微小RNA-126基因敲减对CD4~+T细胞体外功能的影响

目的研究微小RNA-126(microRNA-126,miR-126)基因敲减(knock down,KD)后对CD4~+T细胞体外功能的影响并探讨其意义。方法 MACS分选miR-126 KD小鼠脾脏CD4~+CD62L~+T细胞,ConA刺激48h后,Real-time PCR技术检测细胞内miR-126成熟体表达水平;FACS分别检测CD4~+T细胞表面活化分子CD69、CD62L、CD44和增殖相关分子Ki-67,以及细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17表达变化;Annexin V/PI双染色法检测CD4~+T细胞的凋亡情况。结果与野生型(wide-type,WT)小鼠相比,miR-126KD小鼠的CD4~+T细胞中miR-126成熟体表达显著下调(P0.001);miR-126 KD小鼠CD4~+T细胞活化后CD62L的表达比例显著减少(P0.01),而CD69、CD44的比例显著增加(P0.05);同时Ki-67~+的比例也明显增加(P0.05);此外,miR-126 KD小鼠CD4~+T细胞的INF-γ表达比例显著上调(P0.001),IL-4的比例显著下调(P0.01),而IL-17的比例没有明显变化(P0.05);最后,CD4~+T细胞的凋亡比例显著减少(P0.05)。结论 miR-126基因敲减后CD4~+T细胞的活化、增殖和相关细胞因子分泌均明显增强,为后续深入探讨miR-126在免疫应答中的作用及机制提供前期实验基础。     

微小RNA-7敲减对小鼠脾脏中T淋巴细胞体外功能的影响

观察微小RNA-7(microRNA-7,miR-7)敲减(Knock down,KD)对小鼠脾脏T淋巴细胞体外功能的影响并探讨其意义。常规分离野生型(wild type,WT)小鼠脾脏T淋巴细胞,经CD3和CD28抗体刺激后,Real-time PCR检测不同时间点(0h;24h;48h)细胞中miR-7的表达变化;进一步用Con A、CD3和CD28抗体刺激miR-7KD小鼠脾脏T淋巴细胞,CCK8检测细胞增殖率;Real-time PCR检测miR-7KD小鼠脾脏T淋巴细胞IL-12、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ和IL-10表达的变化;FACS检测CD4+T和CD8+T细胞的数量变化及CD4+T细胞膜分子CD44、CD62L和IL-4、IFN-γ的表达变化。结果显示,WT小鼠脾脏T淋巴细胞活化后,miR-7的表达水平显著上调(P0.05);与WT小鼠相比,在Con A、CD3和CD28抗体作用下miR-7KD小鼠脾脏T淋巴细胞增殖明显增加(P0.05);miR-7KD小鼠脾脏T淋巴细胞IL-12、IL-4、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平均明显上调(P0.05),而IL-10表达显著下调(P0.05);FACS检测结果显示CD4+T细胞比例明显上调(P0.05),而CD8+T细胞的比例变化不显著(P0.05);CD4+T细胞膜分子CD62L水平显著下降,CD69及IL-4、IFN-γ的表达水平均显著上调(P0.05)。结果表明,miR-7敲减以后可显著影响小鼠脾脏T淋巴细胞的功能,本实验为后续深入探讨其在T淋巴细胞功能调控中的作用提供实验依据。     

miR-126基因敲减对小鼠胸腺淋巴细胞发育的影响

目的研究miR-126基因敲减对小鼠胸腺细胞发育的影响,并初步探讨其意义。方法观察miR-126基因敲减(KD)小鼠胸腺的体积、重量和细胞总数;Real-time PCR检测小鼠胸腺miR-126表达水平;HE染色观察小鼠胸腺形态学结构;FACS检测胸腺中淋巴细胞比例、核抗原Ki-67的表达以及细胞凋亡的变化;最后,Western blot检测胸腺中磷酸化AKT(p-AKT)和磷酸化ERK1/2(p-ERK)的表达。结果 WT和miR-126KD小鼠胸腺体积大小、重量以及细胞总数均无明显差异,但miR-126KD小鼠胸腺miRNA-126表达水平显著下调(P0.05)。miR-126KD小鼠胸腺组织结构出现形态学异常。与WT小鼠相比,miR-126KD小鼠胸腺CD4~+SP细胞比例及细胞绝对数明显增加(P0.05),而CD4~+CD8~+(DP)细胞比例及绝对数则显著减少(P0.05),miR-126KD小鼠胸腺CD4~+SP细胞核抗原Ki-67表达显著增加(P0.05),且细胞凋亡明显减少(P0.05),而DP细胞Ki-67表达则明显减少(P0.05)。最后,miR-126KD小鼠胸腺淋巴细胞中磷酸化AKT和磷酸化ERK1/2的表达水平明显下调(P0.05)。结论 miR-126基因敲减可显著影响胸腺细胞特别是CD4~+SP细胞的发育,为后续进一步深入探讨miR-126对T淋巴细胞发育以及功能的影响提供重要的实验基础。     

miR-7敲减CD4~+ T细胞过继转输对小鼠急性肝损伤模型的影响

目的:观察过继转输微小RNA-7(microRNA-7,miR-7)敲减(knockdown,KD)CD4~+ T细胞对小鼠急性肝损伤模型的影响,并探讨其意义。方法:利用磁珠分选技术分别获得正常野生型(WT)小鼠和miR-7KD小鼠脾脏中CD4~+ CD62L~+ T细胞;CFSE染色标记后,按每只小鼠2×10~6个细胞,经尾部静脉注射给同系WT小鼠,并利用伴刀豆球蛋白A建立急性肝损伤模型;观察过继转输后2组小鼠肝脏的形态、重量及其重量指数的变化;HE染色观察小鼠肝脏组织的病理学变化;real-time PCR检测小鼠肝脏组织中凋亡相关分子Bax和P53的表达;流式细胞术检测小鼠肝脏组织中CFSE标记的CD4~+ T细胞活化相关膜分子CD62L表达水平以及细胞因子白细胞介素4(IL-4)和干扰素γ(IFN-γ)的表达变化。结果:与对照组相比,过继转输miR-7KD小鼠CD4~+ CD62L~+ T细胞组(miR-7KD转输组)小鼠的肝脏重量明显减轻(P0.01),但重量指数显著增加(P0.05);HE染色显示miR-7KD转输组的肝脏细胞损伤增加;real-time PCR结果显示miR-7KD转输组肝脏组织中凋亡相关细胞分子Bax和P53的相对表达水平均明显升高(P0.05);流式细胞术检测结果进一步显示肝脏组织中的CFSE~+细胞活化相关分子CD62L的表达水平明显降低(P0.01),细胞因子IFN-γ的表达水平明显增加(P0.05),而IL-4的表达水平显著降低(P0.01)。结论:过继转输miR-7敲减CD4~+ T细胞可显著加重急性肝损伤模型小鼠的肝组织损伤。这为后续深入探讨急性肝损伤的发生机制提供了重要的实验基础。     

microRNA-7基因敲减对小鼠CD4~+SP细胞胸腺发育的影响

目的:研究microRNA-7(miRNA-7,miR-7)基因敲减对小鼠CD4+SP细胞胸腺发育的影响。方法:检测miR-7基因敲减(miR-7 knock down,miR-7KD)和野生型(Wild-type,WT)小鼠胸腺重量及细胞总数变化;HE染色观察miR-7KD小鼠胸腺的形态学结构改变;FACS检测胸腺CD4+单阳性(Single positive,SP)细胞的比例并计算细胞总数,同时检测CD4+SP细胞CD44及CD62L表达变化;核抗原Ki-67染色法检测CD4+SP细胞的增殖情况;FACS检测CD4+SP细胞的凋亡变化;Western blot技术检测胸腺中总ERK1/2和磷酸化ERK1/2表达水平变化。结果:与WT小鼠相比,miR-7KD小鼠胸腺体积、重量以及细胞总数均显著减少,且形态学结构发生改变(P0.05);FACS结果显示,miR-7KD小鼠胸腺CD4+SP细胞比例明显降低,且细胞总数减少(P0.05)。此外,CD4+SP细胞的CD44表达水平显著增加,而CD62L表达水平明显减少(P0.05);同时,CD4+SP细胞增殖及凋亡比例均显著增加(P0.01);最后,miR-7KD小鼠胸腺中ERK1/2以及磷酸化ERK1/2的表达均明显下调(P0.05)。结论:miR-7基因敲减后可显著影响CD4+SP细胞的胸腺发育,这可能与细胞活化水平及ERK1/2信号通路改变有关。     

microRNA-7对小鼠肠系膜淋巴结αβT淋巴细胞组成的影响

目的:研究miR-7(MicroRNA-7,miRNA-7)对小鼠肠系膜淋巴结αβT淋巴细胞比例的影响并初步探讨其意义。方法:利用miR-7基因敲减(Knockdown,KD)小鼠模型,观察其肠系膜淋巴结大小、重量和淋巴结细胞总数,以及HE染色的病理学变化;流式细胞术(FACS)检测淋巴结中αβT淋巴细胞亚群(CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞)以及CD4+T细胞和CD8+T细胞的活化相关分子CD69、CD62L和功能相关因子IFN-γ表达的情况。结果:与野生型(Wild type,WT)小鼠相比,miR-7KD小鼠肠系膜淋巴结大小、重量指数和淋巴结细胞总数均显著增高(P0.05),且HE染色显示MLNs有病理性改变;肠系膜淋巴结中αβCD3+T细胞比例增加显著,其中以CD4+T细胞比例变化最为明显(P0.05),而CD19+B淋巴细胞比例明显下调(P0.05),但各亚群细胞总数均明显增加(P0.05);最后,CD4+T细胞和CD8+T细胞中的CD62L+细胞的比例均显著下调(P0.05),而CD69+细胞和IFN-γ+细胞比例均显著上调(P0.05)。结论:miR-7敲减后可显著影响肠系膜淋巴结中αβT淋巴细胞的组成比例,提示其对肠系膜淋巴结中淋巴细胞的组成和功能具有重要的调控作用。     

微小RNA-7敲减对ConA诱导的小鼠急性肝损伤的影响

目的:研究微小RNA-7(miR-7)敲减(KD)对急性肝损伤(ALI)模型小鼠的影响。方法:野生型(WT)小鼠和miR-7KD小鼠腹腔注射30 mg/kg刀豆蛋白(ConA)建立急性肝损伤模型;48 h后,观察小鼠肝脏的形态、重量及其脏器指数变化;HE染色观察小鼠肝脏组织病理学变化;血清学方法检查血清中谷丙转氨酶(ALT)的水平;ELISA法检测血清中细胞因子IL-4和IFN-γ的水平;流式细胞术检测肝脏组织中CD4~+T细胞的比例及其相关的细胞因子IL-4和IFN-γ的表达变化。结果:与对照组相比,miR-7敲减后急性肝损伤小鼠的肝脏组织颜色变浅,重量减轻,重量指数明显增加(P0.05);HE染色显示miR-7KD小鼠血清炎症细胞浸润显著增多;血清学方法检测发现急性肝损伤小鼠血清ALT的水平明显上升(P0.05);ELISA法检测显示miR-7KD小鼠血清中IFN-γ水平明显升高(P0.01),而IL-4的表达水平则明显降低(P0.01);流式细胞术检测结果显示,miR-7KD小鼠肝脏中CD4+T细胞比例显著升高(P0.01),其相关的细胞因子IFN-γ的表达水平也显著上调(P0.01),而IL-4的水平没有发生明显变化。结论:敲减miR-7基因可明显促进ConA诱导的小鼠急性肝损伤。     

MicroRNA-7 在CD4+ T 细胞体外活化中的表达及意义

目的:观察microRNA-(miR-)在体外活化CD4+ T 细胞中表达的变化,初步探讨其意义。方法:采用免疫磁珠分选法(MACS)获得FVB 小鼠脾脏中CD4+ CD62L+ T 细胞,经抗CD3/ CD28 抗体刺激后,Real-ime PCR 检测miR- 7达水平,FACS 检测活化膜分子CD69 的表达变化;进一步观察刺激不同时间点CD4+ T 细胞中miR-7表达的变化;观察ERK 抑制剂PD98059 处理后,CD4+ T 细胞活化下miR-7表达的变化,同时CCK8 法检测细胞增殖变化,FACS 检测CD69 和CD62L 分子的表达变化;最后, Real-time C 检测各组细胞中IL-7、IL-10 和IFN鄄酌等细胞因子表达水平变化。结果:与对照组相比,抗CD3/ CD28 抗体刺激后,CD4+ CD62L+ T 细胞中miR-7 表达水平显著上调,CD69 分子的表达明显增加(P<0.05);与刺激0 h 组和24 h 组相比,48 h 组和72 h 组miR-7 的表达水平显著上调(P<0.05);PD98059 处理组中,CD4+ T 细胞的miR-7 表达水平显著下降(P<0.05),同时,活化膜分子CD69 的表达比例明显降低(P<0.05);最后,细胞表达IL-6、IL-10 和IFN 的水平均显著减弱(P<0.05)。结论:miR-7 在活化的CD4+ T 细胞中明显上调,并与ERK 信号相关,为后续探讨miR-7 在CD4+ T 细胞功能中的作用提供了前期实验基础。     

甲状腺与外周血T淋巴细胞亚群比例差异

目的观察正常甲状腺与外周血T淋巴细胞亚群,包括调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)、辅助性T细胞1(T helper 1 cells,Th1 cells)和辅助性T细胞2(T helper 2 cells,Th2 cells)的分布,Treg细胞中干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、白介素-4(interleukin-4,IL-4)及其mRNA的表达。方法 20名良性甲状腺肿物患者、3名胸腺手术及3名脾脏切除术患者,术前当天留取外周空腹静脉血,术中分别留取甲状腺、胸腺及脾脏标本,分离单个核细胞,流式细胞术检测标本组织及外周血T淋巴细胞亚群差异。磁珠分离法分离甲状腺及外周血CD25+T细胞,RT-PCR检测Treg中IFN-γ和IL-4 mRNA的表达。NKT细胞受体激动剂α-Galcer刺激Treg 7 d后,RT-PCR检测Treg中IFN-γ、IL-4、CD1d、Vα24及Vβ11 mRNA的表达。结果 1)甲状腺组织Th1、Th2细胞比例低于外周血(P0.001),而Th0、Treg细胞比例高于外周血(P0.001)。2)在甲状腺内,几乎所有的CD4+CD25+Foxp3+细胞可以同时分泌IL-4、IFN-γ,RT-PCR提示其IL-4、IFN-γmRNA表达明显高于外周血,而在外周血中,CD4+CD25+Foxp3+细胞并不表达IL-4或IFN-γ。3)在胸腺和脾脏中,未检测到同时表达IL-4、IFN-γ的CD4+CD25+Foxp3+细胞。4)甲状腺内Treg在α-GalCer刺激前后均不表达NKT细胞的表面标志CD1d、Vα24及Vβ11 m RNA,而IL-4和IFN-γmRNA的表达在刺激前后无明显差异。结论正常甲状腺与外周血T淋巴细胞亚群分布存在差异,甲状腺内Treg特异性的同时表达IL-4及IFN-γ。     

microRNA-7 敲减对内毒素诱导小鼠急性肺损伤的影响

目的:观察microRNA-7(miR-7)敲减对内毒素诱导小鼠急性肺损伤的影响并探讨其意义。方法:利用脂多糖(LPS)腹腔注射(10 mg/ kg 体重)野生型(Wild type,WT)小鼠和miR-7 基因敲减(Knockdown,KD)小鼠建立急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)模型;HE 染色观察肺组织病理学变化;计算肺泡灌洗液(BAL)中的细胞总数;Real-time PCR 检测肺组织炎症相关因子表达变化;流式细胞术(FACS)进一步检测BAL 中固有免疫细胞酌啄T 细胞、F4/80 巨噬细胞(Macrophages,M渍)和适应性免疫细胞CD4+ T 细胞和CD8+ T 细胞的比例和绝对数变化;FACS 检测CD4+ T 细胞活化相关分子CD62L 和CD69 的表达水平。结果:相对野生型(Wild type,WT)小鼠,HE 染色显示miR-7KD 小鼠的肺组织小血管充血和炎性细胞浸润明显减少,病理性损伤明显减轻;Real-time PCR 结果显示促炎性细胞因子IL-6 的表达水平显著降低(P<0.01),而抗炎性细胞因子IL鄄4、TGF 的表达水平明显增加(P<0.05);同时,BAL 中总细胞数显著减少(P<0.05);FACS 检测进一步显示miR-7KD 小鼠的BAL 中F4/80+ M渍细胞的比例及绝对数均明显下调(P<0.05),而 T 细胞的比例上(P<0.05),但其细胞绝对数无差异(P>0.05);BAL 中CD4+ T 细胞和CD8+ T 细胞的比例及其绝对数均显著降低(P<0.05);最后CD4+ T 细胞活化膜分子CD62L的表达水平明显上调(P<0.05),而CD69 的表达水平显著下调(P<0.05)。结论:miR-7 敲减可减轻ALI 模型小鼠的肺部损伤,提示其可能在ALI 发生中发挥了重要调控作用。     

急性期川崎病Th17细胞变化初探

目的 探讨Th17细胞在川崎病(Kawasaki disease,KD)免疫发病机制中的作用.方法 急性期KD患儿60例,正常同年龄对照组32例,KD患儿分别于静脉丙种球蛋白(IVIG)治疗前后直接取血备检.采用荧光定量PCR(real-time PCR)检测CD4+T细胞IL-17A/F、转录因子ROR-γt、Foxp3及PBMC IL-6、TGF-β、IL-23p19、IL-27p28、IL-27EBI3、IFN-γ等mRNA表达;酶联免疫吸附试验检测血浆中IL-6、TGF-β、IL-23、IL-27、IFN-γ的蛋白浓度;流式细胞术检测外周血CD4+CD25+调节性T细胞(Tr)的比例.结果 急性期KD患儿CD4+T细胞高表达IL-17A及IL-17F(P<0.01),IVIG治疗后明显降低(P<0.01);急性期KD患儿IL-17A/IL-17F与红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、白细胞数目(WBC)呈正相关(IL-17A:0.70,0.85,0.80,P<0.01;IL-17F:0.63,0.65,0.69,P<0.01);急性期KD患儿Th17细胞转录因子ROR-γt及前炎症细胞因子IL-6转录水平明显高于对照组(P<0.01),IVIG治疗后显著降低(P<0.01);TGF-β、IL-23p19、IL-27p28、IL-27EBI3 mRNA水平及血浆蛋白浓度与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);血浆IFN-γ浓度显著升高,mRNA水平无变化;急性期KD患儿CD4+ CD25+ Tr细胞比例明显低于正常对照组(P<0.01),其转录因子Foxp3表达亦明显降低(P<0.01).结论 急性期KD患儿Th17细胞过度活化可能参与了KD免疫发病机制.     

miRNA-126 基因敲减小鼠脾脏中免疫细胞的组成变化

目的:观察miRNA-126基因敲减(Knock down,KD)小鼠脾脏中免疫细胞组成比例变化并探讨其意义。方法:Realtime PCR探针法检测miR-126KD小鼠脾脏中miR-126表达水平,计算脾脏总细胞数;HE染色观察脾脏组织的病理学变化;流式细胞术(FACS)分别检测脾脏中DCs细胞、巨噬细胞、γδT细胞、NKT细胞,CD3~+T细胞和其亚群以及CD19~+B细胞的比例并计算细胞绝对数;免疫印迹法(Western blot,WB)检测脾脏组织中磷酸化NF-κB和磷酸化Akt的表达水平。结果:与野生型(WT)小鼠相比,miR-126KD脾组织中miR-126表达水平明显降低(P0.05),细胞总数明显增加(P0.05),且发生明显病理学改变;固有免疫细胞中NK细胞的比例和细胞绝对数显著增加(P0.05),但巨噬细胞的比例显著降低(P0.05);适应性免疫细胞中CD3~+T细胞和CD4~+T细胞的比例和绝对细胞数都显著增加(P0.05),而CD19~+B细胞仅绝对数显著增加(P0.05);最后miRNA-126KD小鼠脾脏组织的磷酸化NF-κB和磷酸化Akt水平明显增加(P0.05)。结论:miRNA-126敲减小鼠脾脏中各免疫细胞亚群的组成发生明显改变,可能与NF-κB和Akt信号通路传递变化有关,为后续探讨miR-126在机体免疫应答中的作用提供了前期实验基础。     

脂多糖诱导小鼠内皮损伤早期T细胞亚群的变化

目的:探讨脂多糖(LPS)诱导内皮损伤早期T细胞亚群的变化。方法:采用扫描电镜观察LPS刺激后内膜的形态学变化,流式细胞术检测外周血中内皮细胞表型CD62P+、CD62P+CD62E+改变,采用胞内外因子染色法检测T细胞亚群的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素17(IL-17)及白细胞介素10(IL-10)的分泌状态。结果:LPS可导致小鼠血管内皮完整性受损,脱落内皮细胞CD62P+、CD62P+CD62E+比例明显高于对照组(P<0.05);内皮损伤的同时,小鼠CD3+CD4+T细胞中,TNF-α、IFN-γ、IL-17分泌细胞比例显著增加(P<0.05),而IL-10的分泌在LPS刺激1小时、4小时时升高较为明显(P<0.05)。结论:炎性CD4+T细胞亚群与脱落内皮细胞CD62P、CD62E的高表达状态是血管内膜损伤早期的重要特征性标志。     

MicroRNA-126基因敲减小鼠腹腔巨噬细胞功能的变化及意义

研究microRNA-126(miR-126)基因敲减小鼠腹腔巨噬细胞的功能变化,初步探讨其意义。采用real-time PCR检测LPS刺激前后野生型(wild type,WT)小鼠腹腔巨噬细胞miR-126表达变化,CCK8法检测其增殖情况;观察miR-126基因敲减(knock down,KD)小鼠腹腔巨噬细胞的形态变化,并用real-time PCR检测miR-126表达变化;CCK8法检测LPS刺激下miR-126KD小鼠腹腔巨噬细胞增殖变化;FACS检测巨噬细胞表面MHCⅡ类分子和CD86分子的表达变化;最后,real-time PCR检测巨噬细胞表达炎症因子IL-6、TGF-β和Ⅰ型精氨酸酶(arginase 1,Arg-1)等的变化情况。结果显示,WT小鼠腹腔巨噬细胞在LPS刺激后miR-126表达水平下调,显著低于未刺激组(P0.05),而增殖能力明显增强(P0.05);与WT小鼠相比,miR-126KD小鼠腹腔巨噬细胞的miR-126表达量明显下调(P0.05);形态上,WT小鼠腹腔巨噬细胞有较长伪足,多呈梭形,而miR-126KD小鼠腹腔巨噬细胞多呈圆形,细胞边缘光滑较少见伪足;LPS作用48h后,miR-126KD小鼠腹腔巨噬细胞的增殖能力明显强于WT小鼠(P0.05);且其膜MHCⅡ类分子和CD86分子表达也较WT小鼠显著上调(P0.05);LPS刺激下,miR-126KD小鼠腹腔巨噬细胞CCL-1表达显著增加,而IL-6、TGF-β和Arg-1的表达水平显著减少(P0.05)。这些结果提示,miR-126基因敲减可显著影响小鼠腹腔巨噬细胞的增殖能力和功能相关分子的表达,提示miR-126对小鼠腹腔巨噬细胞的功能具有重要的调控作用。     

IL-12有助于化疗药物处理后肿瘤患者及小鼠的细胞免疫功能重建

目的探讨白细胞介素12(IL-12)是否能够恢复化疗药物对肿瘤患者和小鼠细胞的免疫抑制作用。方法分离顺铂化疗前后肿瘤患者及正常人外周血单个核细胞(PBMC),在抗CD3抗体和抗CD28抗体共刺激条件下,加或不加IL-12。培养后,ELISA检测上清中γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平,流式细胞术检测不同亚群T细胞IFN-γ的水平。建立顺铂毒性小鼠模型,采用以上方法检测IFN-γ、TNF-α水平。结果肿瘤患者产生的IFN-γ和TNF-α显著低于正常人;与化疗前患者相比,化疗后患者IFN-γ和TNF-α的产生明显减少,IL-12可以显著增强IFN-γ和TNF-α的产生;T细胞亚群分析的结果表明,IL-12可以恢复化疗后CD4~+T细胞和CD8~+T细胞中IFN-γ的水平。小鼠体内实验证明,化疗药物抑制小鼠T细胞的免疫功能,IL-12能完全恢复T细胞免疫功能。结论化疗药物抑制肿瘤患者和小鼠细胞的免疫应答,而IL-12能够恢复化疗药物对细胞因子的抑制作用,从而对肿瘤化疗患者重建免疫功能起到非常重要的作用。     

日本血吸虫感染小鼠的髓源抑制细胞对T 细胞的免疫抑制

目的:研究日本血吸虫感染小鼠模型中的髓源抑制细胞(MDSCs)的免疫抑制功能及对T细胞的作用机制。方法:构建日本血吸虫感染BALB/c小鼠模型,流式细胞术检测MDSCs动态比例变化,免疫磁珠分选小鼠骨髓中单核系MDSCs(CD11b+Gr1+Ly6G-)和粒系MDSCs (CD11b~+Gr1~+Ly6G~+)亚群细胞,Write-Giemsa染色进行形态学鉴定; CFSE法检测单核系和粒系MDSCs亚群对CD4~+T、CD8+T细胞增殖的抑制作用,Real-time PCR方法检测细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β和精氨酸酶(ArgⅠ)、一氧化氮合酶2(NOS2)的表达。结果:血吸虫感染模型小鼠的MDSCs较对照组小鼠明显增多,以粒系MDSCs(CD11b+Gr1+Ly6G+)亚群增多为主。两个亚群细胞均能降低CD4+T、CD8+T细胞的增殖活性,粒系亚群MDSCs的抑制作用更显著; Real-time PCR结果显示两个亚群细胞的细胞因子IL-4、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ以及ArgⅠ、NOS2的表达水平均不同程度升高。结论:血吸虫感染模型小鼠体内的MDSCs显著增高,单核系MDSCs(CD11b+Gr1+Ly6G-)和粒系MDSCs(CD11b+Gr1+Ly6G+)亚群均能抑制CD4~+T、CD8~+T细胞增殖,其作用机制可能与两亚群细胞均能上调相关细胞因子IL-4、IL-10、IL-13和ArgⅠ、NOS2的表达有关。     

IL-2抑制小鼠CD4~+ CD62L~+ T细胞分化为Th17细胞

目的研究IL-2对小鼠脾脏CD4+CD62L+T细胞在体外向Th17细胞分化的作用。方法免疫磁珠法分选C57BL/6小鼠脾脏CD4+CD62L+T细胞,于抗体包被的培养板中培养3 d,实验分为对照组和IL-2处理组。对照组为经典Th17诱导分化培养基,IL-2处理组在对照组基础上于培养体系中添加IL-2。CFSE染色检测细胞增殖,Annexin V-PI法检测细胞凋亡,ELISA检测培养上清中IL-17A的浓度,荧光定量PCR检测Rorγt mRNA的表达,流式细胞术检测CD4~+IL-17~+Th17的生成比例以及Rorγt的表达。结果磁珠分选的小鼠脾脏CD4+CD62L+nave T细胞纯度高于95%。与对照组相比,IL-2处理组细胞数目明显增多,增殖能力明显增强(P0.05),细胞凋亡比例降低(P0.05);IL-2处理组培养上清中IL-17A的浓度明显降低(P0.05),且CD4+IL-17+细胞比例下降,其特异性转录因子Rorγt的表达水平也显著降低(P0.05)。结论 IL-2在CD4+CD62L+T细胞分化为Th17的过程中,能够促进T细胞的增殖并且抑制Th17的分化。     

IL-37通过作用树突状细胞调节CD8~+T细胞功能

将小鼠骨髓细胞诱导分化为DC,用IL-37处理后,流式细胞术检测细胞表面共刺激分子(CD86、CD80),RT-PCR法检测TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-12和TGF-βmRNA的表达,多重液相蛋白定量CBA试剂盒及ELISA试剂盒检测细胞上清中TNF-α、IL-6、IL-12、IFN-γ、MCP-1和TGF-β蛋白的表达。Western blotting方法检测DC中磷酸化蛋白的表达。将DC与T细胞共培养,流式细胞术检测CD8+T细胞增殖及活化程度(CFSE、CD69)。结果显示,IL-37能够降低表达CD80+/CD86+的DC数量。促炎因子TNF-α、IL-12和IL-6的表达被明显抑制,而T淋巴细胞抑制因子TGF-β明显增高。IL-37预处理的DC明显降低T淋巴细胞的增殖和活化能力。IL-37能够降低DC中磷酸化ERK和NF-κB的表达。IL-37处理的DC对CD8+T细胞产生明显抑制作用。结果表明,IL-37能够通过影响ERK和NF-κB依赖的信号通路抑制DC的成熟和免疫反应,从而抑制CD8+T细胞的活化及增殖。     

结核分枝杆菌H37Ra诱导核苷酸结合寡聚结构域2基因敲除(NOD2~(-/-))小鼠的1型辅助T(Th1)细胞型免疫应答

目的探讨1型辅助T(Th1)细胞的细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和γ干扰素(IFN-γ)及多功能T细胞在感染结核分枝杆菌H37Ra的核苷酸结合寡聚结构域2基因敲除(NOD2~(-/-))小鼠中的作用。方法 NOD2~(-/-)小鼠与野生型C57BL/6小鼠气管分别滴入MTB减毒株H37Ra建立肺部感染模型并设立生理盐水对照组,每组10只。4周后,取肺组织进行HE染色及病理评分;ELISA检测肺组织匀浆中TNF-α和IFN-γ含量;流式细胞术检测脾细胞中多功能CD4~+ T/CD8~+ T细胞的比例。结果 NOD2~(-/-)小鼠感染H37Ra后肺组织炎症加重,肺组织TNF-α和IFN-γ含量增加。与生理盐水组相比,两种小鼠感染后, CD4~+/CD8~+T细胞中TNF-α~+、 IFN-γ~+单阳性细胞及TNF-α~+IFN-γ~+细胞均显著增加;与C57BL/6小鼠感染组相比, NOD2~(-/-)小鼠感染组体内TNF-α~+ CD4~+ T细胞、 IFN-γ~+ CD4~+T细胞及IFN-γ~+ CD8~+ T细胞显著增加。结论 H37Ra可诱导NOD2~(-/-)小鼠的Th1细胞型免疫应答反应。     

HDAC抑制剂丙戊酸对小鼠T淋巴细胞表达细胞因子的影响

目的分析组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂丙戊酸(Valproic acid,VPA)对小鼠T细胞亚群IL-2、IFN-γ和IL-6表达的影响,探讨其抗炎免疫调节作用的机制。方法经VPA处理小鼠淋巴细胞,并在佛波醇酯(PDB)和离子霉素刺激后,以流式细胞术分析CD3+、CD4+和CD8+T细胞表达IL-2、IFN-γ和IL-6的情况。结果淋巴细胞受刺激后,IL-6的表达水平仅稍有提高,而IL-2在CD4+和CD8+T细胞表达率分别为35.49%和5.50%,IFN-γ表达率分别为3.47%和38.60%。经VPA处理后,CD3+T细胞IL-6+、IFN-γ+和IL-6+IFN-γ+的表达均受剂量依赖性抑制(P<0.01)。同样,VPA能够剂量依赖性地降低小鼠CD4+和CD8+T细胞亚群内表达IL-2+、IFN-γ+的细胞比例(P<0.01),对于IL-2+IFN-γ+双阳性细胞的比例也具有明显抑制作用(P<0.01);此外,VPA对CD8+T细胞表达IFN-γ的抑制程度高于CD4+T细胞。结论 HDAC抑制剂VPA通过抑制IL-2和IFN-γ而发挥其抗炎和免疫调节效应。