大鼠重组骨桥蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达和纯化

目的 构建包含大鼠骨桥蛋白(OPN)的真核表达载体,获得稳定表达重组蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株并对蛋白进行纯化,为OPN在大鼠模型实验中的进一步功能学研究奠定基础.方法 通过脂质体lipofectamine 2000将重组质粒pLVX-OPN转染到CHO细胞中,嘌呤霉素筛选出稳定克隆细胞.Real-time PCR法检测转染后CHO细胞中OPN的mRNA表达水平,酶联免疫吸附实验法(ELISA)检测上清中OPN分泌水平.取CHO细胞72 h无血清培养上清进行镍柱亲和层析纯化,ELISA法和Western blot法分别检测产量和纯度.结果 pLVX-OPN表达载体经DNA琼脂糖电泳鉴定为阳性,且质粒测序成功.经质粒pLVX-OPN转染的CHO细胞中OPN mRNA表达水平是转染前的上千倍,上清分泌蛋白水平较转染前增加.上清分泌的OPN蛋白通过镍柱亲和层析纯化后纯度有所提高,产量在30％以上.结论 pLVX-OPN真核表达载体的成功构建和在CHO细胞中的稳定表达及纯化为OPN的功能学研究提供了有效工具.     

人载脂蛋白A—1基因在中国仓鼠卵巢细胞的表达

本文报道了用人载脂蛋白A-1(apo A-1)的cDNA探针从人基因库中筛选到apo A-1全基因:将2.2kb的apo A-1全基因连接到1.9kb鼠MT-1基因启动子下游,组装成人apo A-1基因表达质粒pLY1。质粒pLY1与质粒pSV2-neo共转化中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,经G418筛选,单细胞克隆培养,经酶联免疫测定,结果表明,人apo A-1可在CHO细胞中得到表达。     

重组人细胞介素12基因在CHO─dhfr~－细胞的稳定表达

将分别含有重组人ＩＬ－１２（ｒｈＩＬ－１２）两个亚单位ｃＤＮＡ的真核细胞高效表达载体，通过Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导，共转染至ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞中。经选择性培养基培养、细胞染色体ＤＮＡｄｏｔｂｌｏｔ实验、Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ实验鉴定，筛选出能表达ｒｈＩＬ－１２的细胞株，经氨甲喋呤加压诱导，表达量约为１５０ｕ／ｍｌ，且经液氮冻存３ｍｏ以上仍有表达。本实验还研究了表达产物对人ＰＢＭＣ的促增殖作用和增加ＮＫ细胞毒活性作用，为进一步研究ｒｈＩＬ－１２的生物学功能奠定了基础。     

重组人肝脏胶原样凝集素1在中国仓鼠卵巢细胞内定位

目的:使用已构建的真核表达载体pEGFP-CLL1转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,探讨CL-L1在CHO细胞内的定位.方法:使用免疫荧光标记技术和Western blot检测EGFP-CLL1融合蛋白在细胞内的表达部位.结果:融合蛋白主要存在于细胞质基质中,不存在于内质网、高尔基体和细胞核等部位.结论:CL-L1为已发现惟一存在于细胞质基质中的胶原样凝集素成员.     

中国仓鼠卵巢细胞表达的乙型肝炎病毒表面抗原含量…

采用基因转染中国仓鼠卵巢细胞表达的乙型肝炎病毒表面抗原建立质控参考品，为建立ＨＢｓＡｇ酶标法诊断试剂盒实验室内部质量控制提供了保证。用直接非竞争酶联免疫检测法平行比较ＨＢｓＡｇ质控参考品和卫生部药品生物制品检定所灵敏度参比血清的含量，结果表明两者的各点能相互重叠，说明二者的ＨＢｓＡｇ含量相一致。     

重组人白细胞介素12基因在CHO—dhfr^—细胞的稳定表达

将分别含有重组人ＩＬ－１２（ｒｈＩＬ－１２）两个亚单位ｃＤＮＡ的真核细胞高效表达载体，通过Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导，共转染至ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＾－细胞中。经选择性培养基培养、细胞染色体ＤＮＡ ｄｏｔ ｂｌｏｔ实验、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ实验鉴定，筛选出能表达ｒｈＩＬ－１２的细胞株，经氨甲喋呤加压诱导，表达量约为１５０ｕ／ｍｌ，且经液氮冻存３ｍｏ以上仍有表达。本实验还研究     

稳定、高效表达肝细胞生长因子的中国仓鼠卵巢细胞系的构建

目的:构建hHGF-pCDNA3.1表达载体,在中国仓鼠卵巢细胞中获得具有生物学活性的重组人肝细胞生长因子蛋白的高效、稳定表达。方法:RT-PCR扩增人肝脏中hHGF全长cDNA片段,克隆入pCDNA3.1( )真核表达载体中,构建hHGF-pCD-NA3.1重组质粒并转染中国仓鼠卵巢细胞,经筛选得到了高效、稳定表达hHGF的细胞克隆,采用RT-PCR和ELISA方法检测hHGF在中国仓鼠卵巢细胞中的表达。结果:酶切及测序结果表明重组质粒构建正确,RT-PCR显示细胞的rhHGF mRNA呈现高水平,ELISA检测hHGF在细胞中的分泌性表达,浓度达10ug/L。结论:成功地在中国仓鼠卵巢细胞中获得了hHGF蛋白的高效、稳定表达。为下一步将表达hHGF的细胞微囊化制备基因工程细胞,并移植用于相关疾病的基因治疗奠定了基础。     

抗菌肽Defensin真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的 构建家蝇幼虫抗菌肽的真核表达载体,并检测它在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达情况.方法 以pUCm-T/Defensin为模板,设计带His标签特异引物,扩增C-末端融合6×His标签的Defensin基因的cDNA全长编码区序列,将其克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体.经酶切及测序鉴定后,以阳离子脂质体...     

CEA-HBD2重组基因在人结肠癌细胞中表达初步研究

目的构建高表达人源化HBD2人结肠癌表达体系.方法构建人pLNCX2-CEA信号肽-HBD2抗菌肽(成熟肽序列)逆转录表达载体,DOTAP转染逆转录包装细胞,产生的含融合基因的侵袭性逆转录病毒,转染人结肠癌HCT116细胞,用免疫印迹法法鉴定转化细胞中HBD2蛋白的表达.结果正确构建了表达HBD2成熟肽的重组信号肽HBD2的人结肠癌表达体系,并出现正确的目的基因表达.结论此HBD2表达体系表达的特异性多肽经纯化后,可进行下一步检测等实验.     

CEA-HBD2重组基因在人结肠癌细胞中表达初步研究

目的　构建高表达人源化HBD2人结肠癌表达体系 .方法　构建人pLNCX2 -CEA信号肽—HBD2抗菌肽(成熟肽序列 )逆转录表达载体 ,DOTAP转染逆转录包装细胞 ,产生的含融合基因的侵袭性逆转录病毒 ,转染人结肠癌HCT116细胞 ,用免疫印迹法法鉴定转化细胞中HBD2蛋白的表达 .结果　正确构建了表达HBD2成熟肽的重组信号肽HBD2的人结肠癌表达体系 ,并出现正确的目的基因表达 .结论　此HBD2表达体系表达的特异性多肽经纯化后 ,可进行下一步检测等实验     

人PAK4基因原核表达载体的构建及其重组蛋白表达

目的构建hPAK4的原核表达载体并诱导和鉴定其表达。方法pCAN2-PAK4质粒经XhoI和BamH I双酶切后,克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,在E.coliBL21中诱导GST-hPAK4融合蛋白表达,并经W estern印迹鉴定结果。结果hPAK4编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,双酶切鉴定片段大小为2.4kb,并在E.coliBL21中获得了诱导表达,蛋白的分子量为92KD。结论成功构建了hPAK4基因原核表达载体,诱导表达出GST-hPAK4融合蛋白。     

不同剂次重组乙型肝炎疫苗(中国仓鼠卵巢细胞)加强免疫效果评价

加强免疫是提高保护性抗体阳性率和滴度的有效途径.国内对加强免疫的必要性存在争议.如有的从免疫细胞特异的回忆反应角度进行研究,认为加强免疫似无必要[1];有的从乙肝病毒携带率与免疫后间隔时间相关性角度进行研究,认为有必要进行加强免疫[2-3],以增加免疫效果.结合当前疫苗安全有效、价廉且市场供应充足的实际,为确保避免感染后成为慢性携带者,在抗体下降到保护水平以下接触乙肝病毒后是否能避免感染这一问题尚未明确以前[4-5],本研究选择能诱导较强地体液免疫且其表达的蛋白抗原接近天然HBsAg的HepB(CHO)进行加强免疫研究,比较其免疫效果,旨在为基层采取适宜加强免疫措施提供依据.     

重组人beta防御素基因在COS-7细胞的转染表达

为探索建立持续稳定表达hBD-2的哺乳类动物型工程细胞的可能性，本研究构建真核重组表达载体pCMv．tag2B／hBD-2以进行COS-7细胞转染表达实验。将本室克隆获得的hBD-2全长cDNA片段插入带有报告基因的真核表达质粒pCMA．tag2B构建出hBD-2的重组表达裁体pCMV．tag2B／hBD-2，并经DNA顺序证明hBD-2eDNA片段的插入方向和其全长cDNA的硷基组成顺序均准确无误。     

携带外源基因的rAAV-2在人树突状细胞中的稳定表达

目的:观察2型重组腺相关病毒(rAAV-2)载体介导外源基因对人外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC)的感染效能。方法:采用激光共聚焦显微镜观察FITC标记的rAAV-2进入DC的过程;用不同的感染复数(MOI)的rAAV-2-Luc和rAAV-2-GFP感染新分离的DC,荧光素酶(Luc)检测试剂盒检测Luc的表达和流式细胞术(FACS)检测GFP表达细胞的百分率。结果:加入rAAV-2后80分钟就可见病毒吸附在DC膜上,至90分钟可完全进入细胞内;MOI为1×104vp/cell时就可检测到Luc的表达,并呈现出随着MOI的加大而提高的趋势,自MOI为5×105vp/cell起,再提高MOI值并不能明显增加luc的表达;rAAV-2介导外源基因感染DC 48小时后就可检测到表达,从96~240小时表达水平无明显变化;GFP的表达率为5~18%。结论:rAAV-2介导外源基因能有效感染DC,感染的DC可稳定表达外源基因,rAAV-2载体体外遗传修饰的DC可以进一步用于ex vivo途径的免疫治疗研究。     

人MAdCAM-1胞外区基因在原核系统的表达及重组蛋白纯化

目的：制备高纯度的重组人MAdCAM-1蛋白。方法 采用PCR技术从pUC21/hMadCAM-1质粒上,选择性扩增编码成熟MAdCAM-1胞外区两个Ig域的基因片段。将其克隆至pQE30载中,转化大肠杆菌后,以IPTG诱导表达,产物经Ni-NTA亲和层析纯化。结果：诱导表达出相对分子质量（Mt)约29000的融合蛋白。薄层凝胶扫描显示,其表达量占菌体总蛋白质的50％左右。经亲和层析纯化得到高纯度的蛋白产品。结论 获得了重组人MAdCAM-1胞外区蛋白,为后续功能研究及其单抗研制奠定了基础。     

人RNF6基因原核表达载体的构建及其重组蛋白的表达

目的 构建人hRNF6基因的原核表达载体并诱导和鉴定其融合蛋白表达.方法 提取前列腺癌细胞CWR22Rvl的mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增hRNF6全长编码基因,并将其克隆至GST融合表达载体pGEX5X-1,在E.coli BL21中诱导GST-hRNF6融合蛋白表达,并经免疫印迹鉴定结果.结果 hRNF6编...     

重组人胰岛素原基因在培养的大鼠肝癌细胞中基因转移和表达

目的： 探讨含有葡萄糖反应元件的重组人胰岛素原基因在培养的大鼠肝癌细胞中基因转移及表达情况。方法: 将含有3点突变及2点突变的人胰岛素原基因转染至大鼠肝癌CBRH7919细胞，测定不同葡萄糖浓度下瞬时及用G418筛选稳定表达后胰岛素的分泌量，并检测基因整合情况。结果： ① 转染后38 h及1个月，不同葡萄糖浓度下，含有3点突变胰岛素原基因的肝癌细胞胰岛素分泌量不同; 含有2点突变胰岛素原基因的肝癌细胞，只有在25 mmol/L的葡萄糖浓度培养液中，才能测出胰岛素分泌量；② 阳性克隆细胞基因组扩增出特异目的电泳条带，未转染细胞无此条带。结论: ①用逆转录病毒为载体能将重组人胰岛素原基因转染到肝癌细胞中,并使之稳定表达。② 所构建的重组人胰岛素原基因能指导靶细胞随葡萄糖浓度的变化调节胰岛素分泌。     

含人血栓调节蛋白基因重组质粒的构建和表达

目的:构建hTM真核表达质粒,并导入脐静脉内皮细胞(HUVECs)中表达,为临床血栓病的基因治疗提供实验依据和物质基础。方法:PCR法扩增hTM基因的全长表达片段,HindⅢ/EcoRⅠ酶切后与pcDNA3.1(+)/neo质粒连接成pcDNA3.1/hTM。经鉴定正确后,由阳离子脂质体包裹转染HUVECs,免疫组化检测转染后细胞hTM的表达。结果:双酶切及测序鉴定均证实hTM基因被成功克隆。pcDNA3.1/hTM经脂质体介导能有效地转染内皮细胞,转染效率约为10%左右。结论:成功构建pcDNA3.1/hTM重组质粒,并且能在内皮细胞中高效表达。为进一步的基因治疗提供物质基础。     

平足蛋白PDPN在结直肠癌中的表达及临床意义

目的 探讨平足蛋白(podoplanin,PDPN)在结直肠癌组织中的表达与结直肠癌临床指标的相关性,并阐述其表达在结直肠癌诊疗中的临床意义.方法 下载TCGA数据库中结直肠癌转录组和临床组数据,分析在结直肠癌中PDPN蛋白表达与结直肠癌患者的临床信息(年龄、性别、临床分期、肿瘤分级和淋巴结转移情况)的相关性.通过免疫...