学染色检测成熟成骨细胞的标志酶碱性磷酸酶的表达、全自动生化分析仪测定碱性磷酸酶活性,鉴定不同代次培养细胞成骨分化能力。结果:①碱性磷酸酶染色阳性百分率:传代7代以内胎儿骨髓间充质干细胞成骨分化能力无显著差异,均在87.5%以上(P>0.05);以第3代最强达93.4%。第8代后逐渐减弱,为72.7%～51.3%。②碱性磷酸酶活性:传代7代以内无差异(P>0.05),以第3代最高,为(2307.1±15.0)nkat/L,第8代后逐渐降低,至第10代仅为(905.2±10.0)nkat/L。结论:不同代次的骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞的能力不同,8代以后明显减弱。提示脱离了体内环境后,骨髓间充质干细胞逐渐老化。做为组织工程的种子细胞,骨髓间充质干细胞体外培养不宜超过7代。     

人脐血间充质干细胞分离、培养及向成骨细胞分化的实验研究

目的探讨脐血间充质干细胞(MSCs)的分离培养及向成骨细胞的分化潜能。方法从足月儿脐血中获得间充质干细胞,体外培养传代,流式细胞检测细胞表面及抗原细胞周期;1.0×10-8mol/L地塞米松,2.0×10-4mol/L抗坏血酸,7.0×10-3mol/Lβ-磷酸甘油的IMDM培养基对MSCs进行诱导向脂肪细胞分化,von-Kossa染色鉴定。结果成功建立了脐血间充质干细胞分离及培养扩增的方法;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD105、CD29和CD44,不表达造血细胞表型CD34、CD45和内皮细胞表型CD31;经脂肪培养液诱导后细胞间可见黑色矿化物沉积阳性。结论脐血间充质干细胞能进行体外分离培养,并能诱导分化为成骨细胞。     

α- 玉米赤霉醇影响小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化简

背景：骨髓间充质干细胞具有向成骨细胞分化的能力,植物雌激素α-玉米赤霉醇对小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化可能有促进作用。 目的：探讨α-玉米赤霉醇对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响。 方法：采用全骨髓培养差速贴壁法体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分为6组：非诱导组加含体积分数为10%胎牛血清、1%双抗的 IMDM 普通培养基;空白诱导组仅加入等量成骨条件培养基（含0.1μmol/L 地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50μmol/L 维生素C）;阳性对照诱导组加入等量成骨条件培养基及10-8 mol/L雌二醇;高、中、低α-玉米赤霉醇组分别加入成骨条件培养基及10-5,10-6,10-7 mol/L梯度浓度的α-玉米赤霉醇。倒置显微镜下观察细胞形态变化,MTT 实验测定细胞增殖状态绘制细胞生长曲线,酶联免疫吸附法测定碱性磷酸酶、骨钙素的表达。 结果与结论：非诱导组细胞呈长梭形,生长密集时有接触抑制,各诱导组的细胞增殖受促进,诱导后细胞呈三角形、多角形、不规则形状,细胞可重叠生长;非诱导组低表达碱性磷酸酶、骨钙素,低浓度（10-7 mol/L）α-玉米赤霉醇组和阳性对照诱导组高表达碱性磷酸酶、骨钙素,与空白诱导组相比,差异有非常显著性意义（P＜0.01）。结果说明α-玉米赤霉醇可以促进骨髓间充质干细胞的增殖,低浓度α-玉米赤霉醇可显著促进体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化。而上调碱性磷酸酶、骨钙素的表达量可能是α-玉米赤霉醇诱导促进骨髓间充质干细胞骨向分化的作用机制之一。     

骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究

目的:采用地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C3种物质作为诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化的基本辅剂,定向诱导犬第2代BMSCs,探讨BMSCs向成骨细胞分化的潜能和成骨细胞的特征性鉴定方法.方法:无菌条件下行犬髂骨穿刺,采集骨髓15～ 20 mL,全骨髓10％ FBS DMEM培养液进行原代培养.将第2代纯化的BMSCs细胞悬液(调整细胞密度为1×105/mL)接种于含地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C的DMEM/FI2培养液的培养瓶(皿)中,体外扩增培养、传代.对细胞形态特征进行观察;行碱性磷酸酶(ALP)染色,骨桥素以及Ⅰ型胶原相关蛋白免疫荧光化学检测鉴定细胞性质.结果:原代培养的BMSCs形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长.诱导分化后的细胞形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长,传代后细胞体积略变大;BMSCs成骨诱导增殖后电镜下细胞呈多边形,可见ALP染色阳性;经成骨细胞诱导培养14 d后,细胞骨桥素以及Ⅰ型胶原相关蛋白表达阳性.结论:BMSCs易于体外分离培养及扩增,地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C体外定向诱导能够在短时间内获得大量成骨细胞,且所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态和功能.