湖北株HPV16E7基因疫苗的构建及免疫性研究

用Eco RⅠ和HindⅢ双酶切PWR590－1,所得湖北株HPV16E7片段克隆入真核表达载体pcd3.1^-,构建了湖北株HPV16E7基因疫苗,皮下注射BALB／c近交系小鼠,体外应用酶联免疫吸附实验（Elisa)法和MTT法分别检测了湖北株HPV16E7基因疫苗在体内产生特异性体液免疫和细胞免疫的能力。     

人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗酶联免疫检测法的建立及其应用

目的建立人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗(HPV16 L2E6E7)酶联免疫的检测方法,用于疫苗发酵过程中的重组蛋白表达的监控。方法用常规方法制备兔抗HPV16 L2E6E7多克隆抗体作为包被抗体,商品化小鼠抗HPV16 E7单克隆抗体为检测抗体,夹心ELISA方法检测HPV16 L2E6E7抗原参考品,建立抗原标准曲线,确定线性范围及检测限,同时验证该方法的特异性。结果建立了检测HPV16 L2E6E7抗原含量的夹心ELISA方法,抗原参考品系列浓度在19.53~1 250 ng·m L-1内有很好的线性(R2>0.99)和回收率(90%~110%);特异性好,不受发酵液中宿主菌蛋白的干扰。结论建立了人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗重组抗原含量的测定方法,为该疫苗的发酵工艺的质控提供了有效技术手段。     

多重耐药大肠埃希菌氨基糖苷类修饰酶与Ⅰ类整合酶基因的研究

目的 探讨本地区临床分离多重耐药大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)的氨基糖苷类修饰酶和Ⅰ类整合子基因存在情况.方法 纸片扩散法(K-B法)测定71株大肠埃希菌对常用抗菌药物的耐药性,应用PCR技术对E.coli进行氨基糖苷类修饰酶和Ⅰ类整合酶基因的检测.结果 71株大肠埃希菌对庆大霉素、左氧氟沙星、头孢噻肟、头孢他啶的耐药率分别分为66.20％、63.38％、59.15％、18.31％,其中23株为多重耐药株(32.39％).氨基糖苷类修饰酶基因aac(3)-Ⅱ阳性40株(56.34％),aac(6′)-Ⅰ阳性22株(30.99％),ant(3″)-Ⅰ阳性14株(19.72％),未检出aac(6′)-Ⅱ阳性株,氨基糖苷类修饰酶基因总检出率为74.65％;Ⅰ类整合酶基因(intI1)阳性53株(74.65％).多重耐药与非多重耐药大肠埃希菌中aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰ、总氨基糖苷类修饰酶基因、intI1的阳性率有统计学差异(P＜0.05).结论 本地区多重耐药E.coli的氨基糖苷类修饰酶基因、Ⅰ类整合酶基因携带率高.     

HEK293细胞的传代、建库与高效表达重组HPV16-E6E7腺病毒的研究

目的对HEK293细胞进行三级细胞库的建立,并高效表达重组的HPV16-E6E7腺病毒。方法进行HEK293细胞传代培养,并建立三级细胞库,按中国药典2010年版III部要求进行常规检验;培养重组HPV16-E6E7腺病毒,测定滴度,插入目的基因以及基因组酶切图谱鉴定。结果 HEK293细胞传代符合其生长形态,建立的三级细胞库和不同细胞库之间的传代数,细胞浓度和装量均符合疫苗基质制备的要求;能高效表达重组HPV16-E6E7腺病毒,种子滴度>3.0×109 IU·m L?1;表达的目的基因和目的蛋白稳定。结论建立的HEK293三级细胞库符合疫苗用细胞基质的要求。     

健康志愿者接种TA-CIN后HPV16 E6和E7特异性T细胞免疫增强

业已证明含 1 6型人乳头瘤病毒( HPV1 6 ) L2、E6和 E7融合蛋白的候选疫苗TA- CIN在动物模型中可引发 HPV1 6特异性细胞毒性 T细胞 ( CTL )、辅助性 T细胞和抗体产生 ,而且 TA- CIN免疫后可有效阻止HPV1 6阳性肿瘤细胞的生长。本文主要介绍TA- CIN的安全性和免疫原性。　　HPV1 6 DNA由 W1 2细胞系分离而得 ,聚合酶链反应特异性扩增 HPV1 6 L2、E7、E6基因 ,将目的基因克隆入 p ET质粒 ,在大肠杆菌表达系统表达融合蛋白 HPV1 6L2 E7E6 ,蛋白经纯化后备用。　　将 4 0名健康志愿者 ( 30男 ,1 0女 )随机分为 4组 :安慰…     

HPV_(16)E7-HSP_(70)融合表达质粒的构建及鉴定

采用分子克隆技术 ,首先将 HSP70 基因片段克隆到真核表达载体 pc DNA3 .1ˉ上 ,获得 pc DNA-HSP重组质粒 ,然后采用 PCR扩增技术 ,定点突变编码 HPV1 6 E7蛋白 C末端锌指结构的基因序列 ,将该突变的 E7基因插入 pc DNA-HSP重组质粒 ,通过粘端连接的方式构建 pcd-HPV1 6 E7-HSP70 融合表达质粒 ,最后通过限制性内切酶酶切、PCR和 DNA测序等技术鉴定。结果显示 ,重组融合表达质粒经酶切、PCR和 DNA测序证明其突变位点、碱基及阅读框架均准确无误。     

多重PCR分析宫颈癌细胞中16型HPV的状态

人乳头瘤病毒( HPV) DNA整合入宿主基因组发生在癌症的早期阶段,是宫颈癌恶性转化的重要环节。HPV基因整合通常破坏了E2基因开放读码框( ORF)。由于E2基因具有抑制E6、E7产物合成的作用,所以被破坏后导致E6、E7基因过度表达。HPV DNA整合入宿主基因组后,由于E2基因的抑制作用降低,将会影响HPV相关疾病的组织学状态,作者通过评价E2与E1和E6基因产物的比率,间接分析HPV基因整合水平,并分析其与疾病临床分期的相关性。　　用同时检测1 6型HPV E1、E2、E6和L1的多重PCR技术,检测了6 6份1 6型HPV阳性的宫颈癌患者的涂片样本。…     

人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA检测在宫颈病变筛查中的应用进展

目的研究人乳头瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA检测在宫颈病变筛查中的应用进展。方法阐述HPV基本定义以及致癌基因E6和E7对人体免疫功能和宫颈癌浸润转移的影响。分析HPV E6/E7 mRNA检测的基本原理和在宫颈病变筛查中的应用价值,并分析传统HPV E6/E7 mRNA检测法存在的弊端,分析Aptima HPV检测方法和PreTect HPV检测法的原理、应用范围以及价值。结果临床可根据致癌基因E6和E7在宫颈组织中的表达情况,判断该病毒是否具有致癌的活性。对稳定性较差的单链RNA,采用传统的HPV E6/E7 mRNA检测方法,存在较高的假阴性率。Aptima HPV检测法以截点S/CO≥1 Copy·mL~(-1)判定为阳性,其准确度、特异度和敏感度均较高。PreTect HPV检测法仅适用于对科研或个别人群进行检测,不适用大范围的HPV筛查。结论 Aptima HPV检测法能提高检测的准确率和特异度,降低了假阳性的发生,同时减少了不必要的医疗资源浪费,PreTect HPV检测法适用于科研或者个别人群进行检测研究。     

人乳头状瘤病毒疫苗在侵袭前期和侵袭性肿瘤中的临床研究

宫颈癌主要与 1 6和 1 8型人乳头状瘤病毒 ( HPV)感染有关。针对高危 HPV E6和E7癌基因的疫苗策略 ,将可提供一种较理想的治疗选择。　　为在人体内诱导抗肿瘤细胞毒性 T淋巴细胞 ( CTL)应答 ,作者构建了编码经修饰的 1 6和 1 8型 HPV E6 / E7蛋白序列的痘苗病毒 ( TA- HPV)。使用该重组痘苗载体可确保目标抗原由抗原呈递细胞加工和呈递 ,以产生 MHC 类限制性 CTL应答。使用 TA-HPV皮肤划痕接种 ,在 1 / 3晚期宫颈癌患者( 1组 ) ,3/ 1 2 3型宫颈上皮内瘤 ( CIN3)志愿者 ( 2组 )以及 4 / 2 9早期侵袭性宫颈癌患者( 3组 )中观…     

HPV18E6基因的原核克隆及表达

目的:构建pET32a(+)HPV18E6原核表达质粒并优化其表达条件,探讨喉癌组织中HPV18E6蛋白的表达及意义.方法:应用基因重组技术,构建pET32a(+)与HPV18E6的原核表达重组质粒,采用PCR方法扩增HPV18E6基因,经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET32a(+)载体,转化JM109感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌E.coli BL21(DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性.结果:成功构建了原核表达质粒Pet32/HPV18E6, 限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的是目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV18E6蛋白得到高效原核表达,表达HPV18E6的工程菌BL21(DE3)的最佳诱导温度是37 ℃,诱导剂IPTG的浓度为1 mmol/L. 结论:HPV18E6融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV18E6蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.     

重组口服腺病毒乙型肝炎疫苗的安全性和免疫原性的初步研究

作者将HBsAg基因插入7型腺病毒(Ad7)基因组的E3区,在人A-549细胞中与Ad7疫苗株Wyeth-Ayerst进行同源重组,筛选出E3区缺失的重组腺病毒乙型肝炎疫苗株Wy-Ad7H26-1。在9名健康志愿者中进行疫苗安全性和免疫原性观察。3人接种Ad7疫苗,于门诊观察,3名接种重组疫苗者和     

密码子修饰增强乳头瘤病毒晚期蛋白表达的研究

目的观察密码子修饰对乳头瘤病毒衣壳蛋白基因表达的影响。方法以密码子改变影响乳头瘤病毒晚期蛋白的表达为依据，以人类常用密码子替代野生型密码子构建HPV6b L1(HLl)、HPV6b E7 N-端(HL1E7I)、HPV6b E7 C-端(HL1E7 Ⅱ)和BPV1 L2 （HBL2)质粒，转染真核细胞系，以免疫荧光、免疫印记、电镜、流式细胞分析、ELISA观察相应蛋白表达情况。结果上述质粒在真核细胞均有HpVL1、蛋白的高度表达；HLlE7I表达的L1蛋白定位于细胞质而HL1E7Ⅱ表达的L1蛋白定位于细胞核；密码子修饰后的6HL1和HL1E7基因能有效表达HPV6bL1样的假病毒颗粒。结论HPV6 E7蛋白的羧基端有核定位信号存在，密码子修饰能增加基因的表达效率，可用于目的基因的表达。     

16型人乳头状瘤病毒疫苗研究现状

16型人乳头状瘤病毒(HPV16)感染人类上皮可引起恶性肿瘤.目前正在进行研究的疫苗有两类:一类是核壳蛋白(L1和L2)疫苗,它能诱导机体产生中和抗体,主要用于预防HPV16感染;另一类是E6E7的表位或突变体制备的疫苗,用于HPV16相关肿瘤的治疗.     

氨基糖苷类修饰酶基因aac(2 ')-Ⅰb型在耐药鲍曼不动杆菌中流行

目的 调查一组耐药鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类的耐药机制.方法 收集2013年1至3月江苏省淮安市第一人民医院住院患者标本中分离到的鲍曼不动杆菌共32株,用分子鉴定法确认为鲍曼不动杆菌,再用聚合酶链反应(PCR)方法分析9种氨基糖苷类修饰酶基因与7种16S rRNA甲基化酶基因.结果 本组32株耐药鲍曼不动杆菌共检出5种氨基糖苷类修饰酶基因:aac(2')-Ⅰb 32株(100.0％)、aac(3)-Ⅰ 15株(46.9％)、aac(6')-Ⅰb 19株(59.4％)、ant(3")-Ⅰ 20株(62.5％)、aph(3')-Ⅰ 19株(594％),与1种16S rRNA甲基化酶基因armA 25株(78.1％).阳性基因共分为7种检测模式,其中以aac(2')-Ⅰb+ aac(3)-Ⅰ+ aac(6')-Ⅰb+ ant(3")-Ⅰ+ aph(3')-l+armA等6种基因均阳性的模式最高,为12株(37.5％).结论 产5种氨基糖苷类修饰酶基因(aac(2')-Ⅰb、aac(3)-Ⅰ、aac(6')-Ⅰb、ant(3")-Ⅰ、aph(3)-Ⅰ)与1种16S rRNA甲基化酶基因armA是本组耐药鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类耐药的重要原因.在鲍曼不动杆菌临床分离株检出aac(2')-Ⅰb型氨基糖苷类修饰酶基因为国内首次报道.     

核酸疫苗pVAX1-F的构建及瞬时表达

目的:构建仙台病毒核酸疫苗pVAXl-F,并在COS 7细胞中表达.方法:利用PCR法以仙台病毒cDNA为模板扩增出F基因,与pMD18-T连接,测序正确后用HindⅢ/EcoR Ⅰ双酶切,将F基因引入经同样酶切的pVAX1载体,构建pVAX1-F表达载体,用PCR法和双酶切法鉴定,并将此重组质粒通过脂质体介导转染COS 7细胞,流式细胞术检测抗原蛋白表达、RT-PCR法检测外源基因的表达.结果:经PCR法和酶切鉴定,目的片段大小与预期相符,经测序目的基因序列与GenBank(EF679198)公布结果一致.重组质粒pVAX1-F转染COS 7细胞72 h后,能够表达抗原蛋白,流式细胞术检测达到58.3%,与对照组3.6%比较差异具有显著性(P<0.01),且F基因mRNA明显表达.结论:成功构建pVAX1-F,并能够在COS 7细胞中瞬时表达,为仙台病毒F基因核酸疫苗进行免疫学评价奠定基础.     

肺炎克雷伯菌（ESBLs）氨基糖苷类修饰酶基因的研究

目的了解临床分离的产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的肺炎克雷伯菌的耐药性及氨基糖苷类修饰酶基因的存在状况。方法对临床分离的35株产ESBLs肺炎克雷伯菌采用聚合酶链反应技术（PCR）检测6种氨基糖苷类修饰酶aac（3）-Ⅰ,aac（3）-Ⅱ,aac（6）-Ⅰ,age（6’）-Ⅱ,ant（3″）-Ⅰ,ant（2″）-Ⅰ。结果该35株肺炎克雷伯菌检出：aac（3）-Ⅰ阳性4株（11．8％）,aac（3）-Ⅱ阳性7株（20．6％）,aac（6’）-Ⅰ阳性13株（37．1％）,aac（6’）-Ⅱ阳性7株（20％）,ant（3″）-Ⅰ阳性11株（31．4％）,ant（2″）-Ⅰ阳性12株（34.3％）。共有26株（74．3％）检出AMEs。同一菌株可产生两种或两种以上的氨基糖苷类修饰酶基因。结论临床分离的产ESBLs肺炎克雷伯茵氨基糖苷类修饰酶基因携带率高。     

高危型人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测在宫颈癌中的研究进展

<正>高危型人乳头瘤病毒(HPV)的持续感染是宫颈病变发生、发展不可缺少的因素。而HPV E6/E7基因持续表达的蛋白质是导致宫颈病变恶性发展的关键~([1])。现对转录产物HPV E6/E7mRNA的发病机制、宫颈癌筛查、治疗及预后中的应用进行综述。1 HPV分子及其致癌机制HPV广泛存在于自然界,目前已有120多种型别被发现,与生殖道感染有关的约占1/4,它们具有特有的宿主特异性,好发生于宫颈鳞状-柱状上皮交接处(转化区)。HPV是以约8 000bp构成且     

人乳头瘤病毒疫苗治疗宫颈癌

人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染是引起宫颈癌的主要原因,而宫颈癌是妇女的第二常见癌症.当前,HPV-L1病毒样颗粒已获准作为抗HPV感染的预防性疫苗,这可能将在数十年内降低宫颈癌发生率.靶向HPV调节蛋白E6、E7的治疗性疫苗有望对宫颈癌或其前期损害有效果,类型有重组蛋白和DNA疫苗、多肽疫苗、树突状细胞疫苗以及病毒和细菌载体疫苗.将这些疫苗类型与常规疗法或CD4+调节T细胞调节方案联合使用似更有希望提高治疗效果.本文概述了当前及将来在动物和临床水平针对HPV相关恶性肿瘤的治疗性疫苗策略.     

单磷酸脂质A佐剂对重组生殖器疣疫苗免疫原性的增强作用[英]

生殖器疣的消退与T细胞免疫有关.作者曾证明重组6型人乳头瘤病毒(HPV6)L2E7融合蛋白吸附于铝胶(Alhydrogel)制成的L2E7/铝胶疫苗的免疫原性强于可溶性L2E7.作者进一步用明尼苏达沙门菌R595株的脂多糖水解脱毒形式单磷酸脂质A(MPL)作为佐剂,研究MPL在不同配方中对L2E7免疫原性和反应原性的影响.     

蛋白和佐剂疫苗接种对肿瘤生长的治疗潜力

宫颈癌是导致妇女癌症死亡的第二大主要原因 ,90 %以上的宫颈癌与人乳头状瘤病毒 ( HPV)感染密切相关 ,其中最常见的病毒亚型是 HPV- 1 6 ,而 HPV- 1 6中的两种早期病毒基因 E6和 E7,在恶性表型的发生及维持方面起主要作用。作者采用两种表达 E7的肿瘤小鼠模型对重组 HPV- 1 6 PD- E7融合蛋白疫苗的治疗潜力进行研究。　　作者将 PD- E7分别与 Smith KlineBeecham公司的 3种佐剂配制成不同配方的疫苗 ,每种疫苗均含 5μg PD- E7,3种佐剂分别为 :SBAS1 ,含免疫刺激剂 MPL 和 QS2 1各 5μg;SBAS2 ,含 MPL和 QS2 1各 5μg及…