他克莫司与环孢菌素A对肝移植受者CD4/CD8 T淋巴细胞亚群及共刺激分子的调节作用

目的:探讨他克莫司(Tacrolimus, FK506)与环孢菌素A(CsA)对肝移植受者T淋巴细胞亚群共刺激分子的调节作用.方法:采用荧光标记单克隆抗体(mAb)结合流式细胞技术, 测定移植术后使用FK506或CsA治疗2月末的肝移植受者外周血T细胞亚群及其表面共刺激分子CD28、CD152 和ICOS的表达情况.以健康志愿者(健康对照组)和患终末期肝脏疾病拟进行肝移植者(疾病对照组)为对照.结果:疾病对照组T细胞亚群平衡紊乱、共刺激分子表达异常(P＜0.05).治疗组肝移植受者T淋巴细胞亚群表达恢复至健康对照水平, T细胞表面CD28和ICOS分子表达显著降低(P＜0.05)而CD152分子表达明显升高(P＜0.05).比较不同药物治疗组:CsA治疗组CD4 T细胞表达和CD8 T细胞表面CD28、CD152分子表达均明显高于FK506治疗组(P＜0.05);其他指标无统计学意义(P＞0.05).结论:在常规血药浓度条件下FK506和CsA的对CD4/CD8T细胞亚群及共刺激分子的免疫调节作用存在差异.FK506对T细胞亚群的调节作用强于CsA.FK506可同时抑制正性共刺激分子CD28和ICOS表达并促进负性共刺激分子CD152表达, 而CsA对T细胞免疫抑制作用主要是通过促进CD152分子的高表达介导.     

FK506对肝移植受者T细胞亚群上CD152和PD-1的调节研究

目的:动态观察肝移植受者外周血T细胞表面CTLA-4/CD152和PD-1的表达,探讨FK506对负性协同刺激分子的调节作用.方法:采用酶增强免疫分析法测定FK506的血药浓度.外周血T细胞亚群和T细胞表面CD152和PD-1分子的表达利用流式细胞术(FCM)进行检测.结果:各时间组间FK506血药浓度无统计学意义(P＞0.05).随治疗时间延长,CD4 T细胞持续下降,至治疗3月时已明显低于健康对照组(P＜0.05).而各治疗组CD4 T细胞百分率均明显低于疾病对照组(P＜0.05).各时段治疗组CD8 T细胞均明显高于疾病对照组(P＜0.05).肝移植术后,CD4 和CD8 T细胞上CD152的表达较健康对照组升高(P＜0.05),治疗2周和1月组还高于疾病对照组(P＜0.05).治疗2月和3月组CD4 CD152 T细胞的表达较治疗2周和1月组下降(P＜0.05).治疗3月组CD8 CD152 T细胞的表达较治疗2周和1月组降低(P＜0.05).术后T细胞亚群上PD-1的表达有升高趋势.CD4 T细胞上PD-1的表达在治疗2周开始明显高于健康对照组(P＜0.05).CD8 T细胞上PD-1的表达从治疗1月时明显高于疾病对照组(P＜0.05).结论:FK506能上调T细胞表面负性协同刺激分子CD152和PD-1的表达,可能参与抑制效应T细胞的过度增殖与活化,维持移植受者的存活和免疫稳态.     

FK506对NIT-1细胞增殖和胰岛素分泌的影响

目的 探讨他克莫司(FK506)对NOD鼠胰岛β细胞系(NIT-1)增殖、凋亡和胰岛素分泌的影响.方法 用MTT法、流式细胞术检测NIT-1细胞增殖;放射免疫法、real-time PCR检测NIT-1细胞胰岛素分泌和胰岛素分化相关基因PDX-1、GLUT2和GK mRNA的表达.结果 FK506(20 μg/L)抑制NIT-1细胞增殖(P＜0.05),诱导细胞凋亡(P＜0.05);FK506(10 μg/L)抑制NIT-1细胞释放胰岛素(P＜0.05),胰岛素分泌相关基因PDX-1(胰岛素促进因子-1)、GLUT2(葡萄糖转运载体2)mRNA表达下调(P＜0.05).结论 FK506(10 μg/L)可抑制NIT-1的增殖,诱导凋亡,可通过下调PDX-1和GLUT2 mRNA表达,抑制NIT-1胰岛素分泌.     

普乐可复防治大鼠抗肾小球基底膜肾炎的实验研究

目的:观察普乐可复(FK506)防治大鼠抗肾小球基底膜(GBM)肾炎的疗效。方法:复制大鼠抗GBM肾炎模型。实验分3组:肾炎+FK506组、肾炎对照组及正常对照组。大鼠一次性尾静脉注射抗GBM抗血清后6 h内皮下注射FK506注射液(0.5 mg·kg^-1·d^-1), 至第21 d。对照组则给予等量的生理盐水。定期于第4 d、第14 d和第21 d, 检测大鼠尿蛋白、血清肌酐和尿素氮水平, 观察肾组织病理学改变, 以及检测T淋巴细胞转化功能。结果:肾炎对照组大鼠注射抗血清后于第4d即出现异常蛋白尿, 血清肌酐和尿素氮亦持续上升;肾小球内可见细胞数增加和新月体形成, 肾小管内大量蛋白管型, GBM呈不规则增厚, 足突大片融合;T淋巴细胞转化功能异常。而肾炎+FK506组大鼠上述病变均明显较轻。结论:FK506能够明显改善大鼠抗GBM肾炎的肾功能。     

不同途径的乳球菌介导重组IL-12基因抗小鼠黑素瘤的效果

利用自身免疫系统或其组分治疗肿瘤是一种新的治疗手段.白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)是一种具有多种生物学活性的免疫调节因子,它可以促进NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)的活性,能刺激T细胞及NK细胞的增殖,并诱导分泌IFN-γ等多种细胞因子[1],因此在抗肿瘤及抗感染中起重要作用.与其他细胞因子一样,直接应用IL-12会导致全身不良反应甚至危及生命.2003年Huber等[2]发现通过滴鼻给药可以降低IL-12介导的不良反应,此外有研究表明利用质粒、腺病毒或腺病毒转染的间质干细胞靶发送IL-12基因到肿瘤部位表达也能抑制肿瘤生长[3-5],而不致产生严重的不良反应.然而质粒发送存在缺乏组织的特异性和靶向性、转染效率较低且基因表达时间短[6]等缺点,发送重组腺病毒载体易导致转染细胞毒性及死亡、基因表达时间受限、可诱导机体产生免疫反应[7]等,限制了这些方式临床应用的效果.     

免疫抑制剂作为DNA疫苗佐剂的研究

目的:探讨免疫抑制剂作为DNA疫苗佐剂的免疫效果及预防自主免疫疾病的效果.方法:将三种免疫抑制剂环孢素(C&A)、他克莫斯(FK506)和霉酚酸酯(MMF)作为多发性硬化症(MS)的DNA疫苗佐剂,共同肌肉注射免疫小鼠.取小鼠脾脏抗体染色后,用流式细胞仪检测调节性T细胞(Treg)的比例及T细胞增殖反应,检测树突细胞(DCs)成熟状态及分泌白介素10(IL-10)的变化,并在诱导EAE动物模型后,检测临床打分的变化.结果:免疫FK506作为MS的DNA疫苗佐剂组显著提高了Treg细胞的比例,T细胞增殖反应显著受到了抑制,DCs细胞成熟受到抑制且IL-10的表达显著升高,能够显著降低小鼠实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)的临床打分.结论:FKS06能够作为DNA疫苗的佐剂,诱导Treg细胞的产生,使机体产生免疫耐受,并能够在一定程度上预防自主免疫疾病的发生,为自身免疫性疾病的预防和治疗提供新的方法和思路.     

聚肌胞苷酸对人胎盘胎儿源性间充质干细胞细胞因子产生的影响

<正>胎盘来源的间充质干细胞(plancenta derived mesenchymal stem cells,PMSC)越来越多的用于临床治疗[1]。PMSC免疫调节功能可能与抑制树突状细胞、T细胞、B细胞等多种免疫细胞功能,同时释放多种免疫调控因子相关[2]。其中一些免疫调控因子的分泌受到Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)信号通路的调控。因此TLR激活剂可能诱导人胎盘胎儿     

FKBP12/BAX双聚体诱导细胞凋亡模型的建立

目的：建立FKBP12／BAX双聚体可诱导细胞凋亡生物效应的细胞模型,并利用阳性药物对其进行鉴定。方法：RT-PCR扩增鼠源性BAX全长基因,插入pUC18载体进行测序鉴定。将鉴定正确的mBAX插入载体pC4FV1E中,构建pC4FV1E／BAX表达质粒。将表达质粒与pcDNA3．1共转染HEK293细胞,建立pCAFV1E／BAX-neo和neo基因稳定表达的细胞模型。利用形态学方法、流式细胞术等对化学药物诱导FKBP12／BAX双聚体介导的细胞凋亡进行定性及定量的分析。结果：RT-PCR、Westem blot法分别从mRNA及蛋白水平检测到FKBP12-mBAX融合基因的整合及表达;阳性化合物AP20187作用4～6h后,Giemsa染色可见明显的凋亡小体;钙依赖核酸内切酶亦被激活,出现典型的“DNA ladder”;天然产物FK506可竞争性地抑制这种阳性药物诱导的细胞凋亡。结论：FKBP12／BAX双聚体可诱导细胞凋亡生物效应的细胞模型的建立,为FK506类小分子化合药物的高通量筛选提供可应用的技术平台。     

FK506对BXSB狼疮性肾炎小鼠的治疗作用及其机制初步探讨

目的观察FK506对BXSB狼疮性肾炎小鼠治疗作用,初步探讨其作用机制。方法 6只12周龄雄性C57BL/6小鼠为正常对照组,12只12周龄雄性BXSB小鼠随机分为LN治疗组和LN未治疗组。治疗组予FK506 2 mg/kg隔日腹腔注射,未治疗组、正常对照组予NS 0.2 ml隔日腹腔注射,治疗至20周龄。PASM染色法观察肾组织病理变化,直接免疫荧光法观察肾组织IgG沉积,ELISA法检测血清抗-dsDNA抗体和IL-18水平,RT-PCR法检测肾组织IL-18 mRNA表达水平,免疫组化法检测肾组织IL-18表达水平。结果治疗组小鼠肾脏病理学改变明显好转,肾组织免疫球蛋白沉积减少,血清抗-dsDNA抗体和IL-18水平、肾组织IL-18mRNA和蛋白表达水平均低于未治疗组。结论 FK506对BXSB小鼠肾损害具有良好的治疗作用,抑制IL-18 mRNA的表达可能是FK506治疗LN的作用机制之一。     

T细胞受体基因修饰在肿瘤免疫细胞治疗中的应用及研究进展

<正>长期以来,人们一直期望能够用一种有效的手段来控制和治愈肿瘤,并且不断地探索和研究肿瘤治疗的新方法。近些年来细胞免疫治疗已经成为继手术、放疗、化疗之后在恶性肿瘤治疗中具有巨大前景的一种治疗方法。T细胞受体(T cell receptor,TCR)基因修饰T细胞治疗是将针对肿瘤特异性抗原的受体导入T细胞中~[1],再将这些基因修饰     

亲免蛋白功能与自身免疫性疾病关系初探

一、亲免蛋白超家族的组成与结构亲免蛋白超家族由高度保守的蛋白质组成,在胞内高丰度表达,大多具有肽脯氨酰顺和(或)反异构酶(PPIase)或旋转异构酶活性[1]。包括两个主要的超家族:亲环蛋白超家族(CYPs)和FK506结合蛋白超家族(FKBPs)。它们在氨基酸序列中各自保持独立性,且在进化中高度保守,但有一共同点是在N末端均有一个PPIase结构域,可以与不同的免疫抑制性药物特异性结合[2,3]。与免疫抑制性药物结合的PPIase结构域分别又被称为环孢素A结合区域(cyclosporin-A bind-ing domain,CLD)和FK506结合区域(FK506-like binding do-m…     

丙氨酰-谷氨酰胺下调口服他克莫司损伤的肠黏膜组织中iNOS和TNF-α的表达

目的： 研究丙氨酰-谷氨酰胺(Ala-Gln)对口服FK506损伤的肠黏膜组织中iNOS和TNF-α分子表达的影响。 方法： BALB/c小鼠24只，随机分成对照组、FK506低剂量组、FK506高剂量组及Ala-Gln治疗组，分别给以0.2 mL生理盐水、FK506 0.1 mg/kg、1.0 mg/kg灌胃和FK506 1.0 mg/kg灌胃及丙氨酰-谷氨酰胺 0.5 g/kg腹腔注射。隔天给药，6周后采集回肠标本。HE染色和扫描电镜观察肠黏膜组织形态学改变；FITC-dextran(FD4)检测肠黏膜通透性；RT-PCR检测小肠黏膜iNOS和TNF-α mRNA的表达情况；Western blotting检测iNOS和TNF-α蛋白表达水平。结果： FK506高剂量组的肠黏膜对FD4的通透性明显增加，扫描电镜示小肠绒毛破坏明显，而Ala-Gln治疗组小肠绒毛破坏减轻，对FD4的通透性下降；FK506高剂量组小肠黏膜iNOS mRNA和TNF-α mRNA表达增强，而Ala-Gln治疗组表达则明显下调；iNOS和TNF-α蛋白表达水平的变化与此一致。结论： FK506通过上调iNOS和TNF-α的表达对小肠黏膜产生损伤，使小肠壁的通透性增加。Ala-Gln对FK506所致的肠黏膜屏障功能损伤具有保护作用，该作用可能与下调iNOS和TNF-α的表达有关。     

FK506作为佐剂刺激Tfh细胞增强体液免疫水平的研究

目的:探讨他克莫司(FK506)作为佐剂通过刺激Tfh细胞增强疫苗体液免疫水平的机制。方法:利用FK506与模式蛋白(卵清白蛋白,OVA)皮下注射免疫BALB/c小鼠,免疫三次,利用ELISA方法检测抗体水平;利用抗体染色流式细胞仪检测Tfh细胞、B细胞表面分子IL-21R及记忆性B细胞标志分子CD27表达。结果:FK506作为OVA蛋白佐剂,能够显著提高小鼠OVA特异性的IgG水平,增强体液免疫水平;免疫后的小鼠Tfh细胞表达IL-21水平显著高于其他对照组。同时,B细胞表达IL-21R及记忆性B细胞标志分子CD27显著高于其他对照组。表明FK506作为佐剂刺激Tfh细胞表达IL-21,作用于B细胞增强抗体水平。结论:FK506能够作为蛋白疫苗佐剂刺激Tfh细胞表达IL-21;IL-21可能通过与B细胞表面IL-21R作用,增强抗体的分泌;并刺激记忆性B细胞的产生,进而增强体液免疫水平。     

他克莫司与环孢菌素A对肝移植受者CD8+CD28-调节性T细胞的不同调节特性

目的 探讨他克莫司(FK506)与环孢菌素A(CsA)对肝移植受者CD8 GD28-调节性T细胞(Treg)及细胞因子IL-10的调节效应.方法 采用荧光标记单克隆抗体结合流式细胞技术分析接受FK506或CsA治疗的肝移植受者外周血CD8 T细胞及共刺激分子CD28的表达情况,采用流式细胞小球微阵列术(CBA)分析血浆中IL-10浓度.以健康志愿者和患终末期肝脏疾病拟进行肝移植者作为对照.结果 疾病对照组CD8 T细胞和CD8 CD28-T细胞/CD8 CD28 T细胞比值(Ratio值)显著低于健康对照组(P＜0.05).FKS06治疗组CD8 T细胞表达显著回升(P＜0.05),且增加的CD8 T细胞主要为CD8 CD28-Treg(P＜0.05).CaA治疗组CD8 T细胞和CD8 CD28-Treg未出现明显回升(P＞0.05).且FKS06治疗组CD8 CD28-Tteg表达显著高于CaA治疗组(P＜0.05).两治疗组血浆IL-10水平均显著高于健康对照组和疾病对照组(P＜0.05),但组间差别无显著性(P＞0.05).结论 FKS06可促进肝移植受者外周血CD8 CIY28-Treg表达并同时促进IL-10的产生从而加强T细胞的免疫耐受,而CaA虽不能有效促进CD8 CD28-Treg的表达但却能促进IL-10的产生.     

MUC1/Y基因体外冲击树突状细胞诱导抗瘤免疫反应

目的制备含MUC1/Y cDNA质粒转染的树突状细胞(DC),体外诱导杀伤细胞,研究其治疗消化道肿瘤的效果.方法构建MUC1/Y cDNA真核表达载体pIRES2-EGFP-MUC1/Y、pcDNA3.1-MUC1/Y.以pcDNA3.1-MUC/Y电转染8例HLA-A2(+)消化道肿瘤患者单个核细胞衍生的DC后,与自体T细胞混合培养,诱导CTL(T-pcDAN3.1-MUC1/Y).以SW620细胞[HLA-A2(+)、MUC1/Y(+)]为特异性靶细胞,Raji细胞[HLA-A2(-)、MUC1/Y(-)]和Lovo细胞[HLA-A2(-)、MUC1/Y(+)]为非特异性靶细胞,通过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验测定杀伤活性,ELISA法检测基因修饰后DC刺激自体T细胞产生IFN-γ的能力,并以ANNEXIN V-FITC试剂盒检测特异性CTL诱导靶细胞凋亡情况.结果pIRES2-EGFP-MUC1/Y转染效率为8%左右.T-pcDAN3.1-MUC1/Y诱导的杀伤作用显著高于T-pcDNA3.1[pcDNA3.1(+)修饰DC诱导的CTL]和T-IL-2(IL-2刺激外周血单个核细胞产生的CTL),P＜0.05.而且T-pcDNA3.1-MUC1/Y对靶细胞的杀伤和诱导凋亡的能力显著高于对照组.基因修饰后的DC能刺激自体T细胞分泌高水平IFN-γ,与未转染的DC相比具有显著差异(P＜0.05).结论成功构建MUC1/Y全长cDNA真核表达载体.pIRES2-EGFP-MUC1/Y可用于真核细胞转染,通过观察转染效率,易于筛选阳性克隆;经pcDNA3.1-MUC1/Y修饰的DC可有效诱导特异性抗肿瘤免疫应答.     

干扰MAFG-AS1靶向miR-335-3p对淋巴细胞白血病的影响北大核心CSCD

淋巴细胞白血病是一种血液性的恶性肿瘤,按病程缓急分为急性和慢性,急性型常见于儿童,慢性型多见于中老年患者。分子靶向治疗是淋巴细胞白血病新型的治疗方式,研究其分子发病机制,可为临床新药研发提供参考[1-3]。研究表明血液恶性肿瘤中lncRNAs的异常表达参与其进展过程[4]。研究报道沉默lncRNA MAFG-AS1通过调控miR-3196抑制胰腺癌细胞增殖和迁移,促进胰腺癌细胞凋亡[5]。敲低MAFG-AS1可通过调节miR-150-5p抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移[6]。沉默MAFG-AS1抑制肺腺癌细胞增殖,诱导细胞凋亡[7]。     

多元分析模板图在监测肝移植受者FK506治疗窗浓度中的应用

目的:应用多元分析模板图为临床肝移植受者监测他可莫司(代号FK506)理想治疗窗浓度提供方法。方法:用Excel软件建立标准品、质控品和患者样本的多元分析模板图,对微粒子酶免疫分析法(MEIA)测定的肝移植受者全血FK506血药浓度数据进行处理。结果:为11例肝移植受者检测FK506血药浓度178例次,术后3个月内在理想治疗窗浓度范围内者占44.6 %,异常标准曲线5条,质控值失控3次。结论:多元分析模板图操作简单,使用方便,是监测FK506治疗窗浓度的实用工具。     

胸腺应急修饰诱导大鼠同种心脏移植免疫耐受

目的：与以往术前21天进行胸腺修饰常规方法不同，在手术当天进行胸腺内注射抗原，诱导大鼠同种心脏移植免疫耐受。方法：在大鼠腹腔异位心脏移植模型中，实验组在手术当天将供体SD大鼠脾细胞注射到受体Wistar大鼠胸腺，并以FK506短程处理受体鼠。单纯药物对照组在围手术期使用FK506但不进行胸腺内注射供体脾细胞；经典方法诱导组，腹腔注射抗淋巴细胞血清ALS(-1天) 胸腺内注射供体脾细胞(-21天)；无处理组，单纯将SD大鼠心脏移植到Wistar大鼠腹腔。观察供心存活天数、病理改变及混合淋巴细胞反应等指标的变化。结果：实验组供心存活时间较对照组明显延长，而与经典诱导组比较无统计学差异。实验组和经典诱导组的供受体脾细胞混合淋巴细胞培养各组增殖反应均较元处理组降低，而两者之间无差异。结论：心脏移植手术当日胸腺内注射供体同种抗原，同时给予短程免疫抑制剂与术前21天胸腺注射的经典诱导组同样能诱导宿主对移植物的低反应状态(免疫耐受或免疫抑制)。     

[Gyl14]-Humanin对Aβ_(25-35)诱导PC12细胞凋亡的影响

目的:探讨神经保护肽[Gly14]-Humanin过表达对Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡的影响。方法:采用脂质体法将重组真核表达载体pcDNA3.1(-)/HNG-FLAG转入PC12细胞,G418筛选获得抗性亚克隆细胞株,免疫细胞化学法分析[Gly14]-Humanin基因的表达。用25μmol/LAβ25-35作用细胞24h,MTT法分析细胞存活率,流式细胞术(FCM)监测细胞凋亡,Hoechst33258染色观察凋亡细胞核形态改变。结果:建立了稳定过表达[Gly14]-Humanin的PC12细胞系。经25μmol/LAβ25-35作用后,稳定表达[Gly14]-Humanin的PC12细胞存活率较空质粒转染组明显提高(P0.05),凋亡率显著降低(P0.05)。Hoechst33258染色结果表明,空质粒转染组细胞核出现浓缩及断裂等凋亡形态,而过表达[Gly14]-Humanin组细胞核形态正常。结论:过表达[Gly14]-Humanin能够抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡。     

Immunophilins的生物学意义及其配体的免疫抑制作用机理

高效免疫抑制剂环孢霉素A(cyclosporineA,CsA)和FK506主要是通过阻滞IL-2基因表达而实现其免疫抑制作用。至于它们是作用于细胞因子基因的转录,还是基因转录的信号传导途径,一直是细胞生物学家和免疫学家关注的课题。近年来由于分子生物学和免疫学的发展,这方面的研究已取得了迅速的进展,本文着重介绍CsA和FK506的胞浆受体亲环肽素和FK506结合蛋白的生化特性、生物学功能以及这种免疫抑制剂对Ca~(++)相关信号传导途径的影响来说明其可能的免疫抑制作用机制。