大鼠马尾压迫后p75神经营养因子受体mRNA时序性表达及意义

目的：观察和探讨Sprague Dawley（SD）大鼠马尾急性压迫后腰骶部脊髓p75神经营养因子受体（p75NTR）的mRNA表达和腰骶髓神经元细胞凋亡数量时间分布及关系,为马尾综合征（cauda equina syndrome,CES）发病机制提供一定理论依据。方法：成年雌性SD大鼠60只,按时间点随机分为正常对照组及压迫1、3、5、7、14、28d组,共计12组（n=5）,造模采用L3,4节段椎管放置硅胶棒压迫70%～80%椎管面积造成马尾急性压迫症状,于术后1、3、5、7、14、28d处置,在L1,2椎体位置脊髓取材。分别采用Tunel方法检测神经元细胞凋亡,RT-PCR方法观察p75NTR的mRNA表达。结果：压迫组从术后1～28d,p75mRNA表达增加及腰骶髓神经元细胞凋亡明显,p75mRNA表达和凋亡数目变化趋势存在先升高后降低同步趋势,均在7d达到峰值,压迫组术后各时间点与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）,压迫组与对照组总体差异有统计学意义（P〈0.05）,p75NTR的mRNA表达与腰骶部神经元细胞的凋亡呈正相关。结论：马尾急性压迫后,p75NTR的mRNA与神经元细胞凋亡密切相关,在CES的分子发病机制中发挥重要作用。     

慢性颈脊髓压迫症大鼠髓内基膜超微结构变化及其与MMP-9表达的相关性

目的 :观察慢性颈脊髓压迫症大鼠模型髓内基膜(basement membrane,BM)、基膜与星形细胞接触面(basement membrane-astrocyte contacts,BM-AC)的超微结构变化,并探讨其与基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)表达的相关性。方法 :72只雄性SD大鼠随机分为对照组(n=36)和实验组(n=36),对照组仅切除C5左侧椎板;实验组在切除C5左侧椎板后将吸水可膨胀聚氨酯薄板置入C6水平左侧椎板下硬膜外,建立慢性颈脊髓压迫模型,应用BBB(Basso Beattie Bresnahan)评分评价大鼠脊髓神经功能,并分别于造模后1d、14d、21d、28d、42d、70d取C5~C6段脊髓组织制备标本,用HE染色观察脊髓形态学变化、用MMP-9免疫组化染色检测脊髓MMP-9表达量,用透射电镜观察脊髓BM及BM-AC的变化。结果:对照组各时间点间BBB评分和实验组造模后1d的BBB评分无显著性差异,实验组造模后14d~70d的5个时间点BBB评分均显著性低于同时间点对照组(P0.05)。HE染色显示对照组各时间点及实验组造模后1d的脊髓未见受压,脊髓形态结构正常;实验组造模后1d可见脊髓白质区轻度水肿;造模后14d脊髓受压变形,灰质区血管增生,灰质、白质水肿,神经元细胞核碎裂;造模后21d和28d损伤逐渐加重;造模后42d脊髓水肿减轻,髓内空泡化,前角大运动神经元数目减少、胞浆稀少、胞核萎缩,突触减少,神经纤维稀疏,髓鞘层变薄;造模后70d仍见白质区水肿、神经元细胞核碎裂,灶性胶质细胞增生等退行性变,神经元数目增多。MMP-9免疫组化显示对照组各时间点及实验组造模后1d、70d脊髓MMP-9均呈弱表达,实验组造模后14d呈较强表达,21d呈强表达,28d呈较强表达,42d呈中度表达。对照组各时间点及实验组压迫后1d的BM电子密度及BM-AC均正常,实验组造模后14d~28d BM电子密度、BM-AC比率与对照组比较显著性降低(P0.05);实验组造模后42d、70d两者较前升高(P0.05),但仍显著低于对照组水平(P0.05)。MMP-9表达与BM电子密度及BM-AC变化呈负相关,相关系数分别为-0.892(P0.001)和-0.664(P0.001)。结论:慢性颈脊髓压迫性损伤后早期髓内BM降解、BMAC分离,后期部分修复。MMP-9可能通过降解BM及BM-AC影响脊髓压迫后血脊髓屏障的完整性。     

大鼠臂丛神经损伤后对低级中枢运动神经元凋亡的影响

目的观察大鼠臂丛神经条件性损伤对相应脊髓节段灰质前角运动神经元凋亡的影响方法将35只成年Wasler大鼠分为3组：正常对照组(n=5)、臂丛神经切割伤组(A组，n=15)、臂丛神经撕脱伤组(B组，n=15)。A、B两组按术后取材时间(3、7、14、21、28d)分为5个时间组，每组3只大鼠。各时间组取大鼠的C5～T1脊髓节段，以HE染色及TUNEL法检测细胞的凋亡情况结果正常组及A、B组非损伤侧脊髓灰质前角未检出凋亡细胞；A、B两组伤后早期(3d)脊髓灰质前角即有凋亡细胞出现，A组在伤后14d、B组在伤后7d凋亡率达高峰，以后随时间推移逐渐降低；各时间组细胞凋亡程度B组明显高于A组，差异均有显著性。结论臂丛神经损伤后早期(3d)，其所属神经元即有凋亡，且损伤越重，凋亡速度越快，程度越高。     

坐骨神经损伤脊髓神经元退变与组织型纤溶酶原激活物及其抑制物表达的关系研究

目的 探讨坐骨神经离断后脊髓内组织型纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,tPA)及其抑制物纤溶酶原激活物抑制物1(type-1 plasminogen activator inhibitor,PAI-1)、神经丝氨酸蛋白酶抑制剂(neuroserpin,NSP)的表达与神经元退变的关系.方法 将56只雄性SD大鼠随机分为实验组和对照组.对实验组大鼠行坐骨神经离断术,于术后各时间点取材伤侧脊髓L4～6节段,经Nissl染色后,运用透射电镜观察神经元退变及死亡情况;运用免疫组化染色和半定量RT-PCR检测tPA、PAI-1及NSP的表达变化.结果 坐骨神经离断术后7d,伤侧相应脊髓节段前角外侧核神经元存活率显著下降,术后21 d神经元存活率为61.6％.电镜观察显示,术后7d开始,脊髓前角可见处于不同凋亡阶段的神经元及神经胶质细胞,术后14 d开始脊髓后角也可见少数凋亡样变的神经元及胶质细胞.免疫组化结果显示,坐骨神经损伤后ld,伤侧脊髓Ⅴ～Ⅸ板层内tPA表达水平开始上调(P＜0.05),第7天时达到高峰后下降,至术后21 d仍未恢复正常水平(P＞0.05);PAI-1则在正常脊髓及损伤后脊髓均未能检测到.半定量RT-PCR结果显示,tPA的mRNA变化趋势与蛋白表达基本相同,略早于后者;NSP的mRNA术后1d内迅速上调,随后2周都处于较高水平,21 d才基本回复正常.结论 坐骨神经离断后同侧相应脊髓节段近50％的前角运动神经元死亡可能与损伤刺激脊髓灰质内神经元和小胶质细胞合成、释放tPA增加有关,同时损伤也促使tPA抑制物NSP表达上调,后者可能发挥神经保护作用.     

大鼠臂丛放射性损伤后脊髓前角运动神经元病理变化及c-fos基因表达

目的模拟乳癌放疗方案，观察实验大鼠臂丛神经受照射后相应脊髓前角运动神经元的病理改变及c—fos基因表达。方法采用剂量分割照射方案，建立大鼠臂丛神经放射性损伤动物模型。将加只SD大鼠随机分成臂丛神经损伤组（实验组）和正常对照组，实验组又根据损伤后取材时间的不同分成损伤后3、5、7和9周4个时间组，每个时间组和对照组各4只大鼠，每个时间组以左侧为照射侧，右侧为对照侧，采用日照射2Gy／次，每周5次深部X线照射，累计剂量达到30Gy后，分别于末次照射后3、5、7和9周取材。检测两侧脊髓前角运动神经元形态及数目变化并以免疫组织化学染色法检测c—fos在前角运动神经元中的表达。结果大鼠臂丛神经受照射后3周，实验组照射侧脊髓前角运动神经元存活数目随时间延长而明显减少，神经元内有明显的c—fos染色，c—fos阳性细胞数渐减。照射后9周，c-fos阳性细胞偶见。结论大鼠臂丛神经受大剂量X线照射后可使大鼠脊髓前角运动神经元存活数目明显减少；与脊髓神经元凋亡相关的c—fos基因呈阳性表达，表明原癌基因的表达在臂丛神经放射损伤的凋亡、损伤和修复过程中起重要作用。     

异丙酚对兔脊髓缺血再灌注时脊髓前角神经细胞凋亡的影响

目的 探讨异丙酚对兔脊髓缺血再灌注时脊髓前角神经细胞凋亡的影响.方法 新西兰大耳白兔60只,月龄4～6月,体重2.0～2.5 kg,随机分为6组(n=10):对照组(C组)、10%脂肪乳组(F组)、异丙酚30 mg/kg(P1)组、异丙酚40 mg/kg(P2)组、异丙酚50 mg/kg(P3)组和异丙酚60 mg/kg(P4)组.P1组、P2组、P3组和P4组异丙酚用10%脂肪乳稀释至6 ml/kg,C组和F组给予等容量生理盐水或脂肪乳.全麻下开腹阻断左肾动脉远端的腹主动脉及双侧髂总动脉30 min进行脊髓缺血,自缺血即刻开始,各组以12 ml·kg-1·h-1的速率经股动脉输注生理盐水(C组)、10%脂肪乳(F组)和不同剂量异丙酚(P1～4组),30 min后停止输注,开放腹主动脉行再灌注.再灌注48 h时,取L4～6脊髓组织,光镜下计数脊髓前角正常运动神经细胞;采用TUNEL法计数脊髓前角总细胞和凋亡细胞,计算细胞凋亡指数;采用免疫组化法测定脊髓前角cagpase-3表达.结果 与C组和F组比较,P1～4组脊髓前角正常运动神经元计数升高,凋亡指数降低,caspase-3表达下调(P<0.05);与P1组比较,P2～4组脊髓前角正常运动神经元计数升高,凋亡指数降低,P3组和P4组cagpase-3表达下调(P<0.05);与P2组比较,P3组脊髓前角正常运动神经元计数升高,P4组降低,P3组和P4组凋亡指数降低,caspase-3表达下调(P<0.05);与P3组比较,P4组脊髓前角正常运动神经元计数降低,凋亡指数升高,cagpage-3表达上调(P<0.05).结论 腹主动脉阻断期间,经腹主动脉输注30～60 mg/kg异丙酚可抑制脊髓前角神经细胞凋亡,从而减轻兔脊髓缺血再灌注损伤,且与剂量有关,其机制与下调脊髓cagpage-3表达有关.     

脊髓损伤大鼠触液神经元中p75NTR的表达

目的 :探讨大鼠触液神经元(cerebrospinal fluid-contacting neurons,CSF-CNs)p75神经营养因子受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)在脊髓损伤后的表达变化。方法 :成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只,按随机数字表法分为正常对照组(6只)、假手术组(6只)和脊髓损伤组(24只),脊髓损伤组采用Allen′s打击模型(10g×3cm)在大鼠脊髓T10段造成急性脊髓损伤,分别于损伤3d、1周、2周、4周后进行取材;对照组不做任何处理,假手术组只暴露脊髓,不击伤脊髓。对各组大鼠运动功能行BBB评分,各时间点取材行病理切片HE染色观察。取材前48h侧脑室注射霍乱毒素B亚单位与辣根过氧化物酶复合物(CB-HRP)特异性标记触液神经元。处死大鼠后,取损伤的脊髓节段10mm,用免疫荧光双标法检测触液神经元p75NTR的表达,ImagePro Plus计数目标神经元CB-HRP/p75双阳性细胞的数目。结果 :假手术组各时间点BBB评分均为21.0±0;脊髓损伤组在术后3d、1周、2周、4周各时间点BBB评分分别为3.20±0.81、10.73±1.02、12.48±1.86、13.29±1.93,两组各时间点差异均具有统计学意义(P0.05)。HE染色可见正常对照组和假手术组脊髓组织结构完整,细胞形态正常;脊髓损伤组脊髓组织结构紊乱,神经元变性坏死,胶质细胞增生,胶质瘢痕和脊髓空洞形成。免疫荧光双标示正常对照组和假手术组可见少量CB-HRP/p75双阳性细胞,计数分别为5.16±0.55、4.31±0.61,两组比较差异无统计学意义(P0.05);脊髓损伤组伤后3d、1周、2周CB-HRP/p75双阳性细胞数分别为13.35±1.53、21.68±2.15、16.26±2.09,与正常对照组和假手术组比较差异均有统计学意义(P0.05),伤后4周时,CB-HRP/p75双阳性细胞数为4.83±0.73,与正常对照组和假手术组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 :p75NTR可在大鼠脊髓触液神经元中表达,且在脊髓损伤后表达增加,触液神经元可能通过p75NTR参与脊髓损伤的修复过程。     

大鼠脊髓损伤后大脑运动皮质神经元凋亡的观察

目的:观察大鼠脊髓损伤后大脑运动皮质神经元的凋亡情况,探讨其相关因素.方法:SD大鼠72只,随机分为3组:阴性对照组(正常大鼠)、假手术组(单纯椎板切除)、脊髓损伤组(椎板切除+脊髓横断损伤),每组24只,各组分别于造模后1d、3d、7d、14d处死6只动物取材.应用原位末端标记法(TUNEL法)对脊髓损伤后大脑运动皮质区行神经元凋亡检查,并检测该区域神经元诱生型一氧化氮合酶(iNOS)的表达情况,分析神经元凋亡与iNOS表达的关系.结果:脊髓损伤组大鼠大脑运动皮质区神经元在术后1d、3d、7d、14d的凋亡指数分别为(10.11±4.02)％、(56.53±8.63)％、(35.03±11.66)％、(3.78±1.03)％,均高于相应时间点阴性对照组和假手术组(P＜0.05),术后3d凋亡指数显著高于术后1d、7d和14d(P＜0.01).术后1d、3d、7d、14d脊髓损伤组大鼠大脑运动皮质iNOS阳性神经元百分数分别为(17.92±2.75)％、(60.65±8.78)％、(34.35±7.74)％、(6.12±1.99)％,1d、3d、7d时均高于相应时间点阴性对照组和假手术组(P＜0.05),14d时三组间无显著性差异;脊髓损伤组术后3d时显著高于其余时间点(P＜0.01).脊髓损伤组大鼠大脑运动皮质区神经元凋亡指数与iNOS阳性神经元百分数之间存在显著性正相关关系(r=0.89,P＜0.01).结论:大鼠脊髓损伤后大脑运动皮质区神经元凋亡增加,其可能与iNOS的表达增加有关.     

嗅鞘细胞移植对坐骨神经切断后神经元的作用

目的研究嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)移植对周围神经切断后脊髓及神经节内神经元的保护作用。方法SD大鼠55只,随机分为3个组:空白组5只、实验组及对照组各25只。行右侧坐骨神经切断,近端断端行肌肉内包埋,实验组和对照组分别予OECs及细胞培养液,空白组暴露神经后不作任何处理。术后1、2、3、7和14d,分批处死,行组织学观察及TUNEL标记观察神经元的改变。结果空白组术后14d均无阳性变化。大鼠坐骨神经切断后,脊髓及神经节内均有神经元凋亡发生。术后1、2、3d实验组细胞存活率分别为98.4%±6.5%、97.6%±6.5%及95.2%±6.7%,对照组分别为97.8%±6.7%、97.4%±6.4%及94.3%±6.8%,比较差异无统计学意义(P>0.05);7、14d实验组细胞存活率分别为92.4%±8.9%、87.7%±9.4%,较对照组87.4%±8.6%、83.4%±8.5%高,差异有统计学意义(P<0.05)。术后1、2d实验组及对照组脊髓前角运动神经元无细胞凋亡;3、7、14d实验组脊髓前角运动神经元凋亡指数分别为1.2±0.8、1.4±0.6及4.1±1.3,较对照组2.1±1.1、3.1±1.1、6.1±1.8低,差异有统计学意义(P<0.05)。术后1、2、3d神经节内细胞无凋亡;7d实验组神经节内的凋亡指数2.10±0.32,较对照组4.40±0.56低,差异有统计学意义(P<0.05);14d实验组神经节内的凋亡指数4.3±1.80与对照组6.70±2.50比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论周围神经损伤后脊髓及神经节内神经元有神经元凋亡发生,OECs移植对神经元凋亡有保护作用。     

丙戊酸对大鼠臂丛损伤后脊髓运动神经元Ca2+及凋亡的影响

目的 探讨丙戊酸(VPA)对大鼠臂丛损伤后脊髓前角运动神经元Ca2+的影响,以及对神经元的保护作用. 方法 健康成年雄性Wistar大鼠210只,随机分为假手术组(显露臂丛不做处理)、对照组(臂丛根性切断伤组)、VPA组(臂丛根性切断伤加饲喂丙戊酸钠组),每组70只大鼠,分别在术后12、24、48、72 h和1、2、4周7个时间点取臂丛对应的C5～T1脊髓节段.利用全细胞膜片钳技术检测L-型钙离子通道电流,采用荧光分光光度计测定脊髓前角运动神经元内游离Ca2+([Ca2+]i)浓度,TUNEL法检测脊髓前角运动神经元的凋亡.所得数据进行统计学分析(P＜ 0.05为差异有统计学意义). 结果 假手术组各组指标无变化.对照组在神经损伤后12h至1周时,L-型钙离子通道电流值和细胞内[Ca2+]i浓度与假手术组相比显著升高.在神经损伤后12h直至4周,对照组凋亡神经元数明显高于假手术组.VPA组的L-型钙离子通道电流值与对照组相比各时间点差异无统计学意义,但在神经损伤后48 h至1周,细胞内[Ca2+]i浓度显著降低,在伤后24 h至2周,脊髓前角运动神经元的凋亡数目显著降低. 结论 臂丛根性切断伤可以引起脊髓前角运动神经元内[Ca2+]i浓度升高及神经元的凋亡,VPA对神经元L-型钙离子通道无影响,但可以在一定程度上降低受损运动神经元胞内的[Ca2+]i的浓度,并减少神经元的凋亡.