锌指蛋白185(ZNF185)在小鼠睾丸精子细胞、间质细胞和支持细胞中的表达和定位北大核心CSCD

目的研究锌指蛋白185(ZNF185)在小鼠睾丸精子、间质和支持细胞中的表达变化。方法应用免疫荧光组织化学染色法检测ZNF185在精子、间质、支持细胞和睾丸组织中的定位;实时定量PCR和Western blot法分别检测三种细胞中ZNF185 mRNA和蛋白表达水平的差异。结果免疫荧光细胞分析显示ZNF185在小鼠睾丸精子、间质和支持细胞中均表达,主要分布于间质和支持细胞胞质、精子细胞头部和尾部;实时定量PCR和Western blot结果显示,支持细胞ZNF185 mRNA和蛋白表达水平显著低于间质和精子细胞。结论 ZNF185分布于小鼠睾丸不同细胞,表达量存在差异。     

ZNF185基因的克隆及在小鼠睾丸中的定位

目的:克隆ZNF185基因并检测ZNF185在小鼠睾丸中的定位。方法:从小鼠睾丸中提取RNA,经RT-PCR,再对目的片段进行克隆和鉴定;提取小鼠肝、睾丸与卵巢组织的蛋白质,进行Western blot分析;制备小鼠睾丸冰冻切片,应用免疫荧光技术分析。结果:(1)ZNF185基因克隆完全正确。(2)Western blot显示,睾丸中的ZNF185含量最多。(3)免疫荧光显示,ZNF185定位于睾丸间质细胞和精子,在睾丸间质细胞表达较弱,而在圆形精子和成熟精子高表达。结论:成功克隆了ZNF185基因,并初步探明了ZNF185在小鼠睾丸中的定位。     

锌指蛋白ZNF580定位在MGC803细胞核

新基因(AF184939)ZNF580是由本组克隆并于Genbank注册的C2H2型锌指蛋白转录因子基因,其cDNA 748~1266 bp之间的碱基构成一个完整的开放阅读框,编码172个氨基酸。蛋白功能基序分析表明:其羧基端序列中含有3个重复串联的C2H2型锌指蛋白主构域:CX2CX3FX5LX2HX3H(X代表保守性差的氨基酸),富含脯氨酸残基的氨基端序列为转录激活结构域[1]。利用绿色荧光(green fluorescence pro-tein,GFP)在活细胞内的示踪作用[2],我们将GFP与ZNF580cDNA开读框融合,导入胃癌MGC803细胞株中,直观地观察到ZNF580基因在细胞内的表达及亚细胞定位,…     

锌指蛋白265在大鼠睾丸Sertoli细胞中的特异性表达

目的:研究锌指蛋白265(ZNF265)在大鼠睾丸Sertoli细胞中的特异性表达.方法:分离培养SD大鼠睾丸Sertoli细胞, 以免疫荧光染色、流式细胞术(FCM)检测ZNF265在Sertoli细胞的表达, 且抽提Sertoli细胞总RNA, 用PT-PCR法检测ZNF265的表达.结果:经免疫荧光染色, 实验组Sertoli细胞核核周呈现明亮特异荧光, 对照组未见特异性荧光;FCM检测结果显示实验组Sertoli细胞ZNF265的表达较对照组明显增高;RT-PCR扩增出目的条带ZNF265.结论:大鼠睾丸Sertoli细胞特异性表达ZNF265, 且多表达于Sertoli细胞核核周胞质.     

褪黑激素对小鼠睾丸生精细胞凋亡和睾丸间质细胞nNOS表达的影响

目的：观察外源性褪黑激素(MT)对睾丸生精细胞凋亡和nNOS表达的影响,探讨MT诱导生精细胞凋亡的可能机制。方法：20d和30d小鼠,应用化学发光法检测血清睾酮浓度,TUNEL测定生精细胞凋亡,免疫组化,SABC法观察nNOS在睾丸中的表达。结果：20d和30d实验组血清中睾酮水平明显下降,TUNEL阳性生精细胞数显著增多,TUNEL阳性生精细胞数与睾酮浓度呈负相关;20d实验小鼠中睾丸间质nNOS阳性细胞数与对照组相比明显减少,且与睾酮浓度呈正相关,而与TUNEL阳性生精细胞数呈负相关。结论：MT具有促进生精细胞凋亡的作用,与睾酮分泌受抑制有关;青春期前MT引起生精细胞凋亡可能还与nNOS表达有关。     

微管相关蛋白1B在FMR1基因敲除小鼠睾丸间质细胞中的表达

目的对不同周龄的Fmr1基因敲除和野生型雄性小鼠睾丸组织微管相关蛋白1B的表达进行分析比较,探讨Fmr1基因敲除小鼠的睾丸间质细胞微管相关蛋白1B表达的差异。方法采用不同周龄(4、6、8、10周)的FMR1基因敲除型(KO)和野生型(WT)各6只,先采用聚合酶链式反应(PCR)技术对KO小鼠和WT小鼠进行基因型鉴定,之后所有小鼠麻醉取睾丸组织、石蜡包埋切片进行HE染色对比观察Fmr1小鼠睾丸组织的形态,最后用免疫组织化学染色技术对KO小鼠和WT小鼠睾丸微管相关蛋白1B的表达进行检测并作对比分析。结果微管相关蛋白1B在4～10周小鼠睾丸间质细胞阳性表达,8、10周为强阳性表达,且KO小鼠在睾丸的阳性表达均高于WT小鼠。结论微管相关蛋白1B在同周龄FMR1基因敲除小鼠睾丸间质细胞的表达均显著高于WT小鼠,提示微管相关蛋白1B可能参与脆性X综合征巨睾症的发病过程。     

Bmil基因在小鼠睾丸组织中的表达定位

精原干细胞能通过自增殖不断地自我更新,形成不同发育阶段的生精细胞并维持其正常数目。Broil基因属于Polycomb家族,最近发现它对造血干细胞、白血病干细胞,神经干细胞等自增殖有调控作用。我们用自制的BM11多克隆抗体,通过免疫荧光技术定位该基因在小鼠睾丸组织中的表达,并用FISH做进一步验证,为进一步揭示精原干细胞自增殖的分子机制奠定基础。首先,利用RT-PCR技术克隆了成年小鼠睾丸组织中Bmil基因,     

支持细胞波形蛋白及紧密连接结构蛋白在染锰大鼠睾丸中的表达

目的研究染锰诱导的大鼠睾丸超微结构改变及支持细胞vimentin(VM)和紧密连接Occludins mRNA和Claudin-11 mRNA表达,探讨锰对支持细胞骨架蛋白和紧密连接蛋白的破坏机制。方法雄性SD大鼠随机分为空白对照组,低剂量(15 mg/kg MnCl_2)和高剂量(30 mg/kg MnCl_2)组,8只/组。实验组分别染锰4周和6周,空白对照组给予等容生理盐水,给药途径均为腹腔注射,电镜观察睾丸支持细胞及血睾屏障超微结构,免疫组织化学(SABC)法检测支持细胞VM表达,实时定量PCR反应检测血睾屏障紧密连接Occludins,Claudin-11 mRNA表达。结果随着染锰时间延长和剂量增加,各组支持细胞数量及VM阳性细胞率、Occludins mRNA和Claudin-11 mRNA表达水平均显著降低。各组大鼠睾丸支持细胞数量与VM阳性细胞率及Occludins mRNA和Claudin-11 mRNA表达水平均成正相关。结论锰可抑制大鼠睾丸支持细胞骨架蛋白及紧密连接相关蛋白表达,产生生殖毒性效应。     

小鼠睾丸支持细胞的体外分离和纯化

目的寻求简便经济的方法分离纯化小鼠睾丸支持细胞,提高其获取量。方法用0.1%的胶原酶和0.25%的胰蛋白酶次第消化准备7-8天小鼠生殖细胞悬液,置于37℃,5%CO2孵箱内培养,4小时后换液,24小时后向培养板内加入20 mmol Tris-HCl低渗处理3分钟,去除精原细胞,即得到高纯度的支持细胞。结果在小鼠睾丸支持细胞的分离培养中,支持细胞占培养细胞90%以上。结论应用本实验方法分离小鼠睾丸支持细胞获得成功并简化了国内现行的分离方法。     

敲低热休克转录因子5(Hsf5)对小鼠睾丸间质细胞和支持细胞中热休克家族的影响

目的 探讨敲低热休克转录因子5(Hsf5)对小鼠睾丸间质细胞(TM3)和支持细胞(TM4)中热休克家族表达的影响。方法 培养小鼠TM3和TM4细胞,随机分为对照组(control group)和Hsf5敲低组(Hsf5 knockdown group)。用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测两种细胞中热休克转录因子(HSFs)和热休克蛋白(HSPs)mRNA的表达。根据RT-qPCR结果分别选取两种细胞中变化具有显著差异的HSPs(P<0.01),应用Western blot检测TM3细胞中HSPA2、HSPA5、HSP90ab1和TM4细胞中HSPA2、HSP90aa1蛋白表达。结果 用siRNA干扰技术成功构建Hsf5敲低模型。敲低Hsf5后,TM3细胞中Hspa2、Hspa5、Hsp90ab1和TM4细胞中Hsf2、Hspa2、Hsp90aa1、Hsp90ab1、Hspd1的mRNA表达明显下调(P<0.05)。与对照组相比,在Hsf5敲低组中,TM3细胞中HSPA2、HSPA5和TM4细胞中HSPA2蛋白表达明显下调(P<0.05)。结论 HSF5可能通过...     

Tpap基因在小鼠睾丸中的表达

背景:精子发生过程受许多特异分子及细胞间作用的严格调节,包括染色体结构变化及一系列特定基因程序性表达调控。长期以来由于缺乏合适的体内和体外研究模型,精子发生分子机制的研究进展较慢,尤其缺乏对关键调节基因的认识。目的:筛选与精子发生相关的基因,并分析其表达特点。方法:将4,9,18,35,54d和6月龄小鼠睾丸组织cDNA探针与Affymetrix全基因组芯片进行杂交,筛选出差异表达的基因。然后通过反转录-聚合酶链反应分析差异表达基因在小鼠睾丸不同发育阶段中的表达。结果与结论:对Affymetrix全基因组芯片杂交结果分析后,筛选得到1个差异表达杂交点,通过在NCBI与小鼠全基因组序列Blast分析可知该差异表达基因是Tpap基因。该基因在4,9,18,35,54d和6月龄小鼠睾丸中杂交信号校正值分别是4.4(A)、12.9(A),262.4(P)、1136.7(P)、1617.5(P)和1128(P),表明4,9d小鼠睾丸中该基因无表达,18d小鼠开始表达,RT-PCR结果表明小鼠Tpap基因在小鼠9d及之前的睾丸中没有表达,在18d睾丸后开始表达,与基因芯片分析相一致。结果表明,Tpap基因为小鼠年龄依赖性表达基因,小鼠Tpap的表达与小鼠精子发生的过程有很强的一致性,推测该基因在哺乳动物精子发生中起重要作用。     

MSH27抗原在小鼠睾丸中的定位

目的　ＭＳＨ２７是与精、卵质膜融合相关的针对精子抗原的单克隆抗体,本研究检测了此抗体所识别的睾丸抗原分子及其分布。　方法　用免疫亲和层析和聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化、分析了ＭＳＨ２７ 识别的小鼠睾丸抗原,并用免疫组织化学和免疫电镜进行了定位。　结果　单抗ＭＳＨ２７ 可识别睾丸提取蛋白中分子量为１２６ｋＤ和１１６ｋＤ的抗原分子,此抗原在睾丸的精原细胞至球形精子细胞的胞质内部均有表达,分布于内质网囊泡内或囊泡膜上。在精子形成过程中,此抗原由胞质内均匀分布变为聚集于顶体帽旁侧的区域,这一区域将形成顶体后区。　结论　１２６ｋＤ和１１６ｋＤ蛋白是单抗ＭＳＨ２７ 在睾丸中识别的抗原分子,它们可能是单抗ＭＳＨ２７在成熟精子中识别的３９ｋＤ抗原的前体分子。     

新生昆明小鼠睾丸支持细胞和精原细胞的共培养及支持细胞的作用

目的 分离、纯化、培养小鼠睾丸支持细胞,通过与精原细胞共培养,研究体外培养的支持细胞对精原细胞的影响.方法 用复合酶消化、密度梯度离心和差异贴壁法分离、纯化、培养新生小鼠睾丸支持细胞,以苏丹Ⅳ染色鉴定支持细胞;用丝裂霉素-C处理支持细胞后作为饲养层,与精原细胞共培养;以直接分离培养的精原细胞作对照.倒置相差显微镜观察,细胞培养第3天,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定精原细胞的增殖率;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/磷脂酰肌醇(ANNEXIN-V-FITC/PI)染色;激光扫描共焦显微镜观察记录精原细胞的凋亡率,比较精原细胞克隆大小、存活时间、增殖率和凋亡率的不同. 结果 分离、纯化后经苏丹Ⅳ染色鉴定的小鼠支持细胞纯度可达95%以上,与支持细胞共培养的精原细胞的克隆大小、存活时间和细胞增殖率明显高于对照组,而凋亡鲻率则明显低于对照组.结论支持细胞可以促进精原细胞的增殖,抑制其凋亡.     

小鼠睾丸膜联蛋白A1的克隆、表达及定位

目的:克隆、表达小鼠睾丸膜联蛋白A1,并研究其在睾丸中的定位。方法:利用RT-PCR技术从小鼠睾丸组织中扩增膜联蛋白A1的cDNA序列,将该基因插入GST融合表达载体pGEX-5T。以亲和层析法纯化蛋白免疫家兔制备多抗,并做睾丸切片免疫组织化学检测。结果:重组质粒测序结果表明,插入片段与小鼠膜联蛋白A1的序列完全一致。K802重组菌高效表达出相对分子质量为63 000的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的30%。多抗效价达1∶102 400,可特异识别重组蛋白。免疫组织化学显示膜联蛋白A1主要分布于精原细胞核、精子细胞顶体帽及精子胞质残余体内。结论:成功克隆、表达了小鼠膜联蛋白A1基因;膜联蛋白A1在睾丸生精细胞中的不同分布预示其可能与生精过程有关。     

锌指蛋白146(RNF146)对吡柔比星引起的小鼠睾丸精原细胞DNA损伤的保护作用

目的评价锌指蛋白146(RNF146)对化疗药吡柔比星引起的GC-1小鼠睾丸精原细胞DNA损伤的保护作用。方法采用1.0μg/m L吡柔比星处理的方法复制DNA损伤的小鼠GC-1精原细胞模型。构建小鼠rnf146慢病毒过表达载体p CDHrnf146并包装rnf146过表达慢病毒,感染GC-1细胞上调rnf146的表达,Western blot验证过表达效率。评价RNF146对吡柔比星引起的GC-1细胞增殖抑制、凋亡增多及DNA损伤的保护作用。结果成功构建了p CDH-rnf146重组质粒并包装具有良好感染效率的RNF146过表达慢病毒。溴脱氧尿苷(Brd U)掺入标记显示RNF146能够减轻吡柔比星引起的GC-1增殖抑制。原位末端转移酶标记技术(TUNEL)提示RNF146能够抑制吡柔比星诱导的GC-1细胞凋亡。彗星实验显示RNF146过表达能够有效保护吡柔比星作用下GC-1细胞DNA的完整性。结论 RNF146对化疗药吡柔比星引起的小鼠睾丸精原细胞损伤具有保护作用。     

Copine-3-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白在细胞中的表达和定位

目的 构建增强型绿色荧光蛋白(pEGFP)-N1-CPNE3真核表达载体,检测Copine-3蛋白在细胞中的表达和定位.方法 利用RT-PCR从人支气管上皮细胞(HBE)中扩增得到编码Copine-3蛋白的CPNE3基因,并亚克隆至pEGFP-N1真核表达载体.将酶切鉴定和测序正确的pEGFP-N1-CPNE3重组质粒...     

人工锌指蛋白(ZFP)的设计及原核表达分析

本实验通过生物信息学手段人工设计了与A20基因启动子区特定靶序列特异作用的锌指蛋白结合域.首先对A20基因启动子进行了结构及功能分析,把经过分析获取的A20启动子区的目标序列提交Scrips研究院的ZF Tools在线服务器,经序列比较,成功获取了A20启动子区特定的18 bp靶序列及与这一靶序列特异性作用的锌指蛋白的氨基酸序列.进一步利用生物信息学手段对获取的锌指蛋白进行了序列特征分析及结构模建.把锌指蛋白的DNA优化序列重组于原核表达载体pTYB11上,并成功进行了原核表达.研究表明,利用生物信息学手段,人工设计特定的锌指蛋白可行,为进一步设计完整的人工转录因子,进而干预A20基因的表达奠定了基础.