柴胡皂甙D通过调控TGF-β1/Smads信号通路抑制人胚肺成纤维细胞增殖和胶原蛋白产生

目的研究柴胡皂甙D(SSD)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)增殖、转分化以及TGF-β1/果蝇抗生物皮肤生长因子蛋白家族(Smads)信号通路的影响。方法体外培养HELF,设立正常对照组、 1 ng/mL TGF-β1处理组、 1 ng/mL TGF-β1联合0.5μmol/L SSD处理组、 1 ng/mL TGF-β1联合1μmol/L SSD处理组、 1 ng/mL TGF-β1联合2μmol/L SSD处理组。采用CCK-8法检测HELF的增殖情况,荧光定量PCR法检测Smad2、 Smad3、 Smad7的mRNA水平, Western blot法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、 1型胶原蛋白(Col1)、 Smad2、 Smad3、磷酸化的Smad2(p-Smad2)、 p-Smad3、 Smad7的蛋白水平。结果与正常对照组比较, TGF-β1处理组细胞增殖明显, Col1、α-SMA蛋白水平增加, Smad2和Smad3 mRNA和蛋白磷酸化水平显著增加, Smad7 mRNA和蛋白水平显著降低;与TGF-β1处理组比较,不同浓度SSD处理组细胞增殖降低,可逆转以上各指标的改变,呈一定的量效关系。结论 SSD通过调控TGF-β1/Smads信号通路,发挥抗肺纤维化的作用。     

Smad7而非Smad6基因可抑制TGF-β诱导肾小管上皮-间充质转分化

目的:观察Smad6和Smad7基因能否抑制TGF-β诱导肾小管上皮-间充质转分化.方法:构建产生表达Smad6和Smad7基因的无辅毒腺相关病毒载体, 再将病毒颗粒分别转染入人肾小管上皮细胞(HKC), 细胞随机分为正常对照、 TGF-β1组、 Smad7 组、 LacZ组、 TGF-β1 Smad7或Smad6组、 TGF-β1 LacZ组.10 μg/L TGF-β1添加入培养液孵育15、 30、 60、 120 min和3 d.Western blot测定TGF-β1和Smad6或Smad7基因转染对细胞p-Smad2、 E-cadherin、α-smooth muscle actin(α-SMA)表达的影响, ELISA法测定培养上清羟脯氨酸的含量的变化, 倒置显微镜观察细胞形态变化.结果:与未加TGF-β1细胞相比, 添加TGF-β1后15、 30、 60、 120 min胞内Smad2磷酸化水平明显增加, 30 min时表现最大.10 μg/L TGF-β1与HKC孵育72 h后, 细胞α-SMA和羟脯氨酸量合成增加, E-cadherin表达减少;细胞形态变长, 呈纺锤状细胞, 失去鹅卵石样的形状.Smad7基因转染可抑制TGF-β1诱导Smad2磷酸化, 抑制细胞α-SMA和羟脯氨酸合成, 增加E-cadherin表达, 维持培养细胞的上皮样形态, 相反, Smad6没有这样的作用.结论:Smad7而不是Smad6基因转染能抑制TGF-β1诱导肾小管上皮-间充质转分化, 这些作用可能与Smad7阻断Smad2磷酸化有关.     

BMP-7/Smads通路参与EndoMT在大鼠HHPH中的作用

目的:探讨骨形态发生蛋白(BMP)-7/Smads通路参与的内皮-间充质转化(EndoMT)在大鼠低氧高二氧化碳性肺动脉高压(HHPH)中的作用。方法:将大鼠肺动脉内皮细胞(RPAECs)分为常氧对照(Con)组、低氧高二氧化碳(HH)组、BMP受体激动剂rhBMP-7组、BMP受体抑制剂DMH-1组和溶剂DMSO组。各组给予相应的药物后,Con组置于常氧培养箱中培养,其余4组置于低氧高二氧化碳培养箱中培养。采用免疫荧光标记法观察细胞CD31和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平;RT-PCR和Western blot法分别检测各组细胞α-SMA、CD31和Smad1/5/8的mRNA和蛋白表达水平;CCK-8法检测细胞活力;Transwell小室法检测细胞的迁移水平。结果:与Con组相比,HH组α-SMA的mRNA和蛋白表达水平升高,而CD31的mRNA和蛋白表达水平、Smad1/5/8的mRNA和p-Smad1/5/8的蛋白表达水平降低,同时细胞活力降低而迁移增多(P<0.05)。与HH组相比,rhBMP-7组α-SMA的mRNA和蛋白表达水平降低,而CD31的mRNA和蛋白表达水平、Smad1/5/8的mRNA和p-Smad1/5/8的蛋白表达水平升高,同时细胞活力升高而迁移减少(P<0.05)。与rhBMP-7组相比,DMH-1组α-SMA的mRNA和蛋白表达水平升高,而CD31的mRNA和蛋白表达水平及Smad1/5/8的mRNA和p-Smad1/5/8的蛋白表达水平降低,同时细胞活力降低而迁移增多(P<0.05)。结论:低氧高二氧化碳可促进RPAECs发生EndoMT,从而促进HHPH的发展,其机制可能与抑制BMP-7/Smads通路有关。     

TGF-β/Smads通路参与EndoMT在HHPH中的作用及益气温阳活血化痰方的干预效应

目的:探讨转化生长因子β(TGF-β)/Smads信号通路与低氧高二氧化碳性肺动脉高压(HHPH)中肺动脉内皮-间充质转化(Endo MT)的关系及益气温阳活血化痰方的调控作用。方法:取健康雄性清洁级SD大鼠为研究对象,随机分为5组:常氧对照(N)组、低氧高二氧化碳(HH)组及益气温阳活血化痰方高剂量(YH)组、中剂量(YM)组和低剂量(YL)组。N组置于常氧环境下饲养,其余4组置于低氧高二氧化碳(9%~11%O2和5%~6%CO2)环境下饲养4周。各中药组在放入氧舱前以相同体积不同浓度的益气温阳活血化痰方灌胃,YH、YM和YL组浓度分别为200 g/L、100 g/L和50 g/L。术中测平均肺动脉压和平均颈动脉压,术毕取右心室游离壁及左心室加心室间隔称重,以此计算右心室肥大指数。HE染色和免疫荧光法观察肺组织形态学的变化,采用RT-PCR和Western blot检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、CD31、TGF-β1和Smad2/3的m RNA和蛋白表达以及p-Smad2/3的蛋白水平。结果:与N组比,其余4组肺动脉平均压、α-SMA、TGF-β1和Smad2/3的m RNA和蛋白表达以及pSmad2/3的蛋白水平上升,CD31 m RNA和蛋白表达水平降低,镜下观察到组织形态学损伤;与HH组比,YH、YM和YL组肺动脉平均压、α-SMA、TGF-β1和Smad2/3的m RNA和蛋白表达以及p-Smad2/3的蛋白水平下降,CD31m RNA和蛋白表达水平上升,肺组织形态学的损伤显著减轻。结论:在HHPH中,TGF-β/Smads通路可能参与了Endo MT;益气温阳活血化痰方可通过抑制TGF-β/Smads通路的表达降低肺动脉高压。     

肾上腺髓质素通过Smad2/3信号途径抑制TGF-β1刺激的肺成纤维细胞前胶原蛋白的合成

目的观察肾上腺髓质素(AM)对转化生长因子β1(TGF-β1)促进肺成纤维细胞1型前胶原蛋白α1(Col1α1)、3型前胶原蛋白α1(Col3α1)基因表达及Smad2/3通路的影响,探讨AM对TGF-β1促肺成纤维细胞胶原合成作用的机制。方法体外原代培养人胚肺成纤维细胞(HFLF),利用反转录PCR(RT-PCR)观察AM及TGF-β1对HFLF的Col1α1、Col3α1 mRNA表达的影响;Western blot法观察AM及TGF-β1对HFLF磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)蛋白表达的影响。结果 TGF-β1可以刺激HFLF的Col1α1、Col3α1 mRNA和p-Smad2/3蛋白表达,AM则可抑制基础条件下TGF-β1促进的Col3α1 mRNA表达,同时也抑制Smad2/3蛋白的表达。结论 AM可能通过Smad2/3信号转导途径,抑制TGF-β1促进的HFLF前胶原蛋白的合成作用。     

小檗碱对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化及TGF-β/Smad通路的影响

目的研究小檗碱(BBr)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞(NRK-52E)转分化(EMT)及TGF-β/Smad通路的影响。方法常规培养肾小管上皮细胞、传代、分组:1正常对照组;2TGF-β1组(10ng/ml TGF-β1作用48h);3小檗碱作用组(30μM小檗碱作用24h后加10ng/ml TGF-β1作用48h)。采用相差显微镜观察各组细胞表型改变,免疫荧光及Western Blot方法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、上皮钙黏素(E-cadherin)、Smad2、Smad3、磷酸化的Smad2、3(P-Smad2、3)蛋白表达;应用流式细胞术,采用活性氧自由基(ROS)检测试剂盒检测各组别的ROS蛋白表达情况。结果 TGF-β1处理可导致NRK-52E细胞的α-SMA蛋白表达明显升高,E-cadherin蛋白表达降低。而小檗碱处理能够减少肾小管上皮细胞α-SMA的高表达,提高E-cadherin蛋白的表达;同时,小檗碱可有效降低由TGF-β1引起的NRK-52E细胞中ROS的过多产生。此外,小檗碱可有效抑制Smad2/3的活化。结论小檗碱可逆转TGF-β1所致的肾小管上皮细胞的EMT,其作用机制可能是通过抑制氧化应激及TGF-β/Smad信号通路而发挥作用。     

环状RNA-42398通过调控TGF-β1/Smads信号通路抑制肝星状细胞活化

目的:探讨小鼠环状RNA-42398(mmucirc42398)对肝星状细胞活化的影响及机制是否与调节TGF-β1/Smads信号通路有关。方法:小鼠肝星状细胞株JS1,分成正常对照组、空载体阴性对照组(vector组)和mmucirc42398过表达组(mmucirc42398组),体外构建mmucirc42398过表达载体,通过脂质体瞬时转染法转入JS1细胞,48 h后RT-qPCR检测mmucirc42398的表达变化,PCR产物经一代测序验证其环化位点,Western blot检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原(Col I)、转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad2、Smad3、p-Smad2和p-Smad3蛋白表达。结果:与vector组相比,mmucirc42398组的mmucirc42398表达增加(P<0.01),PCR产物测序验证了其环化位点,提示mmucirc42398过表达质粒成功转入JS1细胞并高效表达;在JS1细胞中过表达mmucirc42398后,α-SMA和Col I蛋白表达显著降低(P<0.01),TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表达无显著变化(P>0.05),但p-Smad2和p-Smad3蛋白水平显著降低(P<0.01)。结论:mmucirc42398能抑制肝星状细胞的活化,其机制与调控TGF-β1/smads信号通路有关。     

脂多糖刺激巨噬细胞获得的外泌体促进TGF-β1诱导的人A549细胞上皮间质转化

目的探索炎性环境下巨噬细胞来源外泌体对转化生长因子β1 (TGF-β1)诱导的肺脏上皮间质转化(EMT)的影响。方法采用透射电镜鉴定外泌体形态, Western blot法检测外泌体特异性标志物肿瘤易感基因101(TSG101)、附属蛋白质凋亡关联基因α相互作用蛋白X(ALIX)、 CD81、 CD9蛋白及外泌体不含有的钙连蛋白(calnexin)对THP-1巨噬细胞来源的外泌体进行鉴定。利用TGF-β1诱导肺泡上皮A549细胞发生EMT,比较脂多糖(LPS)刺激和未刺激THP-1细胞来源外泌体对A549细胞间质化特征的影响。结果成功建立TGF-β1诱导A549细胞发生EMT模型和获得THP-1巨噬细胞来源的外泌体。与未经LPS处理巨噬细胞来源外泌体比较, LPS刺激THP-1细胞来源的外泌体能显著促进TGF-β1诱导A549细胞EMT,包括显著下调上皮钙黏蛋白(E-cadherin)表达水平,上调波形蛋白(vimentin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、TGF-β1/SMAD家族成员2/3(Smad2/3)通路Smad2/3蛋白和磷酸化的Smad2/3(p-Smad2/3)和1型胶原蛋白(Col1)等细胞间质化相关的信号蛋白表达。结论 LPS刺激巨噬细胞来源的外泌体通过激活TGF-β/Smad2/3信号,上调A549细胞中vimentin、α-SMA和Col1等细胞间质化相关蛋白的表达,促进A549细胞发生EMT。     

慢病毒载体CV072介导的Mfn2过表达抑制肝星状细胞活化

目的:构建携带线粒体融合蛋白2(Mfn2)基因的慢病毒载体,并探讨Mfn2过表达对大鼠肝星状细胞活化的抑制作用及其减少肝纤维化相关因子生成的机制。方法:构建含Mfn2的慢病毒过表达载体CV072-pCMV-Mfn2-EGFP,转染肝星状细胞;荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达及转染效率;RT-qPCR和Western blot法检测转染后细胞中Mfn2的mRNA和蛋白表达水平;Western blot检测Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、α-SMA、TGF-β1、Smad2和Smad3的水平;ELISA检测Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原蛋白水平。结果:与各对照组相比,慢病毒过表达载体CV072-pCMV-Mfn2-EGFP转染后,细胞促凋亡蛋白表达增多,TGF-β1/Smad通路蛋白TGF-β1、p-Smad和p-Smad3的蛋白水平均降低,纤维化相关蛋白α-SMA、I型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白和IV型胶原蛋白的水平降低(P0.01)。结论:转染慢病毒过表达载体CV072-pCMV-Mfn2-EGFP在体外可有效抑制肝星状细胞活化,并可能通过抑制TGF-β1/Smad通路减少肝纤维化相关因子的生成。     

sTβRⅡ拮抗新生大鼠心肌成纤维细胞内TGF-β1诱导的Smad信号和肌成纤维细胞分化

目的研究可溶性转化生长因子-β1Ⅱ型受体(sTβRⅡ)对新生大鼠心肌成纤维细胞内TGF-β1诱导的Smad信号和肌成纤维细胞分化的抑制效应。方法培养新生大鼠的心肌成纤维细胞,随机分为4组:PBS对照组、TGF-β1(5ng/ml)组、sTβRⅡ(50ng/ml)组和TGF-β1+sTβRⅡ组。30min、1h和2h后,免疫细胞化学染色检测P-Smad2和Smad3的表达;24h后,免疫细胞化学染色检测α-SMA的表达。结果与PBS对照组相比,TGF-β1组P-Smad2、Smad3(核阳性率)和α-SMA的表达显著性升高(P0.05);与TGF-β1组相比,TGF-β1+sTβRⅡ组P-Smad2、Smad3(核阳性率)和α-SMA的表达明显降低(P0.05)。结论sTβRⅡ可拮抗新生大鼠心肌成纤维细胞内TGF-β1诱导的Smad2/Smad3蛋白的磷酸化与核转位,阻断Smad信号转导通路,抑制肌成纤维细胞分化。     

c-SKI对冠脉内皮细胞增殖及内皮-间充质转化的影响

目的:探讨核蛋白c-SKI对冠状动脉内皮细胞增殖能力及内皮-间充质转化的影响。方法:使用不同浓度的转化生长因子β1(TGF-β1)作用人冠脉内皮细胞不同时点,Western blot法检测各组细胞中c-SKI、间充质细胞标志物波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及内皮细胞标志物E-钙黏蛋白的表达。使用携带c-ski基因的慢病毒转染冠脉内皮细胞后采用RT-qPCR验证转染效率。将细胞分为4组:对照组、TGF-β1(5μg/L)组、c-ski基因感染+TGF-β1组及对照病毒感染+TGF-β1组。过表达c-SKI后,MTT实验和集落形成实验检测冠脉内皮细胞的增殖能力,Western blot检测波形蛋白、α-SMA、E-钙黏蛋白、Smad2、Smad3、p-Smad2和p-Smad3蛋白的水平。结果:TGF-β1处理冠脉内皮细胞后,c-SKI在冠脉内皮细胞中的表达呈剂量和时间依赖性下降(P0.01)。MTT及集落形成实验结果显示,过表达c-SKI可显著抑制冠脉内皮细胞增殖(P0.01)。Western blot检测结果显示,与病毒对照组相比,过表达c-SKI可显著下调冠脉内皮细胞中α-SMA和波形蛋白的表达量(P0.01),上调E-钙黏蛋白的表达量(P0.01),同时抑制Smad2和Smad3蛋白的磷酸化(P0.01),逆转TGF-β1诱导的内皮-间充质转化。结论:内皮-间充质转化过程中c-SKI表达下调,而过表达c-SKI能够抑制冠脉内皮细胞增殖及内皮-间充质转化,其机制可能与调控TGF-β1/Smad信号通路活性有关。     

抗IGFBPrP1抗体对小鼠肝纤维化的预防作用及其机制的研究

目的: 明确抗胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBPrP1)抗体能否预防硫代乙酰胺(TAA)诱导的小鼠肝纤维化的形成,同时探讨其机制。方法: 将24只雄性C57BL/6野生型小鼠随机分为正常对照组、TAA 4周组和TAA+抗IGFBPrP1抗体4周组,每组8只,观察肝组织形态学改变,免疫组织化学染色和Western blotting检测肝组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β₁(TGF-β₁)、Smad3、磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)、纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ、Ⅲ型胶原(collagen Ⅰ、Ⅲ)及IGFBPrP1的表达。结果: TAA 4周组肝损伤严重,α-SMA、TGF-β₁、Smad3、p-Smad2/3、FN、collagen Ⅰ、Ⅲ及IGFBPrP1的表达明显高于正常对照组(P＜0.01),TAA+抗IGFBPrP1抗体4周组肝损伤减轻,上述各指标表达均低于TAA 4周组(P＜0.01)。IGFBPrP1与TGF-β₁、Smad3、p-Smad2/3 、FN及collagen Ⅰ的表达呈正相关(P＜0.01)。结论: 抗IGFBPrP1抗体可预防TAA诱导的小鼠肝纤维化的形成,其机制为抑制肝星状细胞的活化和减少细胞核内p-Smad2/3的表达、抑制TGF-β₁/Smad3信号通路,进而导致细胞外基质在肝组织中沉积减少。     

特发性肺间质纤维化中miRNA-29b的抗纤维化作用

目的对特发性肺间质纤维化(IPF)中机体miRNA-29b的抗纤维化作用进行研究,为临床针对性治疗干预提供重要依据。方法以我院体外实验室培养的人胚肺成纤维细胞(IMR-90)为研究对象,随机分成空白组、转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导组及miRNA-29b转染组,观察3组细胞形态,并测定各组细胞内的minRNA-29b、信号传导蛋白Smad3、p-Smad3、E-钙黏蛋白(E-cad)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及靶基因I型胶原蛋白(COL1A1)的表达情况。结果通过测定,相比空白组,TGF-β1诱导组的E-cad、miRNA-29b表达水平明显降低(P0.05),而α-SMA、p-Smad3及COL1A1的表达水平显著增高(P0.05);和TGF-β1诱导组相比,miRNA-29b转染组的miRNA-29b、E-cad表达水平显著增高(P0.01),p-Smad3、α-SMA及COL1A1表达水平降低(P0.05)。结论miRNA-29b表达提高能抑制TGF-β信号通路介导达到抗肺间质纤维化。     

1,25（OH）2D3对甲状旁腺素诱导的肾小管上皮细胞转分化和TGF-β1的表达的影响

目的:探讨1,25(OH)2D3对甲状旁腺素(PTH)诱导的肾小管上皮细胞转分化和转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响。方法:人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)培养在含50 mL/L FCS的DMEM/F12培养液中。对照组:加入等体积含50 mL/L FCS的DMEM/F12培养液;PTH刺激组:加入终浓度为10-10 mol/L PTH的含50 mL/L FCS的DMEM/F12培养液;PTH+1,25(OH)2D3干预组:加入10-10 mol/L PTH,同时加入不同浓度(10-10、10-9、10-8、10-7 mol/L)的1,25(OH)2D3。刺激HK-2细胞48 h。半定量RT-PCR法检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和TGF-β1的基因表达;Western blot法检测细胞中α-SMA和TGF-β1的蛋白表达;免疫细胞化学法检测细胞中α-SMA的表达;ELISA法检测细胞培养上清液中TGF-β1的含量。结果:半定量RT-PCR结果显示,对照组HK-2细胞中几乎无α-SMA的mRNA表达,仅有少量的TGF-β1 mRNA表达;PTH刺激组α-SMA和TGF-β1mRNA表达量与对照组比较明显增加;PTH+1,25(OH)2D3干预组表达量比PTH刺激组显著降低,且随着1,25(OH)2D3浓度的升高呈一定的剂量依赖性(P<0.05)。Western blot结果显示,对照组HK-2细胞中无α-SMA的蛋白表达,仅有少量的TGF-β1蛋白表达;10-10 mol/L的PTH能够明显诱导HK-2细胞中α-SMA的蛋白表达,增加TGF-β1的蛋白表达量;PTH+1,25(OH)2D3干预组,α-SMA和TGF-β1的蛋白表达量比PTH刺激组显著降低(P<0.05)。免疫细胞化学法结果显示,对照组几乎无α-SMA阳性表达的细胞,PTH刺激组可见大量细胞α-SMA表达阳性;PTH+1,25(OH)2D3干预组α-SMA表达阳性的细胞数明显低于PTH刺激组(P<0.05)。ELISA结果显示,对照组细胞上清液中可检测到少量的TGF-β1,PTH刺激组含量显著升高,PTH+1,25(OH)2D3干预组与PTH刺激组比较含量明显降低(P<0.05)。结论:1,25(OH)2D3能够部分拮抗PTH诱导的HK-2细胞转分化和TGF-β1的表达。     

沙利度胺抑制TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞系转分化为肌成纤维细胞

目的 研究沙利度胺(THD)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人胚肺成纤维细胞(HFL-F)向肌成纤维细胞(MF)转分化和对已分化MF的作用。方法 体外培养HFL-F,以TGF-β1(5μg/L)诱导HFL-F向MF转分化,通过碱水解法测定羟脯氨酸含量(Hyp),免疫印迹法测定α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,半定量RT-PCR测定α-SMA mRNA和Ⅲ型胶原(COL Ⅲ)mRNA,观察THD(50μg/L)对HFL-F向MF转分化的过程及已分化MF的影响。结果 TGF-β1诱导HFL-F 96h,诱导分化同时加入THD可抑制Hyp含量增高和COL Ⅲ mRNA表达上调(p均<0.05),可抑制α-SMA蛋白表达增加,但对于α-SMA mRNA表达没有影响。TGF-β1诱导HFL-F 96h后再加入THD可抑制COL Ⅲ mRNA的表达(p<0.05),但对Hyp含量、α-SMA蛋白表达量和α-SMA mRNA表达无明显影响。结论 TGF-β1可诱导HFL-F向MF转分化,THD可抑制这一过程中α-SMA蛋白与胶原合成。对TGF-β1诱导下已分化的MF,THD可抑制其COL Ⅲ mRNA的表达。     

hsa-Let-7a-5p靶向结合TGF-βR1抑制局限性硬皮病成纤维细胞纤维化

目的 探讨hsa-Let-7a-5p对局限性硬皮病成纤维细胞(LSFs)纤维化过程的影响及其与转化生长因子-β受体(TGF-βR)和TGF-β/Smad信号通路的关系。方法 将携带hsa-Let-7a-5p和shTGF-βR1的慢病毒载体及空白慢病毒载体感染LSFs。CCK-8法和划痕实验检测各组LSFs的增殖和迁移情况。RT-qPCR、免疫荧光和Western blot检测转染的效率以及各组LSFs的Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA、TGF-βR1、TGF-β、p-Smad2/3的mRNA和蛋白表达水平。结果 病毒感染LSFs后,shTGF-βR1组的TGF-βR1表达量明显低于对照组(P<0.05);shTGF-βR1组的细胞增殖率、迁移能力均有所降低;shTGF-βR1组的Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA、TGF-β、p-Smad2/3的mRNA和蛋白表达水平均明显低于对照组(P<0.05)。生物信息学分析表明hsa-Let-7a-5p可以与TGF-βR1 3′-UTR的靶区位置配对,hsa-Let-7a-5p慢病毒转染组的hsa-Let-7a-5p表达量明显高于对照组(P<0...     

MG132抑制TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞活化

目的探讨泛素-蛋白酶体抑制剂MG132对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肺成纤维细胞活化的影响及机制。方法体外培养人胚肺成纤维细胞(MRC-5),随机分为对照组、TGF-β1组(10μg/L)和MG132(0.5μmol/L)处理组。Western blot法检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原α1(COL1A1)的表达;RT-PCR和Western blot法分别检测细胞Smad7、核转录共抑制因子SnoN、TGF-βI型受体(TβRI)、Smad2和Smad3 mRNA及蛋白的表达。结果与对照组比较,TGF-β1促进了α-SMA和COL1A1蛋白表达(P0.05),MG132抑制了TGF-β1的上述作用(P0.05)。TGF-β1组Smad7和SnoN mRNA表达较对照组增加(P0.05)。TGF-β1组Smad7和SnoN蛋白表达较对照组减少(P0.05),而MG132组Smad7和SnoN蛋白水平较TGF-β1组增加(P0.05)。结论 MG132可能通过阻止Smad7和SnoN蛋白泛素化降解,抑制TGF-β1诱导人肺成纤维细胞活化。     

丹参素对肝星状细胞TGF-β信号转导的影响

目的： 观察丹参素对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导活化的大鼠肝星状细胞(HSCs)Smad信号转导通路的影响。方法：体外分离、培养大鼠肝HSCs,用不同浓度丹参素作用于HSCs,检测丹参素对HSCs增殖和TGF-β1刺激后HSCs增殖的影响;观察丹参素对TGF-β1刺激HSCs表达α-SMA的影响;观察HSCs转化生长因子受体(TβRⅠ、Ⅱ)的表达;观察丹参素和TGF-β1作用HSCs后,其Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表达的变化。结果：(1)丹参素在0.0625 mmol/L-1 mmol/L时,对HSCs的生长增殖具有抑制作用 (P<0.05);丹参素对TGF-β1诱导的HSCs增殖也具有明显的抑制作用 (P<0.05)。(2)丹参素0.25 mmol/ L作用HSCs能下调α-SMA的表达(P<0.05),也能下调TGF-β1诱导的HSCs的α-SMA表达(P<0.05)。（3）HSCs中TβRⅠ、Ⅱ的表达定位于细胞膜上,丹参素能下调活化HSCs中TβRⅠ、Ⅱ的表达（P<0.05或P<0.01）。 (4) TGF-β1促进HSCs中Smad2、Smad3、Smad7 mRNA的表达（P<0.01）;丹参素能下调TGF-β1诱导的HSCs内Smad2、Smad3 mRNA的表达(P<0.05),并能上调Smad7 mRNA表达(P<0.05)。 结论：体外细胞实验表明,丹参素能通过下调活化HSCs细胞膜上TβRⅠ、Ⅱ蛋白的表达来抑制HSCs的活化增殖。丹参素能上调HSCs内Smad7 mRNA表达,并下调Smad2、Smad3 mRNA表达,抑制HSCs活化,并抑制TGF-β1诱导的HSCs活化。     

骨髓间充质干细胞抑制转化生长因子-β1诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞间质化

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)是否通过抑制肺泡Ⅱ型上皮细胞向肌成纤维细胞的转化,进而发挥其抗纤维化的作用及其机制。方法培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-6TN细胞,用5μg/L的TGF-β1诱导分化,并分为对照组、转化生长因子(TGF)-β1刺激组、BMSCs干预组。采用倒置相差显微镜观察RLE-6TN细胞的形态变化;免疫荧光法检测E-钙黏蛋白(E-cad)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的定位;Western blotting法检测E-cad、α-SMA、p-Smad3、Snail1蛋白的表达。结果在TGF-β1的诱导下,肺泡Ⅱ型上皮细胞逐渐向肌成纤维细胞发生形态改变,由上皮细胞的鹅卵石状变成间充质细胞的梭形或纺锤形,且伴随着上皮标志物E-cad表达降低,而间充质细胞标志物α-SMA表达上调;给予BMSCs干预后,间充质化有所抑制,表现于细胞形态趋于上皮型,且上皮标志物E-cad表达上调,间质标志物α-SMA表达减少。与对照组相比,TGF-β1刺激组p-Smad3、Snail1蛋白表达上调。给予BMSCs干预后p-Smad3、Snail1蛋白表达显著降低。结论 BMSCs可能通过阻断TGF-β1/Smad3信号转导通路,抑制肺泡Ⅱ型上皮细胞向肌成纤维细胞的转化,从而抑制上皮细胞-间充质转化的进程。     

TAK1通过调控p38 MAPK信号通路影响肾小管上皮细胞纤维化

目的:探讨转化生长因子β激活激酶1(TAK1)对肾小管上皮细胞纤维化的影响及机制。方法:以肾小管上皮细胞HK-2作为研究对象,用转化生长因子β1(TGF-β1)诱导肾小管上皮细胞纤维化,以real-time PCR和Western blot检测细胞中TAK1表达的变化。用TAK1 shRNA慢病毒感染肾小管上皮细胞,以real-time PCR和Western blot检测其对TGF-β1刺激下肾小管上皮细胞中TAK1表达的影响以检测干扰效果。ELISA法检测细胞分泌的I型胶原和III型胶原水平,Western blot法检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、结缔组织生长因子(CTGF)和磷酸化的p38 MAPK(p-p38 MAPK~(Thr 180/Tyr 182))的蛋白水平。用p38 MAPK激活剂处理已敲减TAK1表达的肾小管上皮细胞,检测其对细胞分泌I型胶原和III型胶原的影响及对细胞中α-SMA、CTGF和p-p38 MAPK~(Thr 180/Tyr 182)蛋白水平的影响。结果:TGF-β1可以明显上调肾小管上皮细胞中TAK1的表达水平。TAK1 shRNA可明显下调TGF-β1刺激下的肾小管上皮细胞中TAK1的表达水平。TGF-β1处理后的肾小管上皮细胞分泌I型胶原和III型胶原增多,细胞中α-SMA、CTGF和p-p38 MAPK~(Thr 180/Tyr 182)蛋白水平升高。敲减TAK1表达可以明显抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞分泌I型胶原和III型胶原,减少细胞中α-SMA、CTGF和p-p38 MAPK~(Thr 180/Tyr 182)的蛋白水平(P0.05)。p38 MAPK激活剂处理可以逆转敲减TAK1表达对肾小管上皮细胞分泌I型胶原和III型胶原及α-SMA、CTGF和p-p38 MAPK~(Thr 180/Tyr 182)蛋白水平的抑制作用。结论:敲减TAK1表达能够通过抑制p38 MAPK信号通路而降低TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化水平。