巨噬细胞Coronin-1的表达与非Mtb源性自噬相关性的实验研究

目的:研究巨噬细胞Coronin-1与非Mtb源性细胞自噬的相关性及其可能信号通路。方法:分别构建过表达Coronin-1的p EGFP-C1-Coronin-1质粒和干扰Coronin-1表达的p Genesil-1-Coronin-1质粒,通过G418加压筛选其RAW264.7细胞稳定转染株,即Coronin-1高表达细胞株(RAW264.7-Cor.Plus)和Coronin-1低表达细胞株(RAW264.7-Cor.Minus)。将RAW264.7-Cor.Plus组、RAW264.7组和RAW264.7-Cor.Minus组细胞分别采取完全培养基(空白处理对照)、饥饿、雷帕霉素、环孢素A等因素处理后,通过RT-PCR法检测Beclin-1的基因转录水平,Western blot法检测Coronin-1、LC3BⅡ/LC3BⅠ及Beclin-1的蛋白表达水平。结果:Coronin-1过表达质粒和siRNA质粒均构建成功,其细胞稳定筛选株具有过表达或抑制表达Coronin-1特性。1空白处理三组细胞,Western blot法检测LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值:RAW264.7-Cor.Minus组RAW264.7组RAW264.7-Cor.Plus组;Western blot法检测Beclin-1:RAW264.7-Cor.Minus组RAW264.7组RAW264.7-Cor.Plus组;RTPCR法检测Beclin-1转录水平,趋势同Western blot;2饥饿处理三组细胞,LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值:RAW264.7-Cor.Minus组RAW264.7组RAW264.7-Cor.Plus组;3雷帕霉素处理RAW264.7细胞,其Coronin-1蛋白被显著抑制;雷帕霉素和环孢素A分别处理RAW264.7-Cor.Plus细胞,其LC3BⅡ/LC3BⅠ比值明显较空白处理组高。结论:巨噬细胞Coronin-1与非Mtb源性细胞自噬具有相关性。在营养充足状态下,Coronin-1可抑制细胞自噬;在饥饿状态下,Coronin-1可促进细胞自噬。Coronin-1对自噬的调控可能与m TOR和钙离子信号通路有关。     

自噬抑制剂巴弗洛霉素A1对巨噬细胞极化的影响

目的:探讨自噬下游抑制剂巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1,Baf A1)对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7极化的影响。方法:用Baf A1作用于小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,酶联免疫吸附实验检测M1/M2极化相关细胞因子的含量;流式细胞术检测细胞表面M1/M2极化相关标志物;免疫荧光观察自噬小体形成情况;Western blot检测自噬相关蛋白水平变化。结果:Baf A1处理后,RAW264.7细胞分泌的促炎性细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)显著增高(P0.01),而抑炎性细胞因子IL-10和IL-13的含量变化无显著差异。Baf A1处理的细胞表面标志物中CD197和HLA-DR(M1标志物)双阳性率与对照组相比显著升高(P0.05),说明Baf A1可以诱导巨噬细胞向M1方向极化。免疫荧光结果显示,Baf A1处理后细胞自噬小体显著增多(P0.05)。Western blot结果显示Baf A1处理后,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达显著升高(P0.05),而P62蛋白表达无显著差异。在自噬激活剂雷帕霉素处理组中,自噬体同样显著增多(P0.05),但P62蛋白表达显著降低(P0.05)。结论:巴弗洛霉素A1可以诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7向M1方向极化,可能与其抑制自噬下游自噬溶酶体的形成有关。     

骨巨细胞瘤细胞自噬特征及其对细胞增殖的影响

目的探讨骨巨细胞瘤细胞自噬特征及其对细胞增殖的作用。方法体外培养骨巨细胞瘤细胞(GCT-0404细胞),分别采用血清饥饿、雷帕霉素以及抑制剂氯喹进行处理,Western blot检测自噬相关蛋白LC3、Beclin 1的表达;免疫荧光显示细胞内自噬体的形成;倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化;CCK-8检测细胞的活性。结果血清饥饿、雷帕霉素以及氯喹干预GCT-0404细胞,可使LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化水平明显增高(P0.05);绿色荧光的斑点增多;而Beclin 1的表达水平无显著变化。同时,干预处理后细胞形态发生了显著变化,并抑制细胞增殖(P0.05)。结论血清饥饿、雷帕霉素以及抑制剂氯喹干预GCT-0404细胞所致自噬的发生及其自噬流的变化可参与对细胞增殖抑制的调控。     

睾酮对结核分枝杆菌感染的RAW264.7细胞自噬的影响

目的探讨睾酮对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染的鼠源巨噬细胞RAW264.7细胞自噬的影响及其分子机制。方法 MTB感染RAW264.7细胞24 h后,给予10~(-8)mol/L睾酮处理24 h;采用透射电镜观察细胞自噬情况,Western blot法检测细胞自噬相关蛋白以及MAPKs信号通路蛋白。结果睾酮干预MTB感染的RAW264.7细胞后自噬体、自噬特异标志物LC3Ⅱ均明显增加(P0.01),通路蛋白JNK磷酸化水平明显上调(P0.001)。结论睾酮可能通过激活JNK信号通路诱导MTB感染的RAW264.7细胞自噬。     

铜绿假单胞菌的信号分子3-oxo-C12-HSL促进小鼠MH-S肺泡巨噬细胞自噬

目的探讨3-oxo-C12-HSL对MH-S小鼠肺泡巨噬细胞自噬的影响。方法用Las I基因(3-oxo-C12-HSL合成基因)缺失型和野生型的铜绿假单胞菌(PA)菌株的培养物上清液以及化学合成的3-oxo-C12-HSL信号分子处理MH-S细胞,激光共聚焦荧光显微镜观察LC3-GFP荧光斑点以及Western blot检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值来监测自噬的形成,同时检测p62的降解以及氯喹对LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的影响来监测自噬流(autophagic flux)的变化。结果野生型PA菌株的培养物上清液使MH-S细胞LC3-GFP荧光斑点增多(P0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加(P0.01),LasⅠ基因缺失型PA菌株不能引起上述自噬相关指标的改变。化学合成的3-oxo-C12-HSL信号分子能够明显增加自噬体数量,上调LC3Ⅱ的表达(P0.01);自噬底物p62随着3-oxo-C12-HSL作用时间的延长而进行性降解,溶酶体抑制剂氯喹可增强3-oxoC12-HSL引起的LC3Ⅱ累积(P0.05,P0.01)。结论 3-oxo-C12-HSL可增加MH-S细胞的自噬水平。     

LC3-LpqH自噬靶向性抗结核DNA疫苗的制备

目的制备结核杆菌脂蛋白抗原前体LpqH基因与微管相关蛋白轻链3(LC3)基因融合的抗结核DNA疫苗,探究其诱导与靶向自噬的效应。方法构建pCMV-LpqH与pCMV-LC3-LpqH重组质粒并转染RAW264.7细胞,免疫印迹法检测LC-3与LC3-LpqH的表达。转染pCMV-LpqH或pCMV-LC3-LpqH至GFP-LC3-RAW264.7细胞,免疫荧光法观察LC3-LpqH蛋白的定位。结果细胞转染pCMV-LpqH后LC-3表达水平增高。pCMV-LC3-LpqH在RAW264.7细胞的表达水平与质粒浓度呈剂量依赖性,并且LC3-LpqH与GFP-LC3体外表达后共定位于自噬体上。结论 pCMV-LC3-LpqH的表达能够增强自噬,并将LpqH抗原靶向定位于自噬体,为设计新型抗结核疫苗提供了新思路。     

oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物通过激活AKT通路抑制小鼠RAW264.7细胞自噬

目的探讨氧化低密度脂蛋白/β2糖蛋白I/抗β2糖蛋白I抗体(oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体)复合物对RAW264.7小鼠巨噬细胞自噬的影响及机制。方法分别用培养基、 oxLDL、 oxLDL/β2GPI复合物、 oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物、 oxLDL/抗β2GPI抗体复合物和β2GPI/抗β2GPI抗体复合物处理RAW264.7细胞。采用Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、 P62的蛋白水平,采用携带双荧光蛋白和LC3基因的腺病毒(mRFP-GFP-LC3)感染巨噬细胞检测自噬体形成以及自噬流情况,采用蛋白激酶B(AKT)通路抑制剂LY294002 (50μmol/L)预处理,观察AKT通路在oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物介导的RAW264.7细胞自噬中的作用。结果 oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物能够降低LC3Ⅱ蛋白水平,减少自噬体数量,增加P62蛋白水平,阻断自噬流; LY294002预处理可部分恢复细胞自噬水平,改善自噬流阻断情况。结论oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物可以通过激活AKT通路抑制RAW264.7细胞的自噬。     

结核分枝杆菌Hsp16.3蛋白影响小鼠巨噬细胞自噬形成的实验研究

目的:观察热休克蛋白Hsp16.3对感染结核分枝杆菌(MTB)的巨噬细胞自噬体形成的作用.方法:以50 ng/μL雷帕霉素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬体形成后,用结核分枝杆菌毒株H37Rv感染巨噬细胞,再用Hsp16.3蛋白作用于巨噬细胞,电镜观察自噬体相成的变化,抗酸染色观察胞内细菌形态,计数MTB的菌落数.提取巨噬细胞总蛋白,Western blot方法检测自噬相关蛋白LC3表达水平的变化.结果:雷帕霉素诱导巨噬细胞形成自噬后感染结核分枝杆菌可使胞内细菌局限化,加入Hsp16.3蛋白可明显抑制了自噬体的形成,影响了结核分枝杆菌在巨噬细胞内的生存,显著增加了细菌的菌落形成单位,降低了自噬相关蛋白LC3的表达(P＜0.05).结论:Hsp16.3蛋白可能通过调节Atg8的表达水平抑制自噬体的形成.     

同型半胱氨酸通过激活beclin 1调节的自噬激活分子(AMBRA1)促进人肝细胞自噬

目的 探讨beclin 1调节的自噬激活分子(AMBRA1)在同型半胱氨酸(Hcy)引起肝细胞自噬中的作用。方法 体外培养肝细胞,分为对照组(0μmol/L Hcy处理)和100μmol/L Hcy处理组。Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3B(LC3BⅡ、 LC3BⅠ)的表达水平;使用(0、 25、 50、 100)μmol/L氯喹(CQ)处理肝细胞,CCK-8法检测CQ对肝细胞增殖的抑制作用,Western blot法检测LC3B和AMBRA1的表达;采用AMBRA1小干扰RNA感染肝细胞后,实时荧光定量PCR和Western blot法检测肝细胞AMBRA1表达干扰效率。敲低AMBRA1后肝细胞用Hcy处理,Western blot法检测LC3B蛋白表达水平,转染表达双荧光蛋白和LC3的腺病毒(mRFP-GFP-LC3),激光共聚焦显微镜观察细胞内自噬流的变化。结果 与对照组相比较,Hcy处理组LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值升高;50μmol/L CQ对肝细胞增殖的抑制率接近于50%;与对照组相比,Hcy组LC3BⅡ/LC3BⅠ比值、 AMBRA1的表达明...     

饥饿状态下Lewis细胞HMGB1的表达、定位与细胞自噬发生的相关性研究

目的探讨饥饿状态下小鼠肺癌细胞(Lewis)自噬的发生与高迁移率组蛋白B1(HMGB1)的相关性。方法分别用HBSS诱导Lewis自噬0、3、6及9 h,免疫荧光检测HMGB1在胞内表达水平及迁移情况;收集细胞及培养上清,Western blot检测微管相关蛋白轻链3(LC3)及其磷脂酰乙醇胺共轭物(LC3-Ⅱ)、泛素结合蛋白p62与高迁移率组蛋白(HMGB1)的表达水平;PCR检测Lewis细胞表面HMGB1配体RAGE、TLR2及TLR4的表达。结果免疫荧光显示,Lewis细胞饥饿6 h后HMGB1表达量增加并伴随从胞核向胞浆的迁移;Lewis细胞饥饿3 h后,Western blot结果显示,HMGB1及LC3-Ⅱ表达水平逐渐增加;Lewis细胞表面表达HMGB1的配体RAGE、TLR2及TLR4;利用重组的HMGB1蛋白刺激Lewis后细胞自噬明显增加。结论 HMGB1可以促进Lewis细胞自噬的发生。     

沉默HDAC6对嗜肺军团菌干扰RAW264.7自噬作用的影响

目的 以嗜肺军团菌感染HDAC6基因沉默的RAW264.7细胞为研究对象,检测自噬流及自噬相关因子表达水平的变化,探究HDAC6在嗜肺军团菌干扰巨噬细胞自噬中的作用机制。方法 利用RNAi技术介导基因沉默,构建shRNAHDAC6细胞,Western blot验证沉默效果。用嗜肺军团菌活菌和灭活菌[感染复数(MOI)=50]分别感染RAW264.7、sh-NC、shRNA-HDAC6细胞6、12、24 h。应用自噬双标质粒pmCherry-C1-EGFP-LC3B检测巨噬细胞自噬流的变化;透射电镜观察嗜肺军团菌感染24 h后各组细胞内的自噬小体和自噬溶酶体;实时荧光定量PCR及Western blot法检测AMBRA1、ATG9B、P62、Beclin1、α-tubulin、LC3B的表达水平。结果 与RAW264.7对照组相比,shRNA-HDAC6细胞的HDAC6蛋白表达水平显著降低(P<0.05);自噬双标质粒检测自噬流结果显示,嗜肺军团菌活菌及灭活菌感染RAW264.7细胞,自噬流均减弱,沉默HDAC6后嗜肺军团菌感染巨噬细胞自噬流增加。透射电镜可观察到嗜肺军团菌感染巨噬...     

脂多糖通过PI3K/Akt/mTOR通路调控巨噬细胞自噬*

 目的： 观察脂多糖对巨噬细胞自噬活化的影响及相关信号通路的探讨。方法: 体外培养巨噬细胞株RAW264.7,分为对照组、饥饿状态激活自噬组、单纯脂多糖（LPS）刺激组、LPS+PI3K抑制剂（hVps34）组和LPS+mTOR抑制剂（雷帕霉素）组。构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-GFP-LC3,转染巨噬细胞,通过荧光显微镜观察各组细胞中自噬体形成情况。qRT-PCR方法检测各组中与细胞自噬相关的Atg5、Atg7、LC3-II和Bnip3 mRNA表达水平的改变。利用Western blotting检测LC3-II、p-Akt和p-mTOR蛋白在各组中的表达情况,以评价LPS激活巨噬细胞自噬的分子通路。结果: 成功构建稳定表达GFP-LC3的巨噬细胞,在荧光显微镜下可以观察到自噬在饥饿状态组、LPS+hVps34组和LPS+雷帕霉素组均有明显增强;qRT-PCR检测到Atg5、LC3-II和Bnip3 mRNA的表达在饥饿状态组、LPS+hVps34组和LPS+雷帕霉素组均有明显增强,而在LPS组中略微下降;Western blotting 检测发现p-Akt在饥饿状态组、LPS组和LPS+雷帕霉素组中表达明显升高;p-mTOR在饥饿状态组、LPS+hVps34组和LPS+雷帕霉素组表达明显下降;LC3-II的表达在饥饿状态组、LPS+hVps34组和LPS+雷帕霉素组中表达要高于对照组和LPS组。结论: LPS参与巨噬细胞自噬的调控,其可能的信号通路为PI3K/Akt/mTOR通路,但仍存在其它有效的调控通路。     

氯喹调控视网膜神经节细胞自噬的研究

目的:探究氯喹对CoCl_2诱导的视网膜神经节细胞凋亡的保护作用。方法:小鼠视网膜神经节细胞RGC-5细胞加入300μmol/L CoCl_2及30μmol/L氯喹处理24 h后,采用qPCR、Western blot、flow cytometry及MTT法分别检测自噬相关基因Beclin1、LC3b、Atg5、Atg7、自噬相关蛋白LC3、凋亡相关蛋白Caspase-3的表达、细胞凋亡率和细胞存活率。结果:相比于单纯CoCl_2组,CoCl_2及氯喹处理后的RGC-5细胞中,相关基因Beclin1、LC3b、Atg5、Atg7、自噬相关蛋白LC3B、凋亡相关蛋白Caspase-3均被明显抑制(P0.05),细胞凋亡率显著下降(P0.05),细胞存活率明显升高(P0.05)。结论:自噬抑制剂氯喹抑制CoCl_2导致的细胞自噬和凋亡,从而保护视网膜神经节细胞。     

AZD5363诱导肝癌细胞凋亡与自噬的实验研究

目的:研究新型Akt抑制剂AZD5363对人肝癌HepG2和Huh7细胞活力、凋亡和自噬的影响,并探讨其抗肿瘤活性的分子机制。方法:采用不同浓度AZD5363作用于体外培养的HepG2和Huh7细胞,MTT法检测细胞活力;TUNEL标记法检测肝癌细胞凋亡的变化;Western blot实验分析细胞凋亡相关蛋白多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase,PARP]及自噬标志蛋白LC3-II的表达水平;细胞转染GFP-LC3绿色荧光蛋白融合表达质粒检测细胞自噬。结果:AZD5363能够剂量依赖性地抑制HepG2和Huh7细胞活力,并通过促进PARP的切割而诱导肝癌细胞发生凋亡;肝癌细胞给予AZD5363后,细胞内GFP-LC3融合蛋白斑点增多,同时LC3-II的表达水平增加(P 0.05);当用氯喹阻断自噬后,AZD5363对肝癌细胞凋亡的诱导作用明显增强。结论:AZD5363可促进HepG2和Huh7细胞发生凋亡和保护性自噬。抑制自噬促进了AZD5363诱导的肝癌细胞凋亡。     

miR-142-3p 靶向ATG4c 调控RAW264.7 巨噬细胞自噬

目的:研究miR-142-3p 对自噬相关基因ATG4c 的靶向调控作用,探究miR-142-3p 影响RAW264.7 细胞自噬途径的作用机制。方法:生物信息学软件分析miR-142-3p 的靶基因为ATG4c,构建pMIR-Report-ATG4c 和pMIR-Report-ATG4c mut 重组质粒,双荧光素酶报告系统、qRT-PCR、Western blot 验证miR-142-3p 与ATG4c 的靶向作用;将做不同处理的RAW264.7 细胞分为4 组:正常细胞作为对照、50 ng/ ml 雷帕霉素作用2 h、EBSS 饥饿作用12 h、10 nmol/ L 的3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用12 h 后,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-142-3p 不同干预组中的相对表达情况;将miR-142-3p mimics、miR- 142-3p inhibitor 及miR-142-3p control 分别转染到RAW264.7 细胞中,检测miR-142-3p 和LC3域的相对表达。结果:双荧光素酶报告系统、qRT-PCR、Western blot 验证miR-142-3p 通过靶向作用于ATG4c 的3忆-UTR 抑制其表达;与对照组相比,雷帕霉素和饥饿处理的RAW264.7 细胞miR-142-3p 明显上调,而3-MA 处理组miR-142-3p 明显下调;与miR-142-3p control 组相比,转染miR-142-3p mimics 组中LC3域蛋白表达显著下调,而miR-142-3p inhibitor 组中表达显著上调。结论:miR-142-3p 通过靶向调控自噬相关基因ATG4c,参与RAW264.7 小鼠巨噬细胞自噬的调控。     

脂多糖诱导小鼠腹腔巨噬细胞parkin表达及线粒体自噬形成

目的:探讨巨噬细胞在脂多糖(LPS)处理后parkin表达及对线粒体自噬的影响。方法:无菌分离并原代培养小鼠腹腔巨噬细胞;200 ng/ml LPS作用巨噬细胞,JC-1标记线粒体,流式细胞仪检测线粒体膜电位变化;RT-PCR检测巨噬细胞parkin mRNA水平;Western blot检测parkin及自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达水平;激光共聚焦显微镜分别检测巨噬细胞在LPS处理前后parkin在细胞内的分布及与LC3和线粒体三者的共定位情况。结果:JC-1染色流式细胞仪检测结果显示,LPS处理后,巨噬细胞线粒体膜电位降低,并随LPS作用时间延长呈持续下降趋势;parkin mRNA在LPS处理6 h内仅有少量的增加,但parkin蛋白水平在LPS刺激6 h后增加明显;parkin在巨噬细胞定位结果表明,未受LPS处理时parkin呈弥散均匀分布,而LPS刺激后parkin呈明显的点状聚集;Western blot检测结果显示巨噬细胞在LPS刺激后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例增大,表明巨噬细胞发生明显的自噬;激光共聚焦显微镜结果显示,巨噬细胞在LPS刺激后,parkin、LC3和线粒体三者存在共定位关系。结论:巨噬细胞在LPS刺激后,parkin表达增加并介导线粒体自噬形成,参与对损伤线粒体的清除,可能在巨噬细胞参与的炎症反应中发挥一定的调控作用。     

TLR4介导可溶性尿酸诱导的肾小管上皮细胞自噬流异常

目的:探寻Toll样受体4(TLR4)与可溶性尿酸诱导肾小管上皮细胞HK-2自噬的关系。方法:用可溶性尿酸或/和氯喹(CQ)刺激HK-2细胞,采用Western blot检测LC3-Ⅱ和P62的表达水平,通过透射电子显微镜观察细胞内自噬小体及自噬溶酶体形成。在可溶性尿酸刺激HK-2细胞的基础上加上TLR4抑制剂TAK242后采用RT-qPCR检测TLR4的mRNA表达水平,Western blot检测TLR4、LC3-Ⅱ和P62的蛋白水平,并通过自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)标记观察细胞内自噬流的变化。结果:可溶性尿酸可诱导HK-2细胞LC3-Ⅱ和P62的表达上调,其与CQ共同处理后LC3-Ⅱ及P62的表达进一步增加,透射电子显微镜下观察到自噬小体增多,自噬溶酶体少见,提示自噬流受阻。Western blot结果显示,与正常对照组相比,可溶性尿酸组TLR4、LC3-Ⅱ和P62的蛋白水平增高,而TAK242则抑制可溶性尿酸诱导HK-2细胞的TLR4、LC3-Ⅱ和P62的表达水平。自噬双标腺病毒实验结果显示,可溶性尿酸组与对照组相比,自噬小体显著增多,且自噬溶酶体较少;而与可溶性尿酸组相比,TAK242+可溶性尿酸组自噬小体减少,自噬溶酶体相对增多,表明自噬小体与溶酶体融合现象增多,形成自噬溶酶体的进程更顺畅。结论:可溶性尿酸导致肾小管上皮细胞自噬流受阻;同时,可溶性尿酸可通过TLR4介导肾小管上皮细胞自噬流异常。     

CP-25调控巨噬细胞来源的外泌体分泌对子宫内膜癌Ishikawa细胞系自噬性细胞死亡的影响

目的：探讨芍药苷-6’-O-苯磺酸酯（CP-25）通过调控巨噬细胞来源的外泌体对子宫内膜癌Ishikawa细胞自噬性细胞死亡的影响。方法：使用佛波酯（PMA）将人单核细胞THP-1诱导为巨噬细胞，并提取其外泌体，透射电子显微镜观察外泌体形态，Western blot鉴定外泌体标志蛋白表达；使用不同浓度CP-25(0.1、0.5、1.0μmol/L)干预巨噬细胞外泌体，并与Ishikawa细胞共培养24 h,CCK-8法检测各处理组Ishikawa细胞活性，Transwell小室检测各处理组Ishikawa细胞的迁移与侵袭；以自噬抑制剂3-MA干预细胞，实验分为对照组、3-MA组、Exo-CP-25组、3-MA+Exo-CP-25组，进行对应处理后，Hoechst 33342染色观察各处理组Ishikawa细胞凋亡形态，流式细胞术检测各处理组Ishikawa细胞凋亡率，透射电子显微镜观察各处理组Ishikawa细胞自噬体，免疫荧光染色检测各处理组Ishikawa细胞自噬相关标志物LC3表达，Western blot检测各处理组Ishikawa细胞自噬相关蛋白表达。结果：经鉴定成功分离了诱...     

雷公藤甲素通过ERK通路诱导肺癌A549细胞自噬

目的:研究雷公藤甲素(tripchlorolide,TP)对肺癌A549细胞活力及自噬的影响,并初步探讨其作用机制。方法:应用TP作用于肺癌A549细胞后,MTT法检测细胞活力;吖啶橙染色(AO)法在荧光显微镜下观察细胞自噬状态;GFP-LC3质粒转染实验观察细胞胞质中绿色点状聚集的自噬小体;Western blot法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达情况及有关的信号通路ERK蛋白水平的变化。结果:TP可以显著抑制肺癌A549细胞的增殖(P0.05),并呈一定的剂量-时间依赖关系。TP作用于肺癌A549细胞48 h后,细胞内酸性滤泡染成亮红色荧光比例增多。GFP-LC3转染实验结果显示在100 nmol/L TP处理后,细胞胞质中出现绿色点状聚集的自噬小体,而正常培养组极少细胞有自噬小体形成;同时转染GFP-control质粒的细胞在100 nmol/L TP处理及正常培养条件下均未观察到点状聚集的自噬小体产生。TP作用于肺癌A549细胞48 h后,与对照组相比,100 nmol/L TP组LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著升高(P0.01),同时p-ERK/ERK蛋白水平也显著升高(P0.01);与100 nmol/L TP组相比,TP+3-MA组LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著下降(P0.01),同时p-ERK/ERK蛋白水平也显著下降(P0.01)。结论:TP可显著抑制肺癌A549细胞活力并诱导细胞发生自噬,这种作用可能与影响ERK的磷酸化有关。     

槲皮素通过Akt-mTOR途径上调高糖培养RSC96细胞的自噬

目的探讨槲皮素对高糖离体培养的RSC96细胞自噬变化规律的影响。方法 RSC96细胞培养于含有槲皮素的高糖培养基中,超微结构应用透射电子显微镜观察,用免疫荧光法、Western blot法检测Beclin1、LC3Ⅱ、磷酸化的Akt及磷酸化的m TOR蛋白表达,用实时荧光定量PCR法检测Beclin1 mRNA和LC3B mRNA的转录。结果高糖造成RSC96细胞Beclin1和LC3Ⅱ的表达下调,增加Akt和m TOR的磷酸化水平(P0.05,P0.01),造成病理形态改变,减少自噬体数量。槲皮素能够上调Beclin1和LC3Ⅱ的表达,下调Akt和m TOR的磷酸化水平(P0.05,P0.01),修复病理损伤,增加自噬体数量。结论槲皮素通过下调Akt-m TOR途径磷酸化水平而增加高糖培养RSC96细胞的自噬。