人抗肌萎缩蛋白Dp71 shRNA载体构建与检测

目的：构建有效针对人Dystrophin Dp71基因的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)真核表达载体，并验
证其干扰效果。方法：设计合成3对针对人Dystrophin Dp71基因的和1对无同源性的siRNA片段，在两端和中间加上酶
切位点和Loop环。将合成的DNA片段插入到干扰载体pRNAT-U6.1/Neo中，经过酶切和测序验证，成功构建人Dp71基
因的shRNA和空白对照载体。将各干扰载体和空白载体转染人正常胃黏膜上皮细胞(gastric epithelial cells，GES-1)和人
支气管上皮细胞(human bronchial epithelium，HBE)，Western印迹检测Dp71 shRNA真核表达载体的干扰效率。结果：酶
切和测序验证均表明各Dp71-shRNA载体构建成功。将空载体及各Dp71 shRNA载体分别转染GES-1和HBEC，和空白细
胞对照及shRNA空白载体组相比，3组Dp71-shRNA能够明显抑制Dp71蛋白表达，但是3组质粒的抑制效率有一定的差
异，以Dp71 shRNA2对Dp71表达的干扰效率最强。结论：成功构建了3个有效针对人Dystrophin Dp71基因的shRNA 干
扰载体，3组质粒都能有效地抑制Dp71在GES-1和HBEC中的表达，其中以Dp71-shRNA2的抑制效率最高。     

人FoxA1 shRNA载体构建与检测

目的构建有效的针对人FoxA1基因的shRNA干扰载体,并验证其干扰效果。方法设计合成3对针对人FoxA1基因的和1对无同源性的shRNA片段,将合成的shRNA片段插入到干扰载体pRNAT-U6.1/Neo中,经过酶切和测序验证,成功构建人FoxA1基因的shRNA和空白对照载体。将各干扰载体和空白载体转染人正常胃黏膜上皮细胞(GES-1)和胃癌细胞(SGC-7901),Realtime RT-PCR和Western-blotting检测干扰载体的干扰效率。结果①酶切和测序验证均表明各shRNA载体构建成功。将空载体及各干扰载体分别转染人正常胃黏膜细胞(GES-1)和胃癌细胞(SGC-7901)发现,和空白对照组相比,3组干扰载体能够从mRNA和蛋白表达水平明显抑制FoxA1的表达,但是3组质粒的抑制效率有一定的差异,以3号质粒对Foxa1的干扰效率最强。结论成功构建了三个有效的针对人FoxA1基因的shRNA干扰载体,三组质粒都能有效地抑制FoxA1在GES-1细胞和SGC-7901细胞中的表达。     

靶向hVEGF165基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

目的 构建编码hVEGF165 mRNA的shRNA质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法 以hVEGF165 mRNA编码区中第5和第7外显子序列作为RNA干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体并通过PCR进行鉴定.经鉴定后分别转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞,实时荧光定量PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果.结果 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出预期条带,构建成功.靶向hVEGF165基因的shRNA对所转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞中hVEGF165基因mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中shRNA2最为明显.结论 成功构建了靶向hVEGF165基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2质粒.     

人AQP1-shRN A 表达质粒载体的构建与筛选

目的：构建针对人水通道蛋白1（AQP1）基因的shRNA表达质粒载体,并验证其干扰效果,为进一步探讨AQP1基因对人乳腺癌细胞的作用及机制建立基础。方法设计合成4对针对人AQP1基因不同位点的shRNA片段,通过DNA重组技术将其插入载体GV115中,构建AQP1‐shRNA重组质粒,转染人乳腺癌MCF‐7细胞,并通过实时荧光定量 PCR（RT‐PCR）和Western blot法检测干扰效率。结果 RT‐PCR法证实AQP1在乳腺癌 MCF‐7细胞中有表达。测序验证表明4对靶向AQP1‐shRNA表达载体均构建成功。4组干扰载体能够从基因和蛋白表达水平不同程度抑制 AQP1表达,其中以AQP1‐shRNA 4对AQP1的干扰效率最强。结论成功有效地构建了针对人AQP1基因的shRNA重组质粒,能够有效抑制人乳腺癌细胞MCF‐7中A Q P1的表达。     

SPAG6基因RNAi慢病毒载体的构建及其对SKM-1细胞凋亡的影响

目的 构建SPAG6-shRNA慢病毒载体靶向沉默SPAG6基因,探讨SPAG6基因沉默对人骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)细胞株SKM-1细胞增殖及凋亡的影响.方法 设计并构建3条针对SPAG6基因的shRNA质粒表达载体,共转染293T细胞后得到可表达SPAG6基因RNAi的慢病毒载体.转染SKM-1细胞,利用流式细胞术检测转染效率,qRT-PCR及Western blot验证SPAG6基因干扰效果,筛选最佳靶点.CCK-8法检测SPAG6基因沉默对SKM-1细胞生长的影响,流式细胞术检测细胞凋亡.结果 成功构建SPAG6-shRNA慢病毒载体,流式细胞术检测转染效率均在60％以上.qRT-PCR及Western blot检测结果显示SPAG6-shRNA3慢病毒载体敲除效率最高,为最佳靶点.SPAG6基因干扰后,干扰组SKM-1细胞的增殖明显受抑,抑制率为(60.18 ±0.37)％,与阴性对照组相比差别有统计学意义(P＜0.05).干扰组SKM-1细胞凋亡率为(16.32±5.80)％,显著高于阴性对照组[(4.28±0.88)％,P =0.024]及空白对照组[(3.08±1.50)％,P=0.019].结论 SPAG6-shRNA慢病毒载体能有效降低SPAG6基因表达水平,抑制SKM-1细胞增殖并促进其凋亡.     

人睾丸特异表达基因TDRG1shRNA表达载体的构建及其表达

目的:构建人睾丸基因TDRG1 的shRNA 表达质粒, 并研究其在NTE-2 细胞中的表达。方法:设计合成有短发夹结构靶位TDRG1 基因的寡核苷酸, 经退火成双链, 克隆至载体pGPU6/GFP/Neo 中, 构建TDRG1shRNA 表达载体, 得到重组质粒TDRG1-shRNA486, TDRG1-shRNA738, TDRG1-shRNA921 和一个阴性对照, 使用Lipofectamine^TM 2000 转染shRNA 至NTE-2 细胞, 应用RT-PCR 法检测转染后NTE-2 细胞TDRG1 mRNA 的表达水平。结果:经测序证实, 插入的DNA 片段的序列与设计序列完全一致。同时筛选到转染TDRG1-shRNA486 的NTE-2 细胞TDRG1 基因的mRNA 表达水平明显抑制。结论:成功构建了人类睾丸基因TDRG1 的shRNA 表达载体, TDRG1-shRNA 在NTE-2 细胞内成功表达。     

人EFNB2基因shRNA表达载体的构建及表达

目的:构建针对人EFNB2基因的特异性shRNA真核表达载体,并在宫颈癌Hela细胞中表达.方法:运用基因工程技术构建pEFNB2-shRNA载体,转染Hela细胞,通过RT-PCR及Western blot检测干扰效率,筛选抑制作用明显的载体.结果:构建获得的pEFNB2-shRNA表达载体能够有效抑制EFNB2基因...     

慢病毒shRNA靶向干扰RegⅣ基因胰腺癌细胞株的构建

 目的  构建并鉴定再生基因4 (regenerating islet-derived family member 4,RegⅣ)短发夹干扰RNA (short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,继而建立稳定干扰RegⅣ基因表达的胰腺癌细胞株PANC-1。方法  使用聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction,PCR)检测RegⅣ基因在胰腺癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向干扰RegⅣ基因的shRNA 慢病毒表达质粒pGC-shRNA-RegⅣ,用脂质体转染的方法将载体导入胰腺癌细胞,建立稳定表达shRNA的细胞株。使用荧光定量PCR检测干扰效率。RegⅣ基因过表达载体的构建方法为:将获取的目的基因与pEGFP-RegⅣ-3FLAG过表达质粒载体分别进行双酶切,利用电泳回收双酶切产物,转化感受态细胞并进行测序验证,验证成功后,使用Western blot检测其在293T细胞中的表达强度。结果  PCR结果显示RegⅣ在PANC-1中表达最高,在BxPC-3中表达最低。测序验证pGC-shRNA-RegⅣ重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入胰腺癌细胞株PANC-1后能明显抑制RegⅣ mRNA 表达水平。过表达载体pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ合成成功后进行Western blot鉴定,验证pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ过表达载体构建成功。过表达RegⅣ基因转染BxPC-3后,与空质粒组相比,RegⅣ表达量明显提高。结论  成功建立了靶向稳定干扰RegⅣ基因表达的shRNA胰腺癌细胞株PANC-1。     

TRAF1基因干扰质粒的构建及其对胃癌细胞生物学功能的影响

目的:构建T F1基因干扰重组质粒及建立T F1基因干扰瞬时转染胃癌细胞模型,然后通过干扰目标胃癌细胞中的T F1基因来检测T F1对胃癌细胞的生物学功能的影响。方法:首先通过real-time PCR和Western印迹验证T F1在胃癌细胞系BGC823,SGC7901,MGC803中的表达,筛选出T F1表达量最高的一株细胞作为干扰转染的目标细胞;设计及构建3个T F1的shRNA表达载体pLVX-shRNA-T F1-shRNA1~3,将其分别转染至目标胃癌细胞系中,应用real-time PCR和Western印迹筛选出干扰效率最强的shRNA,最后通过M及流式细胞术检测T F1对胃癌细胞凋亡能力的影响,通过Transwell小室迁移实验来检测对其迁移功能的影响。结果:与GES-1比较,T F1基因在BGC823,SGC7901,MGC803中的表达均有上调(P<0.05),其中以BGC823表达最高;3个T F1shRNA对T F1基因均有抑制作用,以pLVX-shRNA-T F1-shRNA2干扰效果最强;干扰胃癌细胞BGC823中的T F1可使细胞生长活力减弱,凋亡明显增加,但对其迁移功能无明显影响。结论:T F1基因在胃癌细胞系BGC823中上调最明显;pLVX-shRNA-T F1-shRNA2可成功干扰BGC823中T F1的表达;T F1可抑制BGC823细胞的凋亡。     

Galectin-3 shRNA载体的构建表达及其对大肠癌细胞lovo增殖率的影响

目的: 构建galectin-3 shRNA真核表达载体,观察该基因的抑制对大肠癌细胞系lovo细胞增殖率的影响. 方法: 以未转染lovo细胞作为阳性对照组,转染空质粒的lovo细胞作为阴性对照组,将针对人galectin-3基因的不同部位设计的长度约140 bp的shRNA,插入到真核表达载体PRNAT-U6.1并转染人大肠癌细胞lovo,双酶切鉴定重组载体,免疫荧光检测转染效果, RT-PCR和Western-Blot检测其对该基因mRNA和蛋白水平的抑制,MTT测定干扰后对lovo细胞增殖率的影响. 结果: 双酶切出一条约120 bp的DNA片断,与插入片断长度相符. PRNAT-U6.1/Galectin-3 shRNA表达载体顺势转染lovo细胞72 h后检测转染效率及Galectin-3在mRNA和蛋白水平的表达情况, 免疫荧光检测转染效率为62%. 转染PRNAT-U6.1/Galectin-3 shRNA的lovo细胞Galectin-3的表达在mRNA和蛋白水平均明显下降,各组间比较F=2.214,148.566, P=0.000, 0.000,阴性组和阳性对照组相比,P=0.448,0.263. 干扰后细胞继续生长,与干扰前相比,生长明显减慢,F=20.830, P=0.000, 组间比较F=149.710, P=0.000,shRNA干扰组与阴性组和阳性组比较,P=0.000, 0.000. 结论: 成功构建Galectin-3 shRNA表达载体,干扰后Galectin-3在mRNA和蛋白水平的表达明显降低,Galectin-3表达的抑制可能会导致大肠癌细胞lovo增殖率的降低.     

人Bub1基因shRNA真核表达质粒的构建及其对人卵巢癌细胞SKOV3紫杉醇敏感性的影响

目的 构建人Bub1 shRNA真核表达质粒,鉴定该质粒对人卵巢癌SKOV3细胞中Bub1基因的抑制作用,并探讨其对SKOV3细胞紫杉醇敏感性的影响.方法 构建pEGFP-Bub1-shRNA质粒,将其经脂质体Lipo 2000TM转染SKOV3细胞后,通过RT-PCR及Western blot检测干扰效率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,MTT法比较转染前后SKOV3细胞的紫杉醇敏感性.结果 成功构建了pEGFP-Bub1-shRNA质粒;RT-PCR 和Western blot检测结果提示,转染后Bub1的mRNA和蛋白表达均显著降低;MTT和FACS提示,与对照组细胞相比,转染后SKOV3细胞生长抑制率及凋亡率明显降低(P<0.05).结论 pEGFP-Bub1-shRNA质粒能有效抑制Bub1 mRNA及蛋白的表达,并降低SKOV3细胞紫杉醇敏感性,该质粒的成功构建为进一步研究Bub1基因的生物学功能提供了工具.     

shRNA干扰胃泌素基因表达对人胃癌细胞BGC823增殖和迁移能力的抑制作用

目的构建针对人胃泌素基因的shRNA干扰表达载体,观察胃泌素基因表达抑制对人胃癌细胞系BGC823细胞增殖和迁移能力的影响。方法根据人胃泌素序列设计并构建3个靶向人胃泌素基因的shRNA真核表达载体,以脂质体转染的方法将胃泌素干扰质粒转染至人胃癌细胞系BGC823,经G418筛选出稳定转染的阳性细胞。通过RT—PCR技术筛选出表达抑制最强的稳定转染胃癌细胞系。应用流式细胞仪技术检测其细胞周期变化情况。采用Trans—well小室法检测细胞体外迁移能力。结果经测序证明胃泌素shRNA基因已成功插入Psilencer3．1质粒中,构建的干扰质粒能够显著抑制胃泌素的表达。胃泌素基因的表达下调将胃癌细胞阻滞在G1期,且穿过Trans—well小室膜的细胞数显著下降。结论干扰胃泌素的表达可显著抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力。     

shRNA慢病毒抑制BGC823细胞株GnT-V表达的载体构建

目的构建针对N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V（GnT-V）基因的shRNA（short harpin RNA,siRNA前体）表达载体,鉴定GnT-V基因干扰效率。方法体外设计并合成针对GnT-V基因的慢病毒shRNA干扰载体,通过PCR及测序证实载体构建成功。将慢病毒颗粒以最适滴度转染人低分化胃癌细胞株BGC823,应用Real-Time PCR、Western blotting检测GnT-V抑制效率。结果构建的慢病毒载体的序列通过PCR、测序等鉴定证实与设计序列相同;Real-Time PCR检测显示干扰组BGC823细胞GnT-V mRNA表达率下降88.04%,Western blotting显示干扰组BGC823细胞表达GnT-V蛋白量较空白载体对照组明显减少。结论构建的shRNA表达载体可在mRNA和蛋白水平上有效抑制BGC823细胞株GnT-V基因的表达。     

小鼠NLRP3基因腺病毒干扰载体的构建及功能鉴定

目的构建针对小鼠NLRP3基因的腺病毒干扰载体(Ad-NLRP3-shRNA),并在Min6和RAW264.7细胞中验证其基因沉默效率。方法针对小鼠NLRP3基因设计、合成3对NLRP3 shRNA 1-3干扰序列,重组至pHBAd-U6-CMV质粒载体。在HEK293T细胞内包装Ad-NLRP3-shRNA。感染Min6和RAW264.7细胞后,采用实时定量-聚合酶链式反应(RTQ-PCR)检测NLRP3基因表达。结果 Ad-NLRP3-shRNA 1-3在Min6和RAW264.7细胞的干扰效率分别达到44.38%、46.61%和82.83%以及47.23%、49.59%和78.64%。结论成功构建出Ad-NLRP3-shRNA载体,为研究NLRP3基因的功能提供有效工具。     

LRIG2基因短发夹RNA表达载体的构建、鉴定和稳定株的筛选

目的 构建针对富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2(LRIG2)基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,建立稳定转染的细胞株,观察其对目的 基因表达的影响.方法 根据GenBank中LRIG2基因序列设计2条RNA干扰序列,命名LRIG2-shRNA1、LRIG2-shRNA2,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照.据此设计合成各自的寡核苷酸链,退火后连接入pGenesil 2载体,转化扩增后进行序列测定.用不同浓度的G418作用于GL15细胞,得到G418对于GL15细胞的筛选浓度.3种重组表达载体转染胶质瘤细胞系GL15细胞,用G418筛选后挑单克隆后扩增获得稳定株.逆转录RT-PCR和Western印迹法分别在mRNA和蛋白水平上检测LRIG2的表达.结果 3种重组表达载体(pGenesil 2-LRIG2-shRNA1、pGenesil 2-LRIG2-shRNA2和pGenesil 2-negative shRNA)经限制性酶切及DNA测序分析证明序列插入正确.G418对于GLl5细胞的筛选浓度为600μg/ml,筛选出稳定转染三种质粒的GL15细胞,转染pGenesil 2-LRIG2-shRNA2组细胞LRIG2 mRNA和蛋白表达明显低于转染pGenesil 2-LRIG2-shRNA1、pGenesil 2-negative shRNA组.结论 成功构建了针对LRIG2基因的shRNA表达载体(pGenesil 2-LRIG2-shRNA2),转染细胞后可抑制LRIG2基因表达,为研究LRIG2基因的功能提供了基础.     

成纤维细胞Ⅰ型胶原基因shRNA载体的构建及干扰效果

目的 构建有效针对人成纤维细胞Ⅰ型胶原基因的shRNA干扰载体,检测RNA干扰后对病理性瘢痕成纤维细胞胶原合成的影响.方法 设计合成4对针对人Ⅰ型胶原基因的shRNA靶序列(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4),将合成的shRNA片段通过重组技术克隆到真核表达载体pmU6,经酶切与测序验证表明成功构建针对人Ⅰ型胶原基因的shRNA干扰载体(Col-shRNA1、Col-shRNA2、Col-shRNA3、Col-shRNA4),并将该干扰载体与空载体分别通过脂质体转染人的病理性瘢痕成纤维细胞(依次为Col-shRNA1组、Col-shRNA2组、Col-shRNA3组、Col-shRNA4组、空载体转染组),另选未处理的成纤维细胞作为空白对照组,采用RT-PCR与羟脯氨酸含量测定试剂盒检测该干扰载体的干扰效应.结果 酶切与测序结果表明成功构建了针对人Ⅰ型胶原基因的shRNA干扰载体.Ⅰ型胶原基因mRNA的相对表达水平在空白对照组与空载体转染组之间差异无统计学意义(P＞0.05);而干扰组Col-shRNA(1～4)与空载体转染组之间比较,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).空白对照组与空载体转染组的羟脯氨酸含量及胶原合成差异无统计学意义,干扰组(Col-shRNA1、Col-shRNA2、Col-shRNA3、Col-shRNA4)的羟脯氨酸含量和胶原合成与空载体转染组比较,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).结论 成功构建了4组有效针对人Ⅰ型胶原基因的shRNA干扰载体,它们均能明显抑制病理性瘢痕成纤维细胞Ⅰ型胶原基因的表达与减少细胞胶原的合成,其中Col-shRNA1对成纤维细胞Ⅰ型胶原基因表达的干扰效果最强.     

细胞信号转导抑制因子3特异性shRNA的构建及鉴定

目的构建针对大鼠细胞信号转导抑制因子3(SOCS-3)基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,选取最有效shRNA模板序列。方法设计并合成编码的shRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆至pGPU6/GFP/Neo中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,进行序列测定;转染至骨骼肌细胞中。Real-time PCR和Western blot检测各组SOCS-3的表达情况。结果测序证实重组质粒构建成功。4对shRNA模板序列对SOCS-3的表达抑制与空白及阴性对照相比差异均有统计学意义(均P<0.05),且以SOCS-3-shRNA a干预效果较好。结论 SOCS-3特异性shRNA重组表达载体构建成功,能有效抑制大鼠骨骼肌细胞SOCS-3的表达,为后续研究及代谢综合征的基因治疗奠定了基础。     

bcl-2 shRNA表达载体的构建及其在K562细胞中的干扰作用研究

目的构建bcl-2shRNA表达载体，观察其在人白血病K562细胞系中对bcl-2基因的干扰作用。方法设计合成有短发夹结构靶位bcl-2基因的65个碱基的寡核苷酸，连接到载体pSIREN-Shuttle（pSS），构建了bcl-2shRNA表达载体，得到重组质粒pSS-shbcl-2-1、pSS-shbcl-2-2、pSS-shbcl-2-3和一个阴性对照，将其稳定转染K562细胞，分别用RT-PCR、Western-blot法检测转染后K562细胞bcl-2mRNA及蛋白质表达水平。结果成功构建了bcl-2shRNA的表达载体，并筛选到转染后K562细胞在pSS-shbcl-2-3组bcl-2基因的mRNA和蛋白质表达水平明显抑制。结论特异性的bcl-2shRMA可以干扰K562细胞中bcl-2基因的表达，针对bcl-2基因不同位点的不同shRNA也有干扰效果的差异。     

构建和鉴定PTEN基因的shRNA重组腺病毒表达载体

目的构建PTEN特异性shRNA重组腺病毒表达载体,为应用基因沉默技术进行缺血性脑损伤的基因治疗奠定基础。方法将前期构建的PTENshRNA特异性真核表达载体pGenesil-1-shRNA的表达启动子U6连同shRNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack,酶切及DNA测序鉴定后,将含PTEN基因的重组穿梭质粒pAdTrack-U6-shRNA经PmeI线性化后转化入pAdEasy-1感受态细菌。pAd-U6-shRNA质粒经PacI线性化后转染293细胞,包装重组腺病毒Ad-U6-shRNA,并进行PCR鉴定、病毒滴度测定及Westernblotting检测受感染海马神经元细胞内PTEN蛋白的表达。结果证实pAdTrack-U6-shRNA及pAd-U6-shRNA质粒构建正确,收获病毒后PCR及DNA测序结果证明Ad-U6-shRNA包被成功,受腺病毒感染海马神经元细胞内PTEN蛋白表达明显降低。结论成功构建了PTEN基因的shRNA重组腺病毒载体Ad-U6-shRNA,为应用基因沉默技术研究PTEN对缺血性脑损伤后的神经保护作用奠定了基础。     

RNA干扰Twist基因真核表达载体的构建与筛选

目的： 构建编码Twist mRNA 的短发卡样RNA （shRNA ）质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA 质粒表达载体。方法： 以Twist mRNA 编码区中第777位和第845位序列作为RNA干扰靶点,分别构建2个shRNA 质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,构建后通过PCR 酶切电泳和质粒测序进行鉴定。经鉴定后分别转染稳定表达Twist基因的膀胱癌T24细胞,RT-PCR 和Western blotting 分别从mRNA 和蛋白质水平检测抑制效果。结果： 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出400 bp的目的条带,插入片段测序结果与合成的shRNA 结果一致。靶向Twist基因的shRNA 对膀胱癌T24细胞中Twist基因mRNA 抑制率为90%,蛋白质抑制率为86%,两种干扰质粒中shRNA1干扰效果最明显。结论： 成功构建了靶向Twist 基因的shRNA 质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA 质粒表达载体为pGenesil-shRNA1 质粒。