真核表达载体pcDNA3.1/VEGF-B-EGFP的构建及在骨髓间质干细胞中的表达

目的探讨血管内皮细胞生长因子B（vascular endothelial cell growth factor-B,VEGF-B）转染人骨髓间质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MSCs）的表达情况。方法将VEGF-B及编码增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid,cDNA）序列通过扩增、酶切、插入pcDNA 3.1质粒的多克隆位点,构建pcDNA 3.1/VEGF-B-EGFP真核表达质粒,应用脂质体介导的基因转染技术,将基因导入MSCs（pcDNA 3.1/VEGF-B-EGFP转染组）;应用荧光显微镜观察EGFP的表达情况;流式细胞仪检测转染效率;逆转录-聚合酶链反应、蛋白印迹法检测VEGF-B的表达情况。结果 pcDNA 3.1/VEGF-B-EGFP转染组重组质粒转染MSCs 24h后,荧光显微镜下可见强绿色荧光,流式细胞仪检测转染效率约为15%;RT-PCR检测结果显示,MSCs出现590bp目的基因;Western blot检测显示,在转染后MSCs中有VEGF-B表达。结论构建的VEGF-B真核表达质粒成功转染MSCs,为联合应用MSCs细胞移植和VEGF-B基因治疗心肌缺血的研究奠定了基础。     

表达MUC1的小鼠胰腺癌细胞系的构建及成瘤实验

目的：构建表达黏蛋白1（MUC1）的小鼠胰腺癌细胞系panc02-MUC1。方法：体外以脂质体2000（Lipofectamine 2000）转染pcDNA3-MUC1质粒到小鼠胰腺癌细胞系panc02中,并以空载质粒pcDNA3转染细胞为对照。转染细胞再经G418压力筛选单克隆细胞株,并接种于小鼠皮下进行成瘤实验。结果：单克隆细胞株panc02-MUC1经Western blot检测可见MUC1表达;细胞免疫荧光检测可见细胞膜上有MUC1表达。动物接种实验证实该细胞可在正常小鼠皮下成瘤,免疫组织化学检测可见该细胞系在C57BL/6小鼠皮下接种胰腺癌模型中可表达MUC1。结论：构建的胰腺癌细胞系为可表达MUC1的单克隆细胞系,且该细胞系可在正常C57BL/6小鼠中成瘤。     

生长分化因子5真核表达质粒转染小鼠骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化

背景:生长分化因子5是软骨与骨组织形成、发育的重要调解因子,在诱导软骨形成,促进骨、软骨、肌健韧带损伤修复方面发挥重要作用.目的:小鼠骨髓基质干细胞体外转染真核表达质粒pcDNA 3.1(+),生长分化因子5,检测与软骨形成分化相关的细胞外基质及蛋白多糖的表达.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/12在武汉协和医院中心实验室完成.材料:雄性昆明种小鼠20只,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供.生长分化因子5真核表达质粒pCDNA 3.1(+)/生长分化因子5为自备.方法:全骨髓贴壁法体外分离培养小鼠骨髓基质干细胞,取传至第3代细胞接种到6孔板,在细胞生长到90%融合时开始转染.设立3组:转染组采用Lipofectamine<'TM>2000进行脂质体介导pcDNA3.1(+)/生长分化因子5重组质粒瞬时转染;空质粒组转染窄质粒pcDNA 3.1(+);空白对照组只加入等量脂质体,其余步骤相同.主要观察指标:转染后72 h通过RT-PCR及免疫细胞化学检测生长分化因子5基因与蛋白的表达鉴定转染是否成功,同法检测软骨基质Ⅱ型胶原的表达,转染后14 d阿尔辛蓝染色检测蛋白聚糖的表达.结果:转染组有一大小为219 bp的特异性扩增条带,骨髓基质干细胞胞浆内呈棕色阳性染色;而空质粒组、空白对照组均未发生生长分化因子5基因转录,无特异性扩增条带,且细胞胞浆未见明显染色.转染组町检测到Ⅱ型胶原基因的表达,基因大小225 bp,Ⅱ型胶原细胞胞浆中可见棕黄色染色;空质粒组、空白对照组均未检测到Ⅱ型胶原基因的表达,SP染色均无明显染色.阿尔辛蓝染色后转染组细胞呈蓝染,空质粒组、空白对照组均未见明显异染性着色.结论:pcDNA3.1(+)/生长分化因子5转染骨髓基质干细胞能显著增加Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达,促进骨髓基质干细胞向软骨细胞方向分化.     

BHRF1基因对丝裂霉素诱导胃癌细胞SGC7901凋亡影响

目的探讨EB病毒早期基因BHRF1的表达对丝裂霉素诱发胃癌细胞SGC7901凋亡的影响。方法构建pcDNA3.1-BHRF1表达载体,应用脂质体转染法将BHRF1表达载体转染胃癌细胞系SGC7901,MTT法检测细胞生长情况。实验分为细胞对照组、空载体对照组和目的基因转染组,细胞对照组仅接种SGC7901细胞,空载体对照组将pcDNA3.1空载体转染入SGC7901细胞中,目的基因转染组将重组质粒pcDNA3.1-BHRF1转染入SGC7901细胞中。分别培养24、48和72 h后,用浓度为30 mg/L的丝裂霉素处理,流式细胞术检测细胞凋亡率,Hoechst33258荧光染色方法检测凋亡小体。结果 pcDNA3.1-BHRF1重组质粒构建成功。MTT实验显示目的基因转染能明显拮抗由于丝裂霉素作用导致的细胞生长抑制;BHRF1转染＋丝裂霉素处理组凋亡小体明显少于对照组,细胞凋亡率明显低于对照组,差异均有统计学意义（F=6 250.510,q=56.992、51.613,P〈0.01）。结论 BHRF1基因具有明显拮抗丝裂霉素诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的作用。     

重组pcDNA3．1-BMP7转染兔膝关节软骨细胞及其表达

目的：将重组pcDNA3.1-BMP7真核表达载体转染至培养的兔膝关节软骨细胞中，观察BMP7基因在兔关节软骨细胞中的表达。 方法：实验于2003-08／2004-08在哈尔滨兽医研究所完成。①选取清洁级健康成年家兔1只，兔膝关节软骨切碎后取2．0-2．5kg软骨组织，进行关节软骨细胞的分离与培养。②脂质体与pcDNA3.1-BMP7 DNA质粒形成脂质体-DNA质粒复合物，复合物的最佳比例为脂质体10μL、pcDNA3.1-BMP7质粒4μg。用含G418的正常培养液筛选转pcDNA3.1-BMP7质粒μg400mg／L的正常培养液筛选转染pcDNA3.1-BMP7DNA质粒的软骨细胞，显微镜观察细胞的形态及活性。③软骨细胞转染后7d和28d，分别用聚合酶链式反应、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western blot、免疫荧光、原位杂交检测等方法测定BMP7蛋白在软骨细胞中的表达。 结果：①家兔膝关节软骨细胞的分离与培养情况：家兔膝关节软骨切碎后用胰蛋白酶／Ⅱ型胶原酶进行消化，能使细胞与细胞外基质很好地分离。接种24h，部分细胞开始贴壁生长，72h后分裂增殖，7d时细胞融合率为90％～100％。贴壁初期细胞呈圆形或三角形，以三角形为主，每7d传代1次。②脂质体介导下pcDNA3.1-BMP7质粒转染兔软骨细胞情况：转染后的软骨细胞用G418筛选，4d转染效率约15％，阳性克隆细胞七八天融合率约为90％。G418连续筛选28d，阳性克隆细胞仍然存活，细胞融合率为100％。未转染pcDNA3.1-BMP7质粒的细胞，G418筛选4d时细胞全部死亡。③转染后兔软骨细胞聚合酶链式反应检测结果：聚合酶链式反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，结果在1．3kb处可见DNA条带，作为对照的软骨细胞未见此DNA条带。④转染后软骨细胞BMP7蛋白表达电泳检测结果：在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上可见相对分子质量约为18000的电泳条带。⑤转染后软骨细胞BMP7蛋白表达的Western blot检测结果：可见相对分子质量约为18000的特异性条带。⑥转染后软骨细胞蛋白表达的免疫荧光检测结果：转染7，28d的软骨细胞核周围均可见绿色荧光，未转染的软骨细胞未见BMP7蛋白表达。⑦转染后软骨细胞原位杂交检测结果：转染pcDNA3.1-BMP7质粒且G418筛选7，28d的软骨细胞细胞核周围均呈黄褐色，未转染的软骨细胞未见BMP7表达。 结论：用脂质体将pcDNA3.1-BMP7 DNA质粒转染至兔关节软骨细胞。BMP7在关节软骨细胞中获得表达，为软骨损伤的基因治疗及用作种子细胞构建组织工程软骨奠定实验基础。     

体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定

背景:骨髓间充质千细胞的定向分化需要合适生长因子的调控,利用细胞因子基因转染促进其生长,定向分化和加速骨缺损修复是近年来研究热点.目的:探讨在体外培养条件下转染碱性成纤维细胞生长因子基因对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响.方法:将含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体DH-5α菌扩增,用EndoFree质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒,并对所提取的pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒进行酶切鉴定和测序.利用脂质体将pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代骨髓间充质干细胞,G418筛选获得抗性克隆.采用荧光定量PCR、免疫组化、免疫荧光、Westem-blot检测转染后骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因及其产物的表达,流式细胞仪检测细胞增殖周期.结果与结论:脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染骨髓间充质干细胞后,转染细胞确实表达碱性成纤维细胞生长因子,且表达部位丰要位干胞浆.转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高(P<0.05).提示采用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的骨髓间充质干细胞,碱性成纤维细胞生长因子基因转染后可改善骨髓间充质干细胞的生存状态,促进其增殖.     

重组pcDNA3.1-hBMP-2转染兔脂肪干细胞体外诱导的成骨分化

背景：骨形态发生蛋白2具有很强的诱导干细胞成骨活性。目的：构建人骨形态发生蛋白2基因真核表达载体,探讨其转染脂肪干细胞后的成骨效果。方法：通过噬菌斑原位杂交筛选人混合细胞cDNA文库获得人骨形态发生蛋白2基因,与真核表达载体pcDNA3.1-连接,构建重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2。利用脂质体LipofectamineTM2000分别介导人骨形态发生蛋白2基因、EGFP基因转染第4代脂肪干细胞,并经G418进行筛选。结果与结论：酶切鉴定及DNA测序结果证实重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2构建成功。经计算脂质体介导的脂肪干细胞瞬时转染率为（18.0±0.42）%,并经过G418筛选后获得了稳定转染的细胞。细胞生长曲线表明转染后对脂肪干细胞生长、增殖无明显影响。ELISA检测发现人骨形态发生蛋白2组的人骨形态发生蛋白2因子表达量均高于EGFP组及未转染组,且能够稳定表达。经人骨形态发生蛋白2基因转染的脂肪干细胞的Ⅰ型胶原含量、碱性磷酸酶活性以及钙结节数目均比EGFP组及未转染组有明显升高。     

核糖体蛋白L6对K562/A02细胞耐药性及凋亡的影响

本研究观察核糖体蛋白L6（RPL6）基因表达的改变对白血病细胞耐药性的作用及其可能的机制。通过RT-PCR方法获得RPL6 cDNA序列,用真核表达载体pcDNA3.1（＋）分别构建正向插入和反向插入的RPL6 cDNA重组质粒。以脂质体将正义RPL6 cDNA真核表达质粒转染K562细胞,将反义RPL6 cDNA真核表达质粒转染K562/AO2细胞。以MTT、流式细胞术和荧光分光光度计观察RPL6对化疗药物耐药性、凋亡和caspase-3的作用。结果表明：转染正义RPL6 cDNA真核表达质粒后,K562细胞对阿霉素的耐药性增强到原来的325%,凋亡和caspase-3活性明显降低（P〈0.005）;转染反义RPL6 cDNA真核表达质粒后,K562/A02细胞对阿霉素的耐药性降低原来的38%;凋亡和caspase-3活性明显增加（P〈0.005）。结论：RPL6基因过表达通过改变药物诱导的凋亡在K562/A02细胞耐药性的形成中起重要作用。     

碱性成纤维细胞生长因子荧光真核表达载体构建及对过氧化氢诱导血管内皮细胞凋亡的影响

背景：已证实外源性碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）可抑制血管内皮细胞凋亡。目的：构建表达bFGF的荧光真核表达载体,探讨其对过氧化氢（H2O2）诱导的血管内皮细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响。方法：通过基因亚克隆构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,利用脂质体介导将bFGF基因导入人脐静脉内皮细胞内,通过荧光观察和RT-PCR检测基因的表达。实验分为3组,对照组（转染pcDNA3.1）、过氧化氢组（转染pcDNA3.1＋H2O2）和bFGF转染＋过氧化氢组（转染pcDNA3.1-bFGF-GFP＋H2O2）,流式细胞术测定细胞凋亡率,Western blot检测caspase-3 P17活性亚单位和Bax蛋白表达。结果与结论：成功构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,该载体转染人脐静脉内皮细胞后,bFGF mRNA显著增加,并可观察到绿色荧光。与对照组相比,过氧化氢组细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量都明显增加（P〈0.01）,而bFGF转染＋过氧化氢组的细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量则比过氧化氢组显著降低（P〈0.01）。证实bFGF基因转染能抑制过氧化氢诱导的血管内皮细胞凋亡,其作用机制可能与调控Bax蛋白表达和caspase-3活性有关。     

构建血红素氧合酶1基因真核表达质粒及在大鼠主动脉平滑肌细胞中的表达

目的：克隆血红素氧合酶1基因并构建其真核表达重组质粒，进一步检测血红素氧合酶1基因转染大鼠主动脉平滑肌细胞及其表达目的蛋白的效果。 方法：实验于2007-02／12在泸州医学院中心试验室完成。取雄性健康成年SD大鼠1只，腹腔注射氯化汞（1mg／kg）24h后，麻醉状态下取肾脏，从大鼠肾组织中提取总RNA，通过反转录-聚合酶链反应扩增大鼠血红素氧合酶1基因片段，并将其克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，运用脂质体将重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1转染主动脉平滑肌细胞，通过反转录-聚合酶链反应和Western blot分析血红素氧合酶1基因细胞转染及表达的效果。 结果：经双酶切及测序鉴定证明，正确克隆了血红素氧合酶1基因并成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1。反转录-聚合酶链反应及Western blot分析显示血红素氧合酶1基因能成功转染主动脉平滑肌细胞并在mRNA水平和蛋白水平有效表达。 结论：①成功构建血红素氧合酶1基因真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1。②脂质体包裹重组质粒瞬时成功转染到体外培养的主动脉平滑肌细胞并得到有效表达。     

IL-21重组载体的构建及其诱导T细胞活化增殖的研究

目的构建小鼠IL-21基因真核重组表达载体,为IL-21基因治疗肿瘤奠定基础。方法分离BALB/c小鼠脾细胞,提取总RNA,经RT-PCR扩增IL-21基因片段,构建重组质粒pcDNA3.1(-)-IL-21,分组免疫小鼠,检测其脾细胞膜表面CD分子。结果重组质粒测序结果与GenBank中序列一致,大小为490 bp。核酸疫苗免疫组小鼠脾细胞表面CD分子表达量明显高于PBS和pcDNA3.1(-)空质粒组。结论成功的构建了重组质粒pcDNA3.1(-)-IL-21,该核酸疫苗免疫小鼠后,可有效地诱导其体内T细胞的活化增殖。     

pcDNA3.1-成骨生长肽真核表达载体在骨髓基质干细胞中的表达

背景：成骨生长肽具有明显的促进成骨细胞增殖、分化、成熟的作用。目的：观察成骨生长肽基因转染兔骨髓基质干细胞后的表达及表达产物对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响。方法：构建重组真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,并在脂质体介导下,将其导入兔骨髓基质干细胞。通过G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR方法检测成骨生长肽基因在骨髓基质干细胞内的表达,并观察转染pcDNA3.1-成骨生长肽后骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的情况。结果与结论：实验成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,转染pcDNA3.1-成骨生长肽的骨髓基质干细胞可见成骨生长肽mRNA的表达,同时羟脯氨酸的分泌水平增加,碱性磷酸酶活性增高。证实经pcDNA3.1-成骨生长肽转染的兔骨髓基质干细胞不仅可以表达成骨生长肽,而且具有向成骨细胞分化的特性。     

hIGF-1转基因促周围神经再生和抑制肌肉萎缩的实验研究

目的了解周围神经损伤后人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)体内转基因促周围神经再生和抑制肌肉萎缩的作用。方法构建hIGF-1的真核细胞表达质粒,90只雄性Wistar大鼠,建立坐骨神经再生室动物模型后随机分为3组。hIGF-1治疗组:挤压伤处神经外膜下即刻注射pcDNAhIGF-1和LipfectAmine混合液10μl(hIGF-1 DNA为4μg);模型组注射pcDNA3.1、LipfectAmine和生理盐水混合液10μl;空白对照组:不注射任何物质。根据不同的时间点(2天,7天,14天和28天)观察hIGF-1质粒转染、坐骨神经再生、骨骼肌萎缩、脊髓运动神经元细胞病理变化。结果不同时相再生神经纤维质和量、骨骼肌萎缩程度、中枢神经元的变化等hIGF-治疗组明显大于模型组和空白对照组(P0.01)。超微结构见hIGF-1治疗组的再生神经纤维成熟度优于其它两组。结论周围神经损伤后hIGF-1体内转基因能促进周围神经的再生和抑制骨骼肌的萎缩。     

外源性子宫珠蛋白基因对宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨人子宫珠蛋白（UG）基因对宫颈癌Hela细胞系细胞增殖及凋亡的影响。方法构建真核细胞表达载体pcDNA3．1-UG（＋），以脂质体介导法稳定转染体外培养的人宫颈癌Hela细胞，同时转染空载体pcDNA3．1质粒，以未转染细胞为对照，转染成功后分别命名为pcDNA3．1-UG（＋）／Hela组、pcDNA3．1／Hela组、Hela组。应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、Western blot方法分析目的基因表达，并采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法和流式细胞术检测细胞增殖和细胞凋亡。结果pcDNA3，1-UG（＋）／Hela组UGmRNA及UG蛋白出现明显的高表达，与对照组细胞相比差异有统计学意义（P〈0．05）；pcDNA3．1UG（＋）／Hela组细胞生长速度明显慢于未转染Hela细胞，其细胞凋亡率与未转染Hela细胞相比差异也有统计学意义；然而pcDNA3．1／Hela组细胞生长速度和凋亡率均无明显变化。结论转染UG基因能诱导Hela细胞凋亡及抑制Hela细胞生长。     

重组真核表达质粒pEGFP/hVEGF165转染兔成骨细胞条件的优化

背景：血管内皮生长因子能够提高骨细胞的增殖能力,促进骨折局部血管发生,在骨缺损修复过程中发挥着至关重要的作用。目的：优化重组真核质粒pEGFP/hVEGF165转染兔成骨细胞的条件,为构建新型组织工程骨种子细胞提供实验基础。方法：体外分离、培养并鉴定兔成骨细胞。分别应用0.8,1.0,1.2μg的质粒和1.5,2.0,2.5,3.0μL脂质体两两组合,通过脂质体法将重组真核表达质粒pEGFP/hVEGF165转染入兔成骨细胞,转染48h后倒置荧光显微镜下观察并测定转染率。结果与结论：随着脂质体剂量的增加,成骨细胞死亡增多。转染48h后,倒置荧光显微镜下可见细胞质内发绿色荧光的小颗粒成弥散分布,或在核周浓集成块状。其中,脂质体2.5μL和质粒1.2μg条件下的转染率最高,可达56%。说明质粒与脂质体之间的交互作用能够显著影响转染率,脂质体2.5μL和质粒1.2μg是转染兔成骨细胞的最佳条件。     

exendin-4类似物EW的降糖活性的研究

目的:通过动物体内降糖实验了解exendin-4类似物EW的生物活性。方法:分别对C57BL/6小鼠、db/db小鼠腹腔注射0.9%氯化钠液、EW及exendin-4,测定空腹及给药后血糖,了解EW的体内降糖活性。对C57BL/6小鼠腹腔注射小剂量EW、胰岛素及EW+胰岛素,了解EW对胰岛素的增敏作用。对昆明鼠腹腔注射EW,验证药物安全性。结果:EW的体内降糖活性与exendin-4相当。随EW剂量增大,降糖活性增加。小剂量EW对胰岛素有增敏作用。超大剂量腹腔注射EW是安全的。结论:动物体内活性实验说明EW是一种很有前景的抗糖尿病药物。     

人PIF1全长基因及其截短体真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人PIF1基因5端、3端及全长基因的真核表达载体。方法从pCR2.1-TOPO-PIF1原始质粒中,采用PCR方法扩增目的基因PIF1,PIF1N及PIF1C,将目的基因和目的载体pcDNA3.1（-）分别酶切;纯化酶切产物后定向连接,并将其转化大肠杆菌DH5α,对生长出的克隆行特异限制性内切酶酶切鉴定,鉴定为阳性的克隆送样测序。结果凝胶成像结果显示重组基因pcDNA3.1（-）-PIF1,pcDNA3.1（-）-PIF1N及pcDNA3.1（-）-PIF1C酶切后条带大小分别为1 926,540,1 428bp。结论成功构建hPIF1基因5端、3端及全长基因表达载体,分别为pcDNA3.1（-）-PIF1N,pcDNA3.1（-）-PIF1C及pcDNA3.1（-）-PIF1。