过表达Sprouty2分子促进HEK293T细胞增殖与存活

目的构建表达人Sprouty 2(SPRY2)基因的重组表达载体pDC315/hSPRY2,转染人胚肾(HEK)293T细胞表达目的蛋白,初步探讨其对HEK293T细胞增殖与存活的影响。方法构建hSPRY2重组腺病毒表达载体,体外转染HEK293T细胞,以Western blot法检测目的蛋白的表达,以CCK-8法检测SPRY2对HEK293T细胞增殖或去血清条件下细胞存活的影响。结果成功构建重组表达载体pDC315/hSPRY2,在转染的HEK293T细胞中检测到目的蛋白hSPRY2的表达,转染pDC315/hSPRY2组HEK293T细胞的增殖率及存活率均明显高于对照组即转染pDC315/EGFP组(P0.05)。结论成功构建了hSPRY2重组表达载体,过表达hSPRY2可促进HEK293T细胞的增殖与存活。     

程序性死亡蛋白1(PD-1)在转染的HEK293T细胞的表达和鉴定

目的优化HEK293T细胞转染条件,比较程序性死亡蛋白1(PD-1)在不同真核载体的表达水平以高效获取目标蛋白。方法设计L9(33)正交试验,对细胞转染条件进行优化;扩增人PD-1胞外段基因,构建PD-1重组蛋白表达载体,瞬时转染HEK293T细胞,通过ELISA、Western blot对pCMV3、pcDNA3. 1和pMH3三种真核表达载体的蛋白表达水平进行比较。结果PD-1胞外段蛋白编码序列成功构建到pc DNA3. 1和pMH3真核表达载体上,目的蛋白成功表达。在最佳转染条件下,PD-1重组蛋白在pMH3中的表达量最高,其次为pCMV3、pcDNA3. 1的表达量最低。结论人PD-1胞外段蛋白在pMH3-PD1真核载体转染的HEK293T细胞中表达量最高。     

单核细胞趋化蛋白1与神经干细胞的体外迁移

背景：研究表明趋化因子基质细胞衍生因子1及血管内皮生长因子参与神经干细胞的迁移。 目的：观察趋化因子单核细胞趋化蛋白1及其受体CCR2对神经干细胞体外迁移的作用。 方法：分离培养胎鼠海马组织神经干细胞,体外传代扩增及鉴定;通过细胞免疫荧光及RT-PCR检测其受体CCR2表达情况;通过琼脂糖下细胞迁移实验观察50,100,200,300,500 μg/L 单核细胞趋化蛋白1对神经干细胞的体外趋化作用。 结果与结论：细胞免疫荧光及RT-PCR检测证实胎鼠海马来源神经干细胞表达趋化因子受体CCR2;琼脂糖下细胞迁移实验显示,体外条件下单核细胞趋化蛋白1可趋化神经干细胞迁移,且趋化迁移作用随质量浓度增加而增强,抗CCR2多克隆抗体可对抗其趋化迁移作用。     

可溶性CD20在HEK293T细胞中的高效表达

目的构建CD20真核表达载体,在HEK293T细胞中高效表达CD20蛋白。方法以人外周血单个核细胞(PBMC总RNA为模板,反转录PCR扩增得到CD20基因,并插入真核表达载体p CMV3-C-His,PCR初步验证后,再测序验证。将重组质粒瞬时转染HEK293T细胞进行蛋白表达,ELISA、Western blot法检测CD20蛋白表达,优化表达条件。结果 PCR与测序均显示成功插入CD20基因。转染HEK293T细胞72 h后,Western blot法检测到细胞内和细胞培养上清液中的CD20蛋白。HEK293T细胞传代次数与细胞培养上清液中CD20表达量相关。结论成功构建CD20真核表达载体,高效表达CD20可溶性蛋白。     

单核细胞趋化蛋白－1在大肠杆菌中的表达

将人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的ｃＤＮＡ插入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１中，构建成质粒ｐＧＥＸ／ＭＣＰ转化大肠杆菌ＪＭ１０９，经ＩＰＴＧ诱导后合成ＧＳＴ－ＭＣＰ－１融合蛋白。用１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测在３０ｋＤ左右有新生蛋白条带出现，表达量约占菌体总蛋白的３１．７％。趋化实验证明，该产物具备明确的单核细胞趋化活性。     

单核细胞趋化蛋白—1在大肠杆菌中的表达

将人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的ｃＤＮＡ插入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１中，构建成质粒ｐＧＥＸ／ＭＣＰ转化大肠杆菌ＪＭ１０９，经ＩＰＴＧ诱导后合成ＧＳＴ－ＭＣＰ－１融合蛋白。用１２％ＳＣＳ－ＰＡＧＥ检测在３０ｋＤ左右有新生蛋白条带出现，表达量约占菌体总蛋白的３１．７％，趋化实验证明，该产物具备明确的单核细胞趋化活性。     

探讨肺纤维化时表达单核细胞趋化蛋白-1的主要效应细胞

目的研究凝血酶对人肺上皮细胞及正常人肺成纤维细胞释放单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的调节作用。方法人肺支气管上皮细胞（normal human bronchial epithelial cells,NHBE）、人肺癌上皮细胞系A549及正常人肺成纤维细胞（normal human lung fibroblasts,NH-LF）分别培养于96孔或6孔板培养板内,凝血酶诱导4h和24h后,收集上清液及细胞裂解液。ELISA方法检测MCP-1蛋白水平;实时荧光定量RT-PCR技术检测MCP-1mRNA水平。结果凝血酶可诱导NHBE、A549及NH-LF细胞释放MCP-1,但NH-LF细胞的MCP-1释放量远远高于NHBE及A549细胞;凝血酶还可诱导NH-LF细胞mRNA表达。结论人肺成纤维细胞可能是肺内表达MCP-1的主要来源细胞,因此在肺纤维化时可能起重要作用。     

过表达Sprouty2分子促进HEK293T细胞增殖与存活北大核心CSCD

目的构建表达人Sprouty 2(SPRY2)基因的重组表达载体pDC315/hSPRY2,转染人胚肾(HEK)293T细胞表达目的蛋白,初步探讨其对HEK293T细胞增殖与存活的影响。方法构建hSPRY2重组腺病毒表达载体,体外转染HEK293T细胞,以Western blot法检测目的蛋白的表达,以CCK-8法检测SPRY2对HEK293T细胞增殖或去血清条件下细胞存活的影响。结果成功构建重组表达载体pDC315/hSPRY2,在转染的HEK293T细胞中检测到目的蛋白hSPRY2的表达,转染pDC315/hSPRY2组HEK293T细胞的增殖率及存活率均明显高于对照组即转染pDC315/EGFP组(P<0.05)。结论成功构建了hSPRY2重组表达载体,过表达hSPRY2可促进HEK293T细胞的增殖与存活。     

结核分枝杆菌脂蛋白G在HEK293T细胞中的表达及纯化

目的构建含结核分枝杆菌(MTB)脂蛋白G(Lpr G)基因的真核表达载体pc DNA3.1-His-Lpr G-FLAG,并在HEK293T细胞中表达和纯化Lpr G融合蛋白。方法以MTB H37Rv基因组DNA为模板,用PCR法扩增Lpr G基因,并通过DNA重组构建真核表达载体pc DNA3.1-His-Lpr G-FLAG,酶切鉴定并测序。将重组质粒转染HEK293T细胞后,应用Western blot法检测His-Lpr G-FLAG融合蛋白的表达。利用Ni-NTA金属亲和层析柱从细胞上清和细胞裂解液中纯化融合蛋白His-Lpr G-FLAG,并用SDS-PAGE和Western blot法检测纯化后的蛋白。结果成功构建了pc DNA3.1-His-Lpr G-FLAG的真核表达载体,Western blot结果表明转染质粒后,HEK293T细胞裂解液中检测到目的蛋白,相对分子量(Mr)为27 000。经Ni-NTA金属亲和层析柱纯化后得到高纯度的融合蛋白His-Lpr G-FLAG。结论成功构建并在HEK293T细胞中表达和纯化了His-Lpr G-FLAG融合蛋白。     

单核细胞趋化蛋白-1在CNS疾病中的表达

中枢神经系统(CNS)并非免疫豁免区是最近几年来神经免疫学研究的进展之一,在用细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱发的炎症反应中,CNS脑实质内的小胶质细胞、脑室周围、脉络膜、室管膜细胞均可检测到受体TLR2、TLR4(Toll—like recep—     

酪氨酸酶基因在HEK293细胞表达的MRI评价

目的:以酪氨酸酶基因作为报告基因转染HEK293细胞, 利用其合成大量黑色素而能被MRI检测的特性来反映基因表达的情况, 以探索磁共振成像(MRI)评价体外细胞基因表达的方法。方法:以脂质体将含酪氨酸酶基因完全cDNA的pcDNA3tyr质粒转染到HEK293细胞, 以MRIT₁WI、T₁WI/SPIR、T₂WI序列扫描转染细胞, 观察表达的黑色素的MRI信号。应用Fontana染色检测黑色素的合成, RT-PCR检测酪氨酸酶基因的cDNA片段, 以进一步验证酪氨酸酶基因的转染与表达。结果:(1)pcDNA3tyr质粒转染进入HEK293细胞并在其中表达生成黑色素, 转染5μg、10μg、20μg质粒的10⁶个细胞内生成的黑色素能够被MRI检测到并在MRIT₁WI、T₁WI/SPIR、T₂WI检查呈高信号, MRI信号强度与转染质粒量成正相关。(2)Fontana染色法检测到HEK293细胞内的黑色素颗粒;(3)采用RT-PCR方法检测到转染的HEK293细胞含酪氨酸酶基因的cDNA片段。结论:MRI能够检测到HEK293细胞内由外源基因表达合成的黑色素, 说明影像学与分子生物学技术结合可以评价体外细胞基因表达的情况。     

糖基化终产物促进培养的人脐静脉内皮细胞表达单核细胞趋化蛋白-1

目的 :糖尿病血管并发症如动脉粥样硬化 (Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ,ＡＳ)等是糖尿病主要的致死致残原因。高血糖状态下非酶糖基化可使蛋白质最终形成不可逆的糖基化终产物 (ａｄｖａｎｃｅｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ,ＡＧＥｓ)。糖尿病患者体内ＡＧＥｓ水平较正常人明显增高。动脉粥样斑块和泡沫细胞中均存在大量的ＡＧＥｓ,ＡＧＥｓ可与内皮细胞等多种细胞上受体结合 ,发挥生物学效应 ,加速粥样斑块的形成。单核细胞趋化蛋白 - 1 (ｍｏｎｏｃｙｔｅｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ - 1 ,Ｍ…     

建立人促甲状腺素受体α亚基HEK 293T细胞稳定表达株

为研究抗甲状腺多肽的特异性与亲和力,本研究建立了人促甲状腺素受体(TSHR)α亚基(hTSHRA)稳定表达株。构建hTSHRA到慢病毒质粒GV218上形成GV218-hTSHRA,挑取GV218-hTSHRA构建物阳性大肠杆菌克隆,提取DNA测序结果与人TSHRA序列比对,100%吻合。结果显示:GV218-hTSHRA转染到HEK 293T后,Western blot显示,HEK 293T细胞提取蛋白出现52kD的hTSHRA目的条带。GV218-hTSHRA、辅助质粒在HEK 293T细胞中包装后,HEK 293T细胞表达绿色荧光蛋白。收取浓缩的包装病毒,qPCR测定滴度达到了2×108 TU/mL。再将包装病毒转染到HEK 293T细胞中,hTSHRA即表达在HEK 293T细胞上,细胞传代后hTSHRA仍然稳定表达。结果表明获得GV218-hTSHRA包装质粒,并建立了hTSHRA-HEK 293T稳定表达株,为研究抗甲状腺多肽与人TSHRα亚基特异性与亲和力提供了必要的实验材料。     

大鼠急性甲醇中毒大脑皮质单核细胞趋化蛋白-1蛋白的表达

目的　观察大鼠急性甲醇中毒后单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）在大脑皮质的表达变化。 方法　应用通有混合气体（N2O/O2）的密闭有机玻璃箱并灌胃相应剂量甲醇溶液复制急性高剂量和低剂量甲醇中毒大鼠模型,运用Western Blot和免疫组化染色检测不同时间点大脑皮质中MCP-1的表达变化。 结果　Western Blot显示急性甲醇中毒后低剂量组和高剂量组MCP-1蛋白表达在12 h明显升高（P<0.01）,24 h达高峰,然后逐渐下降,3 d仍高于对照组（P<0.01）。高剂量组MCP-1蛋白表达在12 h和24 h高于低剂量组（P<0.05）,3 d 组MCP-1的表达无显著差异。免疫组化染色显示对照组大鼠大脑未见明显MCP-1阳性表达,急性甲醇中毒后,高剂量组24 h MCP-1阳性表达数增加,3 d达高峰,和对照组相比有显著差异（P<0.01）,阳性表达多集中在梨状皮质,1周阳性反应减少,但与对照组相比仍有显著差异（P<0.01）。 结论　大鼠急性甲醇中毒后,脑组织MCP-1蛋白表达显著增高并持续一定时间,可能参与了脑组织病理变化过程,程度与甲醇中毒剂量有关。     

糖基化终产物增加人外周血单核细胞对单核 细胞趋化蛋白-1的表达

动脉粥样硬化 (Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ,ＡＳ)是严重危害人类健康的疾病 ,糖尿病患者并发ＡＳ的可能性是正常人的 3～ 4倍。高血糖状态下蛋白质发生的非酶糖基化可使其最终形成不可逆的糖基化终产物 (Ａｄｖａｎｃｅｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ,ＡＧＥｓ)。ＡＧＥｓ可与单核细胞等多种细胞上受体结合 ,加速动脉粥样斑块的形成。单核细胞粘附于内皮并透入内皮下形成泡沫细胞是ＡＳ的早期事件。这一过程与单核细胞趋化蛋白- 1 (Ｍｏｎｏｃｙｔｅｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ - 1 ,ＭＣＰ -…     

人CD23基因的扩增及其在HEK 293T细胞的高效表达

目的建立一个有效表达CD23的系统。方法采用RT-PCR方法,从外周血淋巴细胞中扩增人的CD23cDNA基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3·1B上,构建成pcDNA3·1/CD23质粒表达载体;将pcDNA3·1/CD23质粒转染HEK293T细胞,通过流式细胞仪和Westernblot检测CD23在细胞中的表达情况。结果扩增的CD23cDNA序列与文献报道的一致;通过构建表达载体和转染细胞实现了CD23cDNA在293T细胞膜上的表达。转染效率达80%以上,并获得了较高水平的表达。结论扩增CD23cDNA基因,经过转染HEK293T细胞,实现了CD23在HEK293T细胞的高效表达。     

人CD7 cDNA在HEK293细胞中的表达

目的 建立表达人白细胞分化抗原CD7蛋白的哺乳动物细胞模型,为深入研究CD7的功能奠定基础。方法 采用PCR方法扩增CD7 cDNA,将目的片段定向克隆于真核表达载体pcDNA3,限制性内切酶酶切分析重组质粒并进行序列测定;通过电穿孔法将重组真核表达载体pcDNA3/CD7转染于人胚肾293细胞（HEK293）,经G418筛选得到抗性克隆;利用FCM检测CD7分子在HEK293细胞的表达。结果 得到了含CD7全长cDNA的重组真核表达载体pcDNA3/CD7。FCM分析表明：转染了pcDNA3/CD7的HEK293细胞表达人CD7蛋白。结论 为深入研究CD7的作用机制提供了条件。     

人单核细胞趋化蛋白-1的研究进展

人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)为一由76个氨基酸组成的单肽链,它既具有特异的单核细胞趋化活性,也具有激活单核细胞的活性,在机体防御、炎症恢复和抗肿瘤等方面起着重要作用。本文就MCP-1近几年来的研究进展作一综述。     

α-synuclein基因过度表达诱导HEK293细胞α-synuclein蛋白病理性积聚

目的观察α-synuclein过度表达诱导HEK293细胞α-synuclein蛋白病理性积聚的作用。方法将消除终止密码子α-synuclein基因扩增产物连入pGEM T-easy载体，DNA测序证实后亚克隆入增强型绿色荧光蛋白pEGFP-N1质粒，通过限制性内切酶酶切鉴定重组质粒。采用脂质2000将野生型α-synuclein-EGFP真核表达载体转染HEK293细胞，48h后采用Axiovert200型倒置荧光显微镜、荧光免疫细胞化学观察其在细胞内的表达，HE染色观察细胞胞浆内嗜酸性小体的形成。结果消除终止密码子的扩增序列经测序证实并亚克隆入pEGFP-N1质粒后，限制性内切酶酶切鉴定质粒大小、酶切位点上均符合实验设计。将野生型α-synuclein-EGFP真核表达载体转染HEK293细胞，48h后荧光显微镜下观察细胞在波长488nm蓝色激发光下发出明亮的绿色荧光，其中某些细胞出现绿色荧光物质积聚；免疫荧光细胞化学检测，EGFP阳性细胞同时也表现为α-synuclein免疫反应阳性，某些细胞胞浆内可见α-synuclein免疫阳性产物聚集；HE结果发现一些细胞胞浆内出现圆形的嗜酸性小体形成，约占细胞总数的10．8％。结论野生型α-synuclein基因过表达可诱导α-synuclein蛋白在HEK293细胞内积聚，胞浆内嗜酸性小体形成。     

反义单核细胞趋化蛋白—1转基因表达对单核细胞在动脉内膜粘 …

目的 了解动脉粥样便２化发病过程中单核细胞粘附并进入动脉内膜的机制,分析单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）基因表达对单核细胞粘附动脉内膜的作用。方法 以实验性高脂主轻度氧化ＬＤＬ（ＭＭ－ＬＤＬ）局部保留灌注的家兔股动脉 为模型,采用ＤＯＴＡＰ阳离子脂质体包裹ＬＮＣＯ－ａｎｔｉＭＣＰ－１质粒,将反义ＭＣＰ－１ ＣＤＮＡ定位导入家兔股动脉鞘及周围组织,以原位杂交、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交及狭缝杂交法反义Ｍ