瘢痕疙瘩与正常皮肤的蛋白质组学研究

目的 通过比较瘢痕疙瘩与正常皮肤组织的蛋白质组表达差异,筛选出与瘢痕疙瘩产生相关的蛋白质.方法 2010年1月至6月运用蛋白质组学技术,对8例瘢痕疙瘩组织和3例正常皮肤组织进行差异双向凝胶电泳(2D-DIGE),选择差异蛋白质斑点,进行基质辅助激光解离飞行时间(MALDI-TOF/TOF)质谱分析和生物学信息分析.结果 成功建立瘢痕疙瘩和正常皮肤组织的双向凝胶电泳图谱,瘢痕疙瘩和正常皮肤组织凝胶电泳图谱中平均蛋白质斑点数分别为2978和3053,其中表达差异超过4倍的斑点共有40个,质谱分析和数据库检索共鉴定出32种蛋白质,包括上调蛋白有20种,下调蛋白有12种.从功能上可分为载体蛋白(3种)、信号转导蛋白(4种)、增殖凋亡相关蛋白(2种)、细胞骨架蛋白(6种)、细胞外基质蛋白(8种)、免疫因子(3种)、肿瘤相关蛋白(2种)和未知功能蛋白(4种).结论 蛋白质组学能较好地显示瘢痕疙瘩与正常皮肤组织间的蛋白质表达差异.对这些差异蛋白质进一步深入研究,将有助于揭示瘢痕疙瘩的发病机制,也为发现新的治疗靶点提供线索和依据.

Abstract：

Objective To investigate and search correlative proteins of keloid by comparing the results of differential proteomic analysis between keloid and normal skin. Methods From January 2010 to June 2010 two-dimensional gel electrophoresis was used to define patterns of protein expression in keloid skin from 8 patients and matched normal skin from 3 patients. Differential expression protein spots were showed and analyzed by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flying/time of flying(MALDI-TOF/TOF) mass spectrometry. Results This study succeeded to provide a two-dimensional protein profiling comparison between normal skin and keloid. Gel-analysis software identified an average of 2978 spots in keloid while 30S3 spots in normal skin and statistical filtering yielded 40 spots of a 4-fold change, 32 of which were identified by using mass spectrometry, 20 were up-regulated and 12 were down-regulated. Functional analysis revealed that these proteins could be fractionated to carrier proteins (3 proteins), signal transduction proteins (4 proteins) , proliferation and apoptosis related proteins (2 proteins) , cytoskeleton proteins(6 proteins) , extracellular matrix proteins(8 proteins) , immunity related proteins (3 proteins) , tumor related proteins (2 proteins) , and function unknown protein (4 proteins). Conclusions Proteomic analysis can identify the proteins with variance of keloid versus normal skin. The further research to these differential proteins may help reveal the pathogenesis of keloid and provide new treatments for keloid.     

增生性瘢痕与正常皮肤差异基因的筛选

目的 用人类基因制作的芯片，分析增生性瘢痕与正常皮肤组织之间基因表达的差异，筛选瘢痕形成过程中表达显著的差异基因。方法 选择4例烧伤后6个月、瘢痕严重增生挛缩的患者，取增生性瘢痕与自体正常皮肤进行对照，分成4组，提取各个标本的总DNA与RNA，制成荧光标记的cDNA探针，与含4000个人类靶基因的芯片(1500个为已知基因，2500个为未报道或未知功能的基因)杂交，经扫描，生物信息学分析，比较两种组织间的差异表达。结果增生性瘢痕与正常皮肤的表达差异的基因在4个组间仅出现1次的有378～451个，重复2次出现的有203～301个，3例标本中均有显著差异表达基因数为114～152个，4例标本中均出现差异的基因则有97个，其中以上调为主，涉及13大类基因，包括抑癌与原癌基因，细胞凋亡，细胞骨架与运动蛋白，细胞周期类蛋白等，有些为已知基因，有些仍未知功能。结论增生性瘢痕与皮肤的基因图谱存在差别，这些基因可能参与了增生性瘢痕的形成过程。     

Differential expression of cyclooxygenases in hypertrophic scar and keloid tissues

Hypertrophic scar (HS) and keloid (KL) are two forms of an abnormal cutaneous scarring process, mainly characterized by excessive extracellular matrix deposition and fibroblast proliferation. Despite the increased understanding of the molecular and cellular events leading to HS and KL, the pathogenesis of these lesions remains poorly understood. A pivotal role in the formation of abnormal scars has been ascribed to transforming growth factor-β, whose activity appears to be mediated through a link with pathways acting via cyclooxygenases (COX-1 and COX-2). To date, there is no report on the in vivo expression of COX-1 and COX-2 in human HS and KL tissues. Therefore, using immunohistochemistry and Western blot analysis, we investigated 36 cases of KL, 32 cases of HS, and 25 cases of normal skin in order to define the localization and distribution of COX-1 and COX-2 in the tissues of these scar lesions and the overlying epidermis. The results mainly show the following: (a) a significant overexpression of COX-1 in HS tissues and the overlying epidermis as compared with normal skin and KL tissues and (b) a significant overexpression of COX-2 in KL tissue and the overlying epidermis in contrast to normal skin and HS tissues. Our data support the hypothesis that both COXs are involved in the pathogenesis of scar lesions in different ways and, particularly, COX-1 in the formation of HS and COX-2 in the formation of KL. In addition, the overexpression of COX-1 and COX-2 in the epidermis overlying HS and KL tissues, respectively, underlines the importance of epithelial–mesenchymal interactions in the pathogenesis of scar lesions.     

增生性瘢痕相关基因的筛选

目的利用基因芯片技术寻找增生性瘢痕形成过程中的相关基因,并发现相关基因间的相互关系,探讨增生性瘢痕的机理.方法选择6例标本,3例增生性瘢痕与3例正常皮肤,分成3组,提取各个标本的总DNA,制成荧光标记的cDNA探针,与含4000个人类靶基因的芯片(1500个为已知基因,2500个为未报道或未知功能的基因)杂交,经扫描、生物信息学分析比较两种组织间的差异表达.结果增生性瘢痕与正常皮肤的差异表达基因在3组间仅出现1次的有396个、重复2次出现的有186～242个、共同出现的有116个,其中上调108个、下调8个,涉及13大类基因,包括抑癌与原癌基因、细胞凋亡、细胞骨架与运动蛋白、细胞周期类蛋白等,有些为已知基因,有些仍未知其功能.结论基因芯片扫描对研究增生性瘢痕有效可靠,发现多种基因参与了增生性瘢痕的形成过程.     

增生性瘢痕相关基因的筛选

目的　利用基因芯片技术寻找增生性瘢痕形成过程中的相关基因 ,并发现相关基因间的相互关系 ,探讨增生性瘢痕的机理。方法　选择 6例标本 ,3例增生性瘢痕与 3例正常皮肤 ,分成 3组 ,提取各个标本的总DNA ,制成荧光标记的cDNA探针 ,与含 4 0 0 0个人类靶基因的芯片 ( 15 0 0个为已知基因 ,2 5 0 0个为未报道或未知功能的基因 )杂交 ,经扫描、生物信息学分析比较两种组织间的差异表达。结果　增生性瘢痕与正常皮肤的差异表达基因在 3组间仅出现 1次的有 3 96个、重复 2次出现的有 186～ 2 4 2个、共同出现的有 116个 ,其中上调 10 8个、下调 8个 ,涉及 13大类基因 ,包括抑癌与原癌基因、细胞凋亡、细胞骨架与运动蛋白、细胞周期类蛋白等 ,有些为已知基因 ,有些仍未知其功能。结论　基因芯片扫描对研究增生性瘢痕有效可靠 ,发现多种基因参与了增生性瘢痕的形成过程     

瘢痕疙瘩与增生性瘢痕基因的异同

瘢痕疙瘩（Keloid,K）与增生性瘢痕（Hyperpladtic Scar,HS）是病理性瘢痕（hbnormal Scar,AS）的两种表现形式,其产生机制尚不明确。本文从K和HS所涉及的基因出发,探讨其基因表达的异同。     

人体正常皮肤及增生性瘢痕胶原酶活性的检测

为探讨胶原降解代谢在增生性瘢痕形成中的作用,对23例患增生性瘢痕的成年病人的瘢痕组织(其中8例经病理检查)及正常皮肤的胶原酶活性作了检测和比较观察。检测结果:瘢痕组织的胶原酶活性平均值为197.09±48.10(U),正常皮肤胶原酶活性平均值为73.17±13.71(U),二者差异有非常显著意义(P<0.01)。表明增生性瘢痕的形成不仅与胶原的过度合成与沉积有关,同时与胶原降解代谢减少有关。     

增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中PKC活性测定

目的　测定增生性瘢痕和瘢痕疙瘩等瘢痕组织中PKC活性变化,探讨PKC在瘢痕形成中的作用。方法　利用PKC活化后催化底物多肽磷酸化,然后计数底物中掺入32P的放射活性的原理,测定增生性瘢痕、瘢痕疙瘩、成熟瘢痕和正常皮肤组织中PKC活性。结果　增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中PKC的活性显著高于成熟瘢痕和正常皮肤(P＜0.001,分别高出正常皮肤318.30%和519.07%),瘢痕疙瘩高于增生性瘢痕(P＜0.001,高出48.60%)而成熟瘢痕和正常皮肤间没有差异(P＞0.05)。结论　瘢痕组织中PKC活性升高且与增生程度相关,提示PKC可能参与了细胞增殖和合成物质的信号转导。     

增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中PTK活性测定

目的测定增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中PTK活性变化,探讨PTK在瘢痕形成中的作用。方法利用活化的PTK催化底物多肽磷酸化,再计数底物中掺入32P的放射活性的原理,测定增生性瘢痕、瘢痕疙瘩、成熟瘢痕和正常皮肤组织中PTK活性。结果增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中PTK的活性显著高于正常成熟瘢痕和正常皮肤（P＜0.001,分别高出正常皮肤150.80%和313.80%）,瘢痕疙瘩高于增生性瘢痕（P＜0.001,高出65.01%）而成熟瘢痕和正常皮肤间没有差异（P＞0.05）。结论瘢痕组织中PTK活性升高且与增生程度相关,PTK介导生长刺激的信号转导使细胞增殖和合成物质的功能增强而发生瘢痕增生。     

增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中PKC活性测定

目的　测定增生性瘢痕和瘢痕疙瘩等瘢痕组织中PKC活性变化 ,探讨PKC在瘢痕形成中的作用。方法　利用PKC活化后催化底物多肽磷酸化 ,然后计数底物中掺入32 P的放射活性的原理 ,测定增生性瘢痕、瘢痕疙瘩、成熟瘢痕和正常皮肤组织中PKC活性。结果　增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中PKC的活性显著高于成熟瘢痕和正常皮肤 (P <0 .0 0 1,分别高出正常皮肤 318.30 %和 5 19.0 7% ) ,瘢痕疙瘩高于增生性瘢痕 (P <0 .0 0 1,高出 48.6 0 % )而成熟瘢痕和正常皮肤间没有差异 (P >0 .0 5 )。结论　瘢痕组织中PKC活性升高且与增生程度相关 ,提示PKC可能参与了细胞增殖和合成物质的信号转导     

FGFR1在增生性瘢痕和正常皮肤中的表达

目的研究FGFR1在增生性瘢痕和正常皮肤中表达的差异.方法用免疫组织化学、Western-blot、流式细胞仪分析等方法检测FGFR1在增生性瘢痕和正常皮肤组织及相关细胞中的表达差异以及在成纤维细胞中的亚细胞分布状况.结果 FGFR1阳性细胞主要存在于角质形成细胞、汗腺、皮脂腺、血管内皮细胞及成纤维细胞等,细胞爬片观察到阳性颗粒主要位于细胞核,细胞浆中不如细胞核中明显.FGFR1在单个细胞中的表达量无明显差异.结论 FGFR1在增生性瘢痕和正常皮肤中表达无差异.     

FGFR1在增生性瘢痕和正常皮肤中的表达

目的　研究FGFR1在增生性瘢痕和正常皮肤中表达的差异。方法　用免疫组织化学、Western -blot、流式细胞仪分析等方法检测FGFR1在增生性瘢痕和正常皮肤组织及相关细胞中的表达差异以及在成纤维细胞中的亚细胞分布状况。结果　FGFR1阳性细胞主要存在于角质形成细胞、汗腺、皮脂腺、血管内皮细胞及成纤维细胞等 ,细胞爬片观察到阳性颗粒主要位于细胞核 ,细胞浆中不如细胞核中明显。FGFR1在单个细胞中的表达量无明显差异。结论　FGFR1在增生性瘢痕和正常皮肤中表达无差异     

CTGF在病理性瘢痕中的表达及意义

目的：了解细胞生长因子（connective tis sue growth factor，CTGF）在病理性瘢痕中的表达及意义，探讨它在病理性瘢痕发病机制中所起的作用.方法：对11例增生性瘢痕、10例瘢痕疙瘩及10例正常皮肤组织进行免疫组化（SP法）染色，观察CTGF在正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中的表达，以了解它们在不同组织中表达的差异性.结果：正常皮肤中CTGF的表达为阴性;增生性瘢痕、瘢痕疙瘩成纤维细胞中CTGF的表达与正常皮肤相比均有显著性差异（P＜0.01）;CTGF在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达较增生性瘢痕为高，但两者之间没有统计学差异.结论：CTGF在增生性瘢痕的发病机制中发挥重要作用。     

增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达的改变及意义

目的检测增生性瘢痕（Ｈ）和瘢痕疙瘩（Ｋ）组织中ＴＧＦβ１及Ⅰ、Ⅲ型前胶原ｍＲＮＡ的表达,了解其相互关系及意义。方法斑点杂交分析检测Ｈ和Ｋ组织中Ⅰ、Ⅲ前胶原及ＴＧＦβ１ｍＲＮＡ稳态水平的改变;原位杂交检测ＴＧＦβ１ｍＲＮＡ在组织中的空间分布。结果①Ｋ和Ｈ组织中ＴＧＦβ１ｍＲＮＡ稳态水平明显高于Ｎ组和Ｓ组;②Ｋ选择性Ⅰ型前胶原ｍＲＮＡ表达增强,而Ｈ组织中Ⅰ、Ⅲ前胶原ｍＲＮＡ表达均增强。结论ＴＧＦβ１在Ｈ和Ｋ的发病机理中起了重要作用,Ｋ和Ｈ发生发展中具有不同的分子机理。     

瘢痕疙瘩成纤维细胞差异蛋白的初步分析

目的:筛选瘢痕疙瘩差异表达蛋白,为临床诊断提供实验依据。方法:以瘢痕疙瘩为实验组,正常皮肤组织为对照组,同时提取两组蛋白质,经初步消化、过柱、洗脱、收集后,加样到WCX2蛋白质芯片上,蛋白质芯片采用蛋白质芯片阅读机(PBSII-C型)读取数据。结果:实验结果表明瘢痕疙瘩组织相比较正常皮肤组织,蛋白芯片捕获262个蛋白峰。其中有33个蛋白质在瘢痕疙瘩成纤维细胞中出现明显的变化,有11个标志蛋白在瘢痕疙瘩成纤维细胞中高表达,22个标志蛋白相对正常皮肤是低表达。结论:运用SELDI分析了瘢痕疙瘩差异蛋白质,这些差异蛋白可为将来确定瘢痕疙瘩诊断标志物提供依据。     

增生性瘢痕胶原降解与形态学的观察

目的　探讨胶原降解和瘢痕形态结构在增生性瘢痕形成中的作用。方法　应用SDS 聚丙烯酰胺凝胶加胶原底物电泳、氨基酸分析法和复合染色法 ,观测增生性瘢痕组织中胶原酶活性、胶原降解和瘢痕的组织形态。　结果　增生性瘢痕组织胶原纤维排列紊乱 ,胶原纤维间有大量的酸性粘多糖 ,紧密包绕胶原纤维 ,胶原酶活性明显下降 ,胶原降解减少。　结论　胶原酶活性降低 ,酸性粘多糖阻止胶原酶对胶原的降解可能是胶原降解减少和瘢痕形成的重要原因     

肝细胞生长因子对正常皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞的影响

目的:采用携带肝细胞生长因子(HGF)腺病毒转染正常皮肤成纤维细胞(NFB)和增生性瘢痕成纤维细胞(HFB)后,观察HGF对这两种细胞作用的差异,为HGF基因治疗病理性瘢痕提供理论基础。方法:分离培养HFB和NFB,以不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒(Ad-GFP)转染细胞,用流式细胞仪检测转染效率;以MOI为100携带HGF基因的腺病毒(Ad-HGF)转染HFB和NFB48h后,酶联免疫吸附法检测细胞上清中HGF、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达;应用免疫组织化学方法检测正常皮肤和增生性瘢痕组织中MMP-1和TGF-β1的分布。结果:NFB和HFB在腺病毒转染效率和HGF表达方面差异无显著性,但HGF能明显促进HFB分泌MMP-1,抑制HFB表达TGF-β1。结论:促进HFB分泌MMP-1和抑制HFB表达TGF-β1可能是HGF治疗病理性瘢痕的细胞和分子生物学基础。