兔抗MDA-7/IL-24多克隆抗体的制备和特异性鉴定

目的制备兔抗MDA-7/IL-24抗体,并鉴定其特异性。方法从经PHA刺激培养的人外周血淋巴细胞中用RT-PCR扩增mda-7/IL-24基因,构建带His6-tag的原核表达载体pET-28a( )-mda-7/IL-24,并在大肠杆菌中表达。将表达产物进行SDS-PAGE后,切下含有目的蛋白的胶条,免疫新西兰纯种大白兔,收集免疫兔血清,用Westernblot检测抗血清与大肠杆菌表达的重组蛋白His6-MDA-7/IL-24和肺癌细胞A549中重组腺病毒Ad.mda-7/IL-24表达产物的反应性。结果经IPTG诱导表达的His6-MDA-7/IL-24融合蛋白的相对分子质量(Mr)约为28000,主要为包涵体形式。Westernblot证实,表达产物可与抗His6单克隆抗体(mAb)特异性结合。1∶5000的抗血清仍能结合His6-MDA-7/IL-24融合蛋白;稀释为1∶1000时,能与重组腺病毒Ad.mda-7/IL-24在A549细胞中的表达产物结合。结论成功地制备兔抗MDA-7/IL-24抗体,该抗体能够识别体外过表达的MDA-7/IL-24蛋白。     

小鼠抗人BART多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备小鼠抗人源性BART的抗体。方法采用原核系统表达人全长BART,经纯化后免疫小鼠制备抗BART的抗体,以Western blot、免疫组化染色法检测抗体的效价和特异性。结果获得高效价的小鼠抗BART的抗体,该抗体能够识别大鼠脊髓组织中的BART分子。海马神经元和星形胶质细胞的免疫组化染色结果显示,BART分子在海马神经元、星形胶质细胞中广泛表达;在海马神经元中,BART与钙离子通道存在共定位现象。结论制备出能特异性识别天然BART分子的抗体,为检测BART分子并进一步研究其功能奠定了基础。     

小鼠抗人Myosin Va多克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备Myosin Va多克隆抗体,为深入研究其功能和探讨其与肿瘤等疾病的相关性提供工具.方法:PCR扩增编码人Myosin Va C末端(MyoVaCT)278个氨基酸的cDNA片段,DNA重组入原核表达质粒pET28a,转化大肠杆菌BL21菌株,异丙基β-D硫代半糖苷(IPTG)诱导表达His-MyoVaCT融合蛋白.经电泳纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗血清.通过ELISA和免疫荧光法鉴定血清特异抗体效价和特异性.结果:成功构建了pET28a/MyoVaCT原核表达载体,转化BL21后可高效表达融合蛋白His-MyoVaCT,纯化蛋白免疫小鼠后产生的Myosin Va多抗可特异检测细胞内源性Myosin Va的表达及定位情况,同时能特异识别细胞内外源表达的Myosin Va分子.结论:获得了效价和特异性都良好的Myosin Va抗体,适合应用于Myosin Va的检测.     

兔抗人PIWIL4蛋白多克隆抗体的制备和鉴定

目的 制备兔抗人PIWIL4的多克隆抗体,并鉴定其特异性,应用组织芯片初步探讨其在人类正常及肿瘤组织中的分布.方法 合成特异性PIWIL 4多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体构建多肽免疫原,通过致敏大白兔, 制备兔抗人PIWIL4多克隆抗体,然后用亲和层析法纯化抗体.用ELISA和western方法进行抗体验证,并应用人组织芯片进行PIWIL4的免疫组化研究.结果 通过构建P IWIL4多肽-KLH载体复合物致敏大白兔,我们制备了兔抗人PIWIL4蛋白多克隆抗体,经ELIS A 及Western blot证实兔抗人PIWIL4抗体可特异性识别PIWIL4多肽,在人组织芯片中通过免疫组化染色显示该抗体在BU部分正常组织和肿瘤组织中呈阳性染色.结论 本项研究成功制备兔抗人PIWIL4多克隆抗体,为进一步研究PIWIL4在人类疾病中的意义提供了有利工具.     

兔抗人APE1多克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备兔抗人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶多克隆抗体并进行鉴定.方法:以纯化的全长APE1蛋白为抗原, 采用改良的快速免疫法制备兔抗人APE1多克隆抗体并进行特异性亲和纯化, ELISA、Western blot和免疫组化检测制备抗体的效价和特异性.结果:ELISA检测显示该抗体的效价达到1:128 000, 相对亲和力常数为8.96×10-6 mol/L.Western blot显示该抗体能与APE1蛋白特异性结合, 免疫组化检测显示阳性反应产物主要定位于细胞核.此外, 该抗体还可用于小鼠和大鼠组织APE1蛋白的检测.结论:制备的多克隆抗体特异性和效价良好, 不仅为今后深入研究人APE1蛋白的性质与功能提供了有用的实验工具, 还可用于检测小鼠和大鼠组织中APE1蛋白的表达.     

兔抗人羧酸酯酶1多克隆抗体的制备与鉴定

目的: 制备兔抗人羧酸酯酶1(CES1)多克隆抗体(pAb), 并对抗体进行特性鉴定.方法: 以人正常肝cDNA文库为模板, 构建重组表达质粒pGEX-4T-1-CES1(即CES1-GST)和pET-32a-CES1(即CES1-His).CES1-GST融合蛋白作为免疫原制备兔pAb, 辛酸-硫酸铵法纯化抗体, 采用Western blot和免疫组化鉴定抗体的特异性.结果: CES1-GST和CES1-His融合蛋白均在大肠杆菌中以包涵体形式大量表达.兔抗人CES1 pAb效价为1∶ 64 000.Western blot鉴定表明, 该抗体可识别重组人CES1蛋白, 也可特异地识别人肝微粒体中的CES1亚基.免疫组织化学鉴定显示该抗体可特异性识别正常肝组织中的CES1蛋白.结论: 成功地制备了兔抗人CES1 pAb, 该抗体可应用于ELISA、 Western blot、免疫组化等实验, 为进一步研究CES1的功能提供了特异性检测工具.     

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定.方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21( DE3)大肠杆菌.利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白.重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价.Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性.结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600.Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α.结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础.     

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定。方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21(DE3)大肠杆菌。利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白。重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性。结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600。Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α。结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础。     

抗CMTM4多克隆抗体的制备、纯化和鉴定

目的:制备抗CMTM4的多肽抗体并鉴定其性能.方法:通过TMHMM、DNAStar等软件对CMTM4的3种剪接体,CMTM4-v1,v2和v3的蛋白序列进行分析,选取了4段序列合成多肽并与钥孔戚血蓝素(KLH)偶联.其中第1、2、3条多肽为3种剪接体共有,混合后免疫家兔,制备Ab1;而第4条多肽为CMTM4-v1所特有,单独免疫家兔,制备Ab2.ELISA法检测抗体效价.免疫亲和层析法纯化后,进行Western blot和免疫组织化学检测,鉴定这2种抗体的特异性与适用范围.结果:得到兔抗人CMTM4多肽抗体Ab1和Ab2,效价分别达1:105和1:106.纯化后的Ab1用于Western blot可特异识别超表达的CMTM4-v1和v2,并可用于免疫组织化学实验;而Ab2仅可用于Western blot,特异性识别超表达的CMTM4-v1.Ab1还可特异识别小鼠内源性Cmtm4.结论:用多肽免疫家兔制备的2种抗CMTM4抗体不仅具有较高的效价以及特异性,并且Ab1还可以特异识别小鼠Cmtm4,为CMTM4的功能研究提供了有力的支持.     

兔抗人copine-8蛋白多克隆抗体的制备

目的制备人源copine-8(CPNE8)蛋白的多克隆抗体。方法反转录PCR扩增HBE人支气管上皮细胞的CPNE8基因(编码CPNE8蛋白)并克隆至p GEX-4T-1原核表达载体中,所得的重组载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白。谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析纯化目的蛋白并基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF)鉴定。以纯化的CPNE8蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。用ELISA、Western blot法及免疫组织化学染色法检测抗体的效价和特异性。结果成功构建了p GEX-4T-1-CPNE8表达载体,重组CPNE8蛋白在大肠杆菌中高效表达。ELISA检测结果显示抗体的效价达1∶64 000;此多克隆抗体可经Western blot特异性识别原核表达的CPNE8蛋白,并可适合免疫组织化学技术检测该蛋白在人正常肺组织和肺癌组织中的分布。结论成功制备具有较好结合特异性的CPNE8蛋白多克隆抗体。     

兔抗鼠MORF4L1 a多克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备兔抗鼠MORF4L1 a变体的多克隆抗体以区分MORF4L1的a、b变体.方法 根据对小鼠MORF4L1 a、b变体差异序列的抗原性、同源性的分析结果,合成MORF4L1 a的N端第52～66位的序列作为抗原肽(15肽,KSAVRPRRSEKSLKT),偶联KLH载体作为抗原免疫家兔,用Dot blot鉴定抗...     

兔抗人重组生长激素rhGH多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

目的制备抗人生长激素(growth hormone,GH)的多克隆抗体并鉴定其性能。方法真核细胞表达质粒pcDNA3.0-GHcDNA免疫家兔,制备rhGH多克隆抗体;ELISA法检测抗体效价。亲和层析法纯化后,进行Western blot、免疫组织化学和激光共聚焦显微镜检测,鉴定抗体的特异性与适用范围。结果得到兔抗人重组人生长激素rhGH多克隆抗体,效价达1:40000。纯化后的抗体可特异识别超表达的hGH和人内源性GH,可用于免疫组织化学实验、Western blot及激光共聚焦。结论用质粒免疫家兔制备的抗GH抗体具有较高的效价以及特异性,为hGH的功能性研究提供了有力的支持。     

VSTM1多克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备VSTM抗体,鉴定其性能.方法:VSTM1有两种主要的剪接体VSTM-v1和VSTM-v2.前者为膜分子,后者为分泌蛋白,与前者相比后者仅缺少穿膜区.构建VSTM-v2的原核表达载体,诱导表达并纯化带两种不同标签的VSTM-v2重组蛋白,Trx-His-S-VSTM1-v2和GST-VSTM1-v2.用前者免疫家兔制备VSTM1抗血清,ELISA检测效价;后者偶联Sepharose 4B制备免疫亲和层析柱对抗血清进行纯化.通过Western blot法和免疫荧光细胞化学技术,鉴定该抗体的特异性与适用范围.结果:免疫得到兔抗人VSTM1抗血清,效价达到1∶106.纯化后的抗体用于Western blot可特异识别过表达和内源性的VSTM1,并可用于免疫荧光细胞化学技术检测细胞膜表面过表达的VSTM-v1.结论:成功制备了兔抗人VSTM1抗体,具有较高的效价及特异性,可以识别内源性VSTM1并可用于免疫荧光细胞化学技术.     

抗PTD-bcr/abl多克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备多克隆抗体并初步用于PTD－bcr/abl融合的研究，为慢性粒细胞白血病的免疫治疗提供实验依据。方法 在大肠杆菌中表达PTD－bcr/abl融合蛋白，用所获得的蛋白免疫家兔得到多克隆抗体，并用免疫组化染色，Western-blot等方法进行此抗体的鉴定。结果 （1）表达PTD－bcr/abl融合蛋白。（2）制备了抗PTD－bcr/abl融合蛋白多克隆抗体。（3）并用多克隆抗体以多种方法，检测PTD－bcr/abl融合蛋白，证实此抗体效价高，特异性强。结论 此抗体可用于PTD－bcr/abl融合蛋白的进一步研究。     

兔抗凋亡蛋白酶活化因子－1多克隆抗体的制备、纯化与鉴定

1997年,Zou等[1]首次从HeLa细胞胞质内纯化和克隆出凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotie protease activating factor-1,Apaf-1)的cDNA,该蛋白质的相对分子质量(Mr)为130.近来研究发现在细胞色素C和dATP存在的情况下,Apaf-1可聚集成凋亡体(apoptosome)[2],凋亡体负责将半胱天冬酶-9酶原蛋白(pmcaspase-9)裂解成半胱天冬酶-9(easpase-9),以及维持caspase-9的酶活性,进一步激活caspase-3而诱导细胞凋亡[2],因此Apaf-1可被认为是凋亡体的真正核心.     

兔抗人Rig-I蛋白N端CARD结构域多克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备人维甲酸诱导基因I(hRig-I)N端CARD结构域(hRig-I-N)多克隆抗体.方法:从逆转录病毒载体MigRI-hRig-I中扩增hRig-I基因N端CARD结构域852 bp长度的基因片段,克隆入pGEX-4T3中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下,表达GST-hRig-I-N融合蛋白,将表达的融合蛋白纯化,免疫家兔制备抗体,并以间接ELISA法测定抗体效价,以Western blot、细胞免疫荧光方法鉴定抗体的特异性.结果:在大肠杆菌中成功表达融合蛋白GST-hRig-I-N,ELISA法检测抗体的效价达到1:125 000,Western blot及细胞免疫荧光检测结果显示抗体可与原核及真核表达的hRig-I-N蛋白特异结合.结论:制备了高效价、高特异性的hRig-I-N抗体,为进一步研究hRig-I-N的功能奠定了基础.     

兔抗人ERA多克隆抗体的纯化

目的纯化兔抗人ERA的多克隆抗体。方法在大肠杆菌中,表达重组MBP-hEra融合蛋白。表达产物先继以直链淀粉树脂亲和柱和Superose12凝胶柱过滤纯化。将纯化的MBP-hEra偶联于NHS-activatedSepharoseTM上,制备亲和层析柱,纯化兔抗人ERA多克隆抗体。结果①表达、纯化的MBP-hEra,相对分子质量(Mr)为78×103,其纯度为95％。②从抗血清中纯化获得可与MBP-hEra特异性结合的兔抗hEra多克隆抗体。结论获得了特异性较好的纯化兔抗hEra多克隆抗体。     

5-氟尿嘧啶多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备5-氟尿嘧啶(5-FU)免疫原并制备其多克隆抗体。方法采用化学合成法对5-FU进行修饰制备5-氟尿嘧啶-1-基乙酸半抗原(5-FUAA),并经碳酰二亚胺盐法将其分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)连接以制备免疫原。采用5-FU与BSA结合的免疫原(5-FUAA-BSA)免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,5-FU与OVA结合物(5-FUAA-OVA)包被酶标板经间接ELISA检测抗血清效价,并采用ELISA与Western blot法检测抗血清的特异性。结果成功合成半抗原5-FUAA,并分别制备5-FUAA-BSA和5-FUAA-OVA完全抗原。将5-FUAA-BSA免疫BALB/c小鼠制备的免疫血清效价达1∶1 280 000,且该多克隆抗体能特异地结合5-FU半抗原。结论成功制备了5-FU的多克隆抗体。     

人Fkbp19的多克隆抗体的制备

目的:制备针对人Fkbp19的多克隆抗体,为进一步研究Fkbp19基因的功能奠定基础。方法:利用鉴定正确的重组原核表达载体pET21a-Fkbp19,在大肠杆菌BL21-DE3中诱导表达,应用Ni-NTA亲和层析法获得纯度较高的原核表达蛋白,并免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot及免疫荧光的方法检测抗体对乳腺癌细胞中内源性Fkbp19蛋白的识别能力。结果:成功地在大肠杆菌中实现了His-Fkbp19融合蛋白的表达,经纯化后免疫家兔得到了高滴度的多克隆抗体,该抗体可以用Western blot的方法检测内源性Fkbp19蛋白。结论:所制备的多克隆抗体可以用于Fkbp19的Western blot检测。     

兔抗人细胞色素P450 1A2多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备兔抗人细胞色素P4501A2（CYP1A2）抗体及其特性鉴定。方法：利用生物信息学方法分析CYP1A2蛋白的序列，根据亲水性、抗原性、柔韧性及表面性等指标选择多肽序列，合成CYP1A2多肽，与载体蛋白钥孔戚血蓝素（Keyhole limpet hemocyanin，KLH）偶联，免疫日本大耳白兔制备抗CYP1A2抗体。辛酸-硫酸铵法纯化抗体，间接ELISA法测定抗体的效价及相对亲和力常数，Western blot鉴定其特异性，免疫组化进行定位。结果：获得针对小分子CYP1A2的抗体。该抗体效价为1∶16000；相对亲和力常数在10^5-10^6/M，具有实用价值；可与CYP1A2合成肽及天然CYP1A2出现特异性反应；可识别正常人肝脏组织CYP1A2；Western blot的结果显示，该抗体识别的相应抗原的相对分子质量为58000。结论：合成的多肽-KLH复合物具有免疫原性，可用于制备相应的抗体。制备的兔抗CYP1A2合成肽抗体可应用于酶联免疫吸附试验、免疫印迹、免疫组化实验。