小鼠抗EV71衣壳蛋白VP1单克隆抗体的制备

目的制备肠道病毒71型(EV71)衣壳蛋白VP1特异性小鼠单克隆抗体(mAb)并检测其特异性。方法合成编码EV71-VP1的基因并克隆入原核表达质粒p ET21a;采用重组表达的VP1免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合并采用ELISA筛选可分泌抗VP1的m Ab的杂交瘤细胞株;将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔,采用蛋白G亲和层析法从腹水中纯化mAb,并采用SDS-PAGE和Western blot法检测m Ab的纯度和特异性;EV71感染Vero细胞,采用间接免疫荧光细胞化学染色和Western blot法评估所制备m Ab识别EV71的能力。结果成功表达了EV71-VP1,制备出了4株杂交瘤细胞(6E、8D、9F和10C),杂交瘤细胞所分泌的小鼠m Ab均可识别EV71。结论成功制备了小鼠抗EV71衣壳蛋白VP1的m Ab。     

抑制和激活蛋白1(Rap1)单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备并鉴定人端粒相关蛋白抑制和激活蛋白1(Rap1)的单克隆抗体。方法用重组原核人Rap1蛋白免疫BALB/c小鼠;细胞融合后,间接ELISA筛选阳性杂交瘤,建立分泌抗人Rap1蛋白单克隆抗体(m Ab)的杂交瘤细胞株,并进行效价测定和特异性鉴定。结果制备并获得1株稳定分泌抗人Rap1蛋白m Ab的杂交瘤细胞株。ELISA测定腹水效价高达1∶10 000以上。Western blot法、免疫沉淀和免疫荧光染色证实该m Ab能特异性识别人Rap1蛋白并可用于上述不同检测。结论成功制备获得了亲和力高、特异性好的抗人端粒相关蛋白Rap1的m Ab。     

鸡细胞周期检验点激酶2(cChk2)单克隆抗体制备和鉴定

目的制备特异性鸡细胞周期检验点激酶2(cChk2)单克隆抗体(m Ab)。方法反转录PCR扩增cChk2基因,将其克隆入原核表达质粒p GEX-4T-3中,在BL21(DE3)中经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经SDS-PAGE检测可溶性。用cChk2腹腔免疫BALB/c小鼠,利用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法检测抗血清;血清检测阳性后,取小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,利用IFA和有限稀释法筛选阳性单克隆杂交瘤细胞株。结果 cChk2主要以包涵体形式存在,多抗血清具有良好的效价,获得9株阳性杂交瘤细胞株,即1F4、2D9、2G1、3D9、3E3、4B5、4E2、5C9及5F7。结论成功制备了特异性良好的cChk2 m Ab。     

人血管内皮钙黏蛋白5单克隆抗体的制备及应用

目的制备并鉴定人血管内皮钙黏蛋白5(VECDH5)的单克隆抗体(m Ab)。方法用重组原核人VECDH5蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术进行细胞融合;间接ELISA筛选阳性克隆,得到稳定分泌抗VECDH5抗体的杂交瘤细胞株,ELISA测定其效价;Western blot法、流式细胞术、免疫荧光细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定其特异性及抗原表位。结果制备并获得1株可分泌特异性抗VECDH5的杂交瘤细胞株(2C11)。ELISA测定腹水效价高达1∶10 000。多种方法均证实该抗体能特异性识别人VECDH5蛋白,并可在上述不同方法中应用。经抗原表位鉴定,研究制备的2C11识别的氨基酸序列为LDREVVPWYNLTVEA。结论成功制备了亲和力高、特异型好的抗人VECDH5的m Ab。     

抗肠道病毒EV71型外壳蛋白VP1单克隆抗体的制备和鉴定

目的 制备具有中和活性的抗肠道病毒EV71型外壳蛋白VP1的单克隆抗体.方法 人工合成SP55和SP70(分别包含VP1的第163-177,208-222位氨基酸)两段VP1的多肽,分别免疫BALB/c小鼠,常规杂交瘤技术进行细胞融合,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞并测定效价.用分泌的单抗和EV71病毒在RD细胞上进行中和试验以检验其中和活性.结果 得到2株能稳定分泌抗肠道病毒EV71型VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,2株单抗的中和效价分别为1:8和1:16.结论 成功制备出2株具有中和活性的抗肠道病毒EV71型VP1蛋白单克隆抗体,为其下一步应用打下基础.     

人睾丸特异性新基因hTSC29合成肽单克隆抗体制备与鉴定北大核心CSCD

目的:制备和初步鉴定人睾丸特异性新基因h TSC29(Gen Bank登录号:BC032957)合成肽的单克隆抗体(m Ab)。方法:利用生物信息学方法对h TSC29的蛋白质序列进行分析和预测,根据免疫原性、表露性、亲疏水性及柔韧性4个参数,合成一段由18个氨基酸组成的多肽,并以此为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合后,通过有限稀释法筛选阳性克隆,采用ELISA法、Western blot、免疫组化和免疫荧光法鉴定h TSC29 m Ab的特异性。结果:获得了1株稳定分泌h TSC29 m Ab的杂交瘤细胞株,分泌的抗体属Ig G2b(κ)亚型,杂交瘤细胞培养上清效价达到1∶104;Western blot鉴定表明,制备h TSC29 m Ab可特异性地识别人睾丸总蛋白中Mr约为60 000处的蛋白;免疫组织化学和免疫荧光结果显示h TSC29蛋白主要定位在正常人睾丸组织中的精母细胞和精子细胞。结论:成功建立了1株稳定分泌抗h TSC29 m Ab的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体效价高、特异性强,为进一步研究h TSC29的功能提供了特异的检测工具。     

禽流感病毒核蛋白单克隆抗体的制备及部分特性鉴定

目的：制备抗禽流感病毒（AIV）核蛋白（NP）的单克隆抗体（mAb）并进行特性鉴定。方法：分别用甲醛灭活的和TritonX-100裂解的AIV H9N2及AIVNP基因的原核表达产物免疫BALB／c小鼠。经细胞融合、间接ELISA筛选及克隆化，建立能稳定分泌抗AIV NP mAb的杂交瘤细胞株。mAb的效价采用间接ELISA测定，用交义反应试验及间接免疫荧光染色法检测mAb的特异性。结果：经细胞融合、筛选及克隆化，间接ELISA法测定，mAb共得到6株能稳定分泌抗禽流感病毒NPmAb的杂交瘤细胞株，分别命名为4F4、1C3、1G11、1C2、1D10及2E7。1G11、1D10腹水的ELISA效价最高，分别为2^-13和2^-14。交叉反应试验及间接免疫荧光染色检测表明，两株mAb的特异性良好。结论：其获得6株抗AIVNP的mAb，其中2株mAb1C11和1D10的效价最高，特异性良好，为AIV的研究及快速诊断方法的建立奠定了基础。     

猪流感病毒H1亚型HA蛋白特异性单克隆抗体的研制

目的:研制猪流感病毒抗H1亚型HA特异性单克隆抗体(mAb).方法:构建 H1 亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)HA基因表达质粒,基因免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞 Sp2/0进行融合.通过ELISA、 HI试验筛选阳性克隆.应用ELISA、 HI 试验和Western blot试验测定mAb的反应性和特异性.结果:共获得3株分泌抗H1亚型猪流感病毒HA蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为8C4、 8C6、 9D6.mAb腹水ELISA 效价在1:16 000～1:256 000之间;HI效价为1:512 ～1:256 000;对A/Swine/Guangdong/LM/2004的中和效价分别为:10-2.83、 10-6.4、 10-5.8.Western blot分析结果显示,3 株mAb只与H1亚型猪流感病毒HA蛋白反应.结论:HA蛋白特异性mAb的研制为H1抗原变异分析及H1亚型猪流感诊断方法的建立奠定了物质基础.     

肠病毒71型分离株的鉴定及免疫原性研究

目的 在对肠病毒71型(enterovirus 71,EV71)分离株进行鉴定的基础上,对其诱导小鼠产生的免疫应答水平进行研究,拟为进一步的EV71候选疫苗研究奠定基础.方法 超速离心纯化病毒后,采用磷钨酸负染法通过电镜观察病毒形态、大小;采用特异性EV71单抗通过间接免疫荧光法(IFA)检测病毒的特异性;合成EV71特异性引物,通过RT-PCR对病毒进行分子生物学鉴定;病毒的VP1基因序列测定后,与其他EV71序列进行比较,绘制种系发育树,确定病毒基因型;通过腹腔注射途径免疫小鼠,免疫后分离血清通过微量细胞病变抑制法测定血清中和抗体效价,ELISA法检测血清抗体水平和抗体亚型水平.结果 电镜下可观察到典型的圆形病毒颗粒,直径为20～30 nm,呈典型的肠病毒形态;085和087株病毒感染细胞中均能观察到黄绿色荧光,提示该两株病毒可与EV71单抗特异性结合;RT-PCR可以从病毒感染细胞中扩增出226 bp大小的特异性产物带,而采用CA16特异性引物则不能扩增出相应大小的产物带;基于VP1基因序列的种系发育分析显示,087和085株均为C4基因型;085和087株EV71免疫小鼠后可诱导产生能中和包括其本身在内的多个病毒株的中和抗体,针对同一株中和病毒,实验组间差异无统计学意义;针对不同中和病毒株,各实验组中和本株、523-07T株的能力明显高于FY-02T株(P<0.05);ELISA法检测结果显示,接种灭活前后的EV71病毒085和087株后均能诱导小鼠产生抗EV71特异性IgG;IgG亚型为IgG1/IgG2a混合型,灭活病毒免疫组小鼠血清EV71特异性IgG、IgG1、IgG2a水平明显高于活病毒免疫组(P<0.05).两株病毒之间差异无统计学意义.结论 本研究分离到的085和087株病毒均为EV71 C4基因亚型,并具有一定的免疫原性.     

具有抗凝活性抗人组织因子单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备并鉴定具有抗凝血活性的抗人组织因子(h TF)单克隆抗体(m Ab)。方法以截短型重组h TF243蛋白免疫BALB/c小鼠,细胞融合后,采用间接ELISA联合血浆凝血酶原时间(PT)测定方法,筛选具有抗凝血活性的抗h TF m Ab的杂交瘤细胞株,并进行效价测定和特异性鉴定。结果成功建立1株可稳定分泌具有抗凝血活性的抗h TF m Ab的杂交瘤细胞株,该m Ab属于Ig G1亚型。间接ELISA测定腹水效价为1∶200 000,Western blot、PT测定结果表明,该m Ab可特异性结合重组h TF243,同时与SW620结肠癌细胞表面天然TF作用,显著延长血浆凝血酶原时间,具有良好的抗凝血活性。结论成功制备了具有抗凝血活性的抗h TF m Ab。     

小鼠抗登革病毒2型单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备小鼠抗登革病毒2型(TR1751株)的单克隆抗体(Monoclonal antibody mAb)，并对其性质进行鉴定。方法免疫原为病毒感染的Blabfc乳鼠脑组织，匀浆后离心，去除细胞成分。免疫Blab／c小鼠，将小鼠脾细胞和SP2／0细胞融合后，通过ELISA、间接免疫荧光染色、噬斑减少中和实验(Plaque reduction neutralization test，PRNT)及Western blot进行筛选和鉴定。结果筛选到I1、I9和B152 3株杂交瘤细胞系，其分泌的mAb均为识别登革病毒E蛋白的中和抗体。结论获得了3株分泌小鼠抗登革病毒2型mAb的杂交瘤细胞系，利用所制备的抗体，为进一步研究登革病毒致病机理和开发疫苗提供了免疫学工具。     

2008至2009年北京地区分离的肠道病毒71型全基因组序列分析

目的了解2008至2009年从北京地区手足口病（HFMD）患儿分离到的肠道病毒71型（EV71）全基因组序列特点（未包括多聚腺苷尾）,以探讨基因序列的改变是否与病毒的致病性有关。方法选取首都儿科研究所病毒研究室2008年分离到的5株EV71毒株和2009年分离到的4株EV71毒株,其中4株来源于重症HFMD患儿（伴高热、持续抽搐及意识丧失等中枢神经系统症状）,5株来源于轻症HFMD患儿。设计覆盖病毒全基因组的10对特异性引物,对9株EV71毒株进行RT-PCR扩增、全基因组序列测定和分析。结果 9株EV71毒株的全基因组长度为7406bp或7405bp,部分毒株在5′UTR存在1处1个碱基的缺失。9株EV71毒株的全基因组核苷酸和氨基酸同源性分别为96.3%～99.4%和98.2%～99.6%,在VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为96.9%～99.9%和98.3%～100.0%。重症HFMD来源的4株毒株中有3株在VP2蛋白第144位及3D聚合酶（3Dpol）第140和263位同时出现相同的氨基酸变异（T144S、R140K和I263V）,并且在5′UTR区第208和254位同时出现相同的碱基变异（G208A和A254G）。9株EV71毒株的全基因组与C4亚型毒株具有最高的核苷酸同源性,在VP1区为94.3%～95.5%;在3D及3′UTR区与CV-A16/G10的同源性（84.3%～85.0%和89.0%～91.5%）高于与EV71-B型、A型及C型（C1～3、C5）的同源性。VP1和3D基因的遗传进化分析显示,9株EV71毒株与C4亚型毒株属同一分支。结论 VP2蛋白第144位氨基酸突变（T→S）、3Dpol第140和263位氨基酸突变（R→K和I→V）及5′UTR区第254位碱基突变（A→G）可能与EV71感染后引起的不同临床症状有关。根据VP1核苷酸序列,2008至2009年北京地区流行的EV71属于C4亚型;非结构蛋白基因在EV71进化中可能有一定的作用。     

淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒GP2单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)单克隆抗体(m Ab)。方法采用杂交技术获得并筛选出杂交瘤细胞,收集含单克隆抗体的培养上清行免疫荧光(IFA)、dot-blot、ELISA法鉴定抗体重链类型和测定单克隆抗体的免疫效价。用蛋白G Sepharose亲和层析填料纯化抗体,纯化后的抗体采用SDS-PAGE检测纯化效果,并进一步用Western blot检查抗体对LCMV的作用部位。结果成功获得能稳定分泌抗LCMV的特异性杂交瘤细胞株,顺利获得纯化的单克隆抗体,命名为anti-GP2。免疫荧光、ELISA结果均证实获得的单克隆抗体能识别LCMV抗原。用ELISA法鉴定出该单克隆抗体重链类型为Ig G2b,培养液免疫效价大约为1.35×10~3。蛋白G Sepharose亲和层析填料纯化抗体后经SDS-PAGE检测证实纯化抗体成功。Western blot提示该单克隆抗体对LCMV的作用部位为病毒颗粒表面糖蛋白抗原GP2。结论成功制备出了针对LCMV病毒颗粒表面糖蛋白抗原GP2的单克隆抗体(anti-GP2 m Ab)。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3D单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备并鉴定口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3D的单克隆抗体(mAb).方法:以纯化的原核表达3D蛋白免疫BALB/c小鼠, 取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合, 杂交瘤细胞经间接ELISA法筛选, 有限稀释法克隆, 直至所克隆的细胞能够100%的分泌抗体, 用Western blot以及间接免疫荧光法对mAbs的特异性等进行鉴定.结果:免疫的BALB/c小鼠经过多次融合筛选, 共获得5株抗pET28a-3D的mAb, 其亚类鉴定3株为IgG1 , 2株为IgG2b, 初步判定所得5株mAb识别2个不同表位.Western blot显示这些mAbs与重组3D蛋白和FMDV O/China99感染的BHK-21细胞中的3D抗原均特异性结合, 免疫荧光结果显示这5株mAb能够特异结合FMDV感染细胞中的3D蛋白.结论:成功获得了能识别自然3D蛋白的特异性mAb , 为进一步研究3D蛋白的结构和功能以及诊断方法奠定基础.     

以乙肝病毒核心蛋白为载体制备肠道病毒71 型非结构蛋白3D 单克隆抗体

目的：预测肠道病毒71型（EV71）非结构蛋白3D的表位,以HBc蛋白为载体展示多肽,制备并鉴定抗EV71-3D的特异性单克隆抗体（mAb）。方法：应用生物信息学方法分析预测出EV71-3D蛋白亲水性和免疫原性指数较高的多肽片段,并运用HBc颗粒型蛋白载体展示肽段,构建多肽融合蛋白,免疫BALB/c雌鼠,通过杂交瘤技术和亲和层析技术制备和纯化抗EV71-3D蛋白的特异性mAb,用间接ELISA、ELISPOT、IFA和IHC对mAb的性质进行初步鉴定。结果：构建表达分别嵌合3D蛋白34~43位氨基酸残基、 61~76位氨基酸残基、151~164位氨基酸残基的HBc重组蛋白,免疫并经过多轮克隆化筛选,获得抗EV71-3D单克隆抗体3E1,其亚类为IgG2a;免疫荧光试验、ELISPOT法和免疫组织化学染色结果显示其可与EV71特异性结合。结论：成功制备可特异性识别EV71的单克隆抗体3E1,为病毒的检测及进一步研究3D蛋白的功能奠定了基础,同时还验证了生物信息学技术与HBc颗粒型载体展示多肽技术相结合可快速高效地制备单克隆抗体。     

S100A9蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备S100A9重组蛋白及其单克隆抗体(mAb),并对抗体进行特异性鉴定。方法以成人肝cDNA表达文库为模板,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-S100A9和pET-32a-S100A9。融合蛋白在大肠杆菌中表达,纯化后以His-S100A9作为免疫原制备鼠mAb。采用ELISA和Western blot法鉴定筛选抗体。挑取杂交瘤细胞株制备腹水并纯化,采用Western blot法和间接免疫荧光染色鉴定mAb的特异性。结果 GST-S100A9和His-S100A9融合蛋白均成功构建表达。共筛选到抗S100A9杂交瘤细胞18株,其中15株在Western blot检测中与重组蛋白呈强阳性反应,3株呈弱阳性反应。2株可识别肝癌组织间隙液中的S100A9天然蛋白。结论成功地制备出多株抗S100A9的mAb。     

抗禽流感病毒M2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗禽流感病毒M2蛋白的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定.方法:利用纯化的融合蛋白GST-M2免疫BALB/c小鼠,然后以GST-M2 和 GST分别作为ELISA抗原进行筛选,选择GST-M2抗原检测强阳性、GST抗原检测阴性的杂交瘤细胞进行克隆,建立能稳定分泌抗AIV M2 mAb的杂交瘤细胞株.mAb的效价采用间接ELISA和琼脂扩散试验(AGP)测定,用夹心ELISA测定Ig亚类,Western blot、抗原捕获ELISA、间接免疫荧光及免疫组化染色法检测 mAb 的特性.结果:得到4株分泌抗禽流感病毒M2蛋白的mAb的杂交瘤细胞株1E1、2F8、4E3 和 5D6,小鼠腹水中抗体的ELISA效价大于210×100、AGP效价大于1:4.抗体亚类鉴定1E1和4E3为IgG2a,2178和5G6为IgG2b.抗原捕获ELISA表明,2F8 wAb能与H5、H9亚型AIV发生特异性反应,而不能与鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)反应.IFA和免疫组化试验表明,2F8 mAb能够与感染了禽流感病毒的MDCK细胞以及鸡体组织细胞发生特异性结合.结论:本研究获得4株抗禽流感病毒M2蛋白的mAb,其中2F8mAb的效价高、特异性强,可作为检测AIV方法的核心试剂.     

DNA免疫法研制抗猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白中和性单克隆抗体

目的：研制抗PRRSVM蛋白的单克隆抗体（McAb），以期获得中和性单克隆抗体。方法：将PRRSVM蛋白的基因克隆入真核表达载体pcDNA3．1，利用构建成的重组真核质粒免疫BALB／c小鼠，采用杂交瘤技术制备抗PRRSVM蛋白的单抗，建立间接ELISA方法筛选阳性克隆。利用试剂盒检测Ig亚类。通过免疫印迹（Western blot）、间接免疫荧光试验（IFA）鉴定McAb的特异性。间接ELISA和病毒中和试验检测杂交瘤细胞上清McAb效价和腹水McAb效价。结果：获得3株可分泌特异性抗PRRSVM蛋白抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1A7、4G3、51：3。1A7和4G3的Ig亚类为IgM。ELISA检测杂交瘤细胞培养上清效价为1：54～1：1024，腹水效价为1：3200～1：10240。同时用Western blot、IFA检测，结果均是阳性。4G3和1AT相对亲和力不同，证明其识别不同抗原位点。1AT和4G3具有病毒中和活性，中和效价达到1：96。结论：获得2株特异性抗PRRSVM蛋白的中和性单抗，为PRRSV诊断和免疫预防研究奠定了重要基础。     

抗人LOC339524单克隆抗体的制备和应用

目的制备特异性抗人LOC339524的单克隆抗体(m Ab)并进行应用。方法将LOC339524蛋白的非糖基化抗原序列的编码基因进行三段重复表达,合成的基因克隆到质粒p ET28a上。采用大肠杆菌表达系统获得LOC339524重组蛋白,以此作为免疫原免疫BALB/c小鼠,获得m Ab。ELISA测定抗体特异性及效价。Western blot法鉴定LOC339524重组蛋白、免疫组织化学技术分别检测人心肌组织和H9C2细胞中LOC339524蛋白的表达,采用制备的抗体检测不同心脏病患者血清LOC339524水平。结果筛选出2株能稳定分泌抗人LOC339524蛋白m Ab的杂交瘤细胞株,5-D3和4-F8。其中5-D3效价高于4-F8,达2×106。Western blot法、免疫组织化学技术证明5-D3能特异性识别人和大鼠LOC339524蛋白,应用制备的抗体可成功检测不同心脏病患者血清LOC339524的水平。结论成功制备了特异性好、效价高的抗人LOC339524蛋白m Ab。     

抗人PD-L1 单克隆抗体制备及其在肿瘤病理诊断中的意义

目的:研制用于肿瘤临床诊断的高亲和力、高特异性的抗人PD-L1单克隆抗体。方法:用重组人PD-L1胞外段蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术和间接ELISA筛选,鉴定获得可稳定分泌抗人PD-L1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;通过SDS-PAGE、间接ELISA等方法鉴定其亲和力、效价、纯度及亚型;用Western blot检测肿瘤细胞(OV2008、C13等);用免疫组化(ICH)检测膀胱癌、黑色素瘤肿瘤组织芯片病理组织的PD-L1表达水平。结果:共获得4株单克隆抗体,其中Ab3亲和力高、特异性强,其效价和亲和常数分别为4. 1 ng/ml、7. 85×10~9M~(-1),与PD-L2无交叉反应,可识别肿瘤细胞中的天然PD-L1; ICH结果表明,Ab3抗体能特异性检测出膀胱癌和黑色素瘤组织中PD-L1表达水平的高、中、低。结论:获得一株可分泌高亲和力、高特异性的抗人PD-L1单抗的杂交瘤细胞株,可用于膀胱癌和黑色素瘤组织的PD-L1表达水平的检测。