人脐静脉内皮胞细体外培养及鉴定

目的探索人脐静脉内皮细胞体外培养及鉴定的方法。方法采用0.1%Ⅰ型胶原酶分离脐静脉内皮细胞,加入含10%胎牛血清及人AB血清的M1640培养基,在37℃,5%CO2孵箱中培养,以免疫组化方法对内皮细胞进行鉴定。结果原代培养细胞在接种4 h后开始贴壁生长,5～7 d后融合成单层,倒置相差显微镜下观察细胞呈鹅卵石状排列,有接触抑制现象,免疫组化显示细胞胞浆中人Ⅷ因子相关抗原阳性。结论用胶原酶灌注消化脐静脉是获得内皮细胞的一种可靠的方法,有助于体外研究血管内皮细胞模型的构建。     

妊娠期高血压病患者胎儿脐静脉内皮细胞模型的建立及血管紧张素Ⅱ表达的检测

目的：探索建立妊娠期高血压病患者胎儿脐静脉内皮细胞模型的优化方法并对该细胞模型中血管紧张素Ⅱ表达量进行分析。方法：取妊高症孕妇脐带（约8cm）,用PBS冲洗和灌注胰蛋白酶（浓度为1%）消化法分离脐静脉内皮细胞,用McCoy＇s 5A培养基进行原代和继代培养;用吖啶橙（AO）细胞荧光染色进行细胞的形态学鉴定;用免疫组织化学分析所分离细胞的来源;用Western blotting检测血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的表达情况。结果：利用1%的胰蛋白酶灌注消化可以获得大量的原代细胞,并且在不添加任何生长因子的情况下,使用McCoy＇s 5A培养基进行原代和继代培养可以实现连续传代6代以上,且细胞状态良好,生长稳定。AO染色鉴定显示细胞边缘平整,细胞核小且形态完整,符合正常细胞的形态。免疫组化鉴定结果表明在所分离的细胞中人VⅡI因子及血管内皮生长因子（VEGF）相关抗原呈强阳性。Western blotting检测发现在所分离的细胞中AngⅡ表达量远远高于普通细胞[（90.20±5.84）%,P=0.0130]。结论：1%浓度的胰蛋白酶灌注消化法与McCoy＇s 5A培养基培养法是体外建立妊娠期高血压病患者胎儿脐静脉内皮细胞模型的高效经济的方法,该模型高表达血管紧张素Ⅱ,推测AngⅡ可能是诱发妊高症的原因之一。     

胰蛋白酶消化法体外培养和鉴定人脐静脉血管内皮细胞

背景:体外建立稳定可靠的人脐静脉血管内皮细胞模型,目前培养方法缺乏统一的标准。目的:探索脐静脉内皮细胞的体外培养的方法。方法:采用2.5g/L胰蛋白酶和0.02%EDTA消化、分离、体外原代培养及消化传代脐静脉内皮细胞,简化完全培养液组分(不添加血管内皮细胞生长因子、肝素等辅助因子),当原代培养细胞80%以上汇合,根据细胞特有的形态学特征和Ⅷ因子进行内皮细胞的鉴定。结果与结论:种植在培养瓶中的内皮细胞2h贴壁生长,24h换液后内皮细胞80%融合,细胞状态好,内皮细胞呈单层铺路石样外观,经过镜下观察和Ⅷ因子相关抗原鉴定证明是脐静脉内皮细胞。证实用胰蛋白酶灌注脐静脉是一种简单、实用的获得人脐静脉血管内皮细胞的方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型。     

人脐静脉血管内皮细胞分离与原代培养体会

目的:探讨分离人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)和原代培养的可靠方法与经验.方法:利用0.1%胶原酶消化、分离、体外原代培养脐静脉血管内皮细胞,0.125%胰酶-0.02%EDTA溶液消化传代,根据细胞特有的形态学特征和Ⅷ因子、CD31细胞免疫组化及对乙酰化LDL高摄取试验进行内皮细胞鉴定.结果:脐静脉血管内皮细胞的体外原代培养、传代生长均良好,呈典型的铺路石样形态学表现,Ⅷ因子、CD31细胞免疫组化显示阳性反应,及Dil-Ac-LDL摄取荧光检测提示其具有强摄取能力,从而鉴定为血管内皮细胞.结论:本方法获得的HUVEC量多,方法简单、可靠,为血管内皮细胞的研究提供实验模型.     

人脐静脉内皮细胞体外培养、鉴定与形态学特征观察

目的：建立人血管内皮细胞的培养模型，为体外研究动脉硬化发病机制提供重要的实验手段。方法：采用1．25g／L胰蛋白酶(2．5g／L胰蛋白酶：0．2g／LEDTA：1：1V／V)消化、分离和传代人脐静脉内皮细胞，并用光镜、电镜和免疫组化等方法进行内皮细胞的形态观察和鉴定。结果：原代培养的内皮细胞在接种后约2h开始贴壁生长，光镜下内皮细胞呈铺路石状镶嵌排列；免疫组化可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应；电镜下可见胞浆中有W-P小体，证实培养的细胞为内皮细胞。结论：用胰酶灌注消化脐静脉可获得高纯度的内皮细胞，细胞存活率高。本方法为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。     

胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶消化获取关节软骨细胞

背景:近年来,众多研究欲采用体外分离培养的关节软骨细胞作为修复缺损的关节软骨的种子细胞,然而,获得纯化的具有生物活性的关节软骨细胞较为困难.目的:拟运用胰蛋白酶与Ⅱ型胶原酶联合消化获取关节软骨细胞.方法:从SD大鼠的正常股骨及胫骨关节表面获取关节软骨,先后运用0.25%的胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原酶消化,显微镜下见大量细胞游离后,弃去大块的未消化的关节软骨碎片,离心,去上清,PBS洗涤2次后,加入软骨细胞原代培养液进行培养、增殖.应用甲苯胺蓝及苏木精-伊红染色方法检验所得细胞是否为关节软骨细胞.结果与结论:在严格掌握酶的浓度及消化时间的前提下,通过0.25%胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原酶联合酶解关节软骨的方法,成功从大鼠股骨及胫骨关节软骨内分离培养出细胞,并经过甲苯胺蓝染色及苏木精-伊红染色证实,所得的细胞为具有生物活性的关节软骨细胞.     

人宫颈癌细胞的体外培养及鉴定

背景:由于肿瘤存在个体差异,对癌株的研究不能准确反映个体之间的差异,原代细胞培养则与体内状态更相近。目的:体外培养建立宫颈癌细胞原代培养方法。方法:采用胰蛋白酶及Ⅰ型胶原酶联合消化法从23例新鲜宫颈癌组织获取宫颈癌细胞,测定其细胞生长曲线,并用免疫荧光染色检测细胞表面标记物CD44、CK17进行鉴定。结果与结论:23例中有21例成功从宫颈癌组织中获取宫颈癌细胞并能连续传代,稳定增殖,免疫荧光染色显示宫颈癌细胞表面标记物CD44、CK17表达呈阳性。说明胰蛋白酶及Ⅰ型胶原酶联合消化法能成功分离原代宫颈癌细胞。     

人脐静脉内皮细胞体外培养、鉴定与形态学特征观察

目的:建立人血管内皮细胞的培养模型,为体外研究动脉硬化发病机制提供重要的实验手段。方法:采用1.25g/L胰蛋白酶(2.5g/L胰蛋白酶:0.2g/LEDTA=1∶1V/V)消化、分离和传代人脐静脉内皮细胞,并用光镜、电镜和免疫组化等方法进行内皮细胞的形态观察和鉴定。结果:原代培养的内皮细胞在接种后约2h开始贴壁生长,光镜下内皮细胞呈铺路石状镶嵌排列;免疫组化可见内皮细胞胞浆中人第VIII因子相关抗原呈阳性反应;电镜下可见胞浆中有W-P小体,证实培养的细胞为内皮细胞。结论:用胰酶灌注消化脐静脉可获得高纯度的内皮细胞,细胞存活率高。本方法为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。     

原代脐静脉内皮细胞与脐静脉内皮细胞株的培养方法及生物特性的比较

目的建立一套成功率高,细胞污染率少,获得较多的细胞数的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的体外分离方法,并且将原代脐静脉内皮细胞与EA.HY926人脐静脉内皮细胞株生物特性进行对比研究,为细胞培养及相关的医学基础研究提供依据。方法在新鲜(健康剖宫产产妇分娩后立即取新生胎儿脐带,长度15～20 cm,取标本时间≤4h)脐静脉内注0.1%的Ⅱ型胶原酶消化获得内皮细胞,用M199生长液(含25%的内皮细胞生长因子)进行培养,EA.HY926细胞株用M199生长液。比较两组细胞的形态、超微结构、细胞纯度检测CD31抗体表达。结果①形态:原代HUVEC体外生长3～4 d可铺满单层,细胞呈梭形、饱满,漩涡状排列生长,传代后可见管腔样结构;EA.HY926细胞株胞质多颗粒,2～3可铺满单层,可长成复层。②超微结构:透射电镜下,原代HUVEC里可发现较多的横切与纵切的韦伯潘力小体,在EA.HY926细胞株里较少。③细胞纯度检测:CD31抗体的表达率原代HUVEC细胞大于EA.HY926细胞株,两种细胞CD31表达差异有统计学意义(P﹤0.001)。结论脐静脉注Ⅱ型胶原酶消化法配合M199生长液可迅速获取大量内皮细胞,其生物学特性明显优于HUVEC株,而细胞株则以细胞数量多,培养方法简单,成活率高为特点,两者均是组织工程及相关医学基础研究较好的细胞来源。     

血管内皮细胞体外培养方法的实验研究

目的:研究人脐静脉内皮细胞分离培养和鉴定的方法.方法:胰蛋白酶消化脐静脉,脐静脉内皮细胞培养液,贴壁法,37℃,5%CO2细胞培养箱中原代培养,培养2周后免疫组织化学染色鉴定内皮细胞.结果:培养的内皮细胞的形态学观察到脐静脉内皮细胞一般2 h就能贴壁,24 h后,变成梭形.形成数量不等的细胞群.48～72h后生长最快,约5～7 d细胞融合成单层,呈典型的镶嵌状铺路石样.内皮细胞鉴定示90%以上vWF胞浆内阳性显色.结论:脐静脉来源的内皮细胞数量,可以满足实验研究需要.     

人脐带间充质干细胞高效分离的方法

背景：目前利用传统分离提取细胞的方法所获取的人脐带来源的间充质干细胞与脐带组织中所含人脐带来源的问充质干细胞的理论值相差甚远,造成脐带组织的极大浪费,阻碍了间充质干细胞的规模化制备培养。目的：建立一套高效分离人脐带间充质干细胞的方法,为间充质干细胞应用于临床提供技术方案。方法：实验分为4组,以传统酶法（胰酶与Ⅱ型胶原酶）为对照组,在此基础上,针对脐带结构分别逐一加入Ⅳ型胶原酶、透明质酸酶、DNase来对脐带组织进行消化,各实验组设不同作用时间组,比较不同分离方法、不同作用时间所获得细胞数量、细胞活性、原代细胞贴壁出现时间、融合时间及所获得人脐带来源的间充质干细胞第3代细胞在增殖能力、表面标记与多向分化能力方面的差别。结果与结论：经Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶和DNAase联合作用于脐带组织,4h细胞计数达到最高（12．47±0．16）×10^6/cm（P〈0．01）;活力为（75．00±5．07）％（P〈0.01）：收获的混合细胞中CD105阳性率及CD29阳性率均高于对照组;细胞贴壁及细胞团融合时间均较对照组缩短（P〈0．01）;伴随细胞的传代,形态逐渐均一,第3代细胞形态基本达到统一,呈梭形漩涡状生长;实验组P3人脐带来源的间充质干细胞特异性标记CD44,CD105,CD29阳性率阳性率均高于对照组,CD34阳性率低于对照组。向脂肪细胞诱导4周后,油红O染色鉴定可见细胞内大量脂滴：向成骨细胞诱导后,茜素红染色鉴定,大体观察可见阳性钙沉积。实验证明了Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶和DNAase四酶联合消化脐带组织作用4h的方法缩短了分离细胞用时并显著提高了细胞产量、细胞活力以及细胞增殖能力,同时缩短原代细胞贴壁时间、融合时间。提取得到的原代细胞中间充质干细胞比例,第3代间充质干细胞细胞纯度较传统方法均有提高。     

人脐带来源间充质干细胞分离培养方法的优化

背景：关于人脐带间充质干细胞的分离培养方法不一,如何提高人脐带来源间充质干细胞获得效率的问题尚未解决。目的：优选人脐带来源间充质干细胞制备的消化酶组分。方法：无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带近胎儿段,按不同混合酶浓度比值划分为3组,混合酶Ⅰ组成分为0.4%Ⅱ型胶原酶、0.1%胰酶、0.02%EDTA和0.1%透明质酸酶;混合酶Ⅱ组成分为0.1%Ⅱ型胶原酶、0.4%胰酶、0.02%EDTA和0.1%透明质酸酶;混合酶Ⅲ组成分为0.3%Ⅱ型胶原酶、0.1%胰酶、0.02%EDTA、0.1%透明质酸酶和0.1%DNA酶。每组再按消化时间分为1,2,3h3个亚组。最后重悬细胞终体积均定位4mL并计数,采用含血清的DMEM培养液体外培养细胞。结果与结论：采用3种不同混合酶浓度进行消化,发现相同消化时间内,混合酶Ⅲ组消化细胞最多（P〈0.05）。在作用3h时,混合酶Ⅲ组获取的细胞中活细胞比值显著低于混合酶Ⅰ组和混合酶Ⅱ组（P〈0.01）。提示0.3%Ⅱ型胶原酶、0.1%胰酶、0.02%EDTA、0.1%透明质酸酶和0.1%DNA酶混合液消化脐带组织块2h为获取脐带间充质干细胞的最佳条件。     

烟酸抑制血管紧张素Ⅱ诱导的内皮细胞凋亡

目的探讨烟酸对血管紧张素Ⅱ诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的影响。方法分别使用不同浓度烟酸(0.25 mM,0.5 mM或1.0 mM)预处理HUVECs不同时间(1 h、3 h、6 h、12 h)后,使用血管紧张素Ⅱ(1μM)诱导HUVECs凋亡。终端转移酶介导的dUTP缺口标记技术(TUNEL法)检测内皮细胞的凋亡指数;H2DCF-DA荧光标记法测定细胞内氧自由基(ROS)的生成。结果预处理一定时间后,烟酸能抑制血管紧张素II诱导的HUVECs的凋亡,而且这种抑制呈浓度依赖性。HUVECs在使用1 mM烟酸预处理6 h后,血管紧张素II加烟酸(AngII+Niacin)组与血管紧张素Ⅱ(AngII)组相比,ROS的生成有明显降低(P<0.05)。结论烟酸能抑制AngII诱导的HUVECs凋亡,抑制ROS生成是可能的机制之一。     

梯度血清递减体外培养人脐带间充质干细胞

背景：人脐带间充质干细胞的扩增与培养条件密切相关,而含体积分数10%-20%胎牛血清的培养基可促进细胞生长。目的：建立梯度血清递减扩增培养脐带间充质干细胞的培养技术。方法：采用胶原酶Ⅱ消化分离获得脐带间充质干细胞悬液,并通过贴壁培养进行纯化,细胞贴壁后采用梯度血清递减方法,即第1代80%含血清培养基,20%无血清培养基;第2代50%含血清培养基,50%无血清培养基;第3代20%含血清培养基,80%无血清培养基;第4代100%无血清培养基。另一种传代中始终采用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM完全培养液。用流式细胞仪检测细胞的表面标记,进行成骨诱导试验,同时与经典的含10%胎牛血清的α-MEM培养体系进行比较。结果与结论：梯度血清递减培养法与经典α-MEM培养体系所获得的细胞在扩增能力、细胞形态、免疫表型等方面相似。细胞在两种培养体系中均能保持良好的分化潜能。但梯度血清浓度法培养间充质干细胞可使用更少量胎牛血清,提高临床应用安全性。     

血管紧张素Ⅱ诱导人脐静脉内皮细胞衰老及苦碟子注射液的干预研究

目的:观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)衰老的诱导作用,及苦碟子注射液的干预作用。方法:体外培养HUVECs,用AngⅡ(在10-6mol/LAngⅡ的DMEM培养液中48h)干预,分为实验对照组、AngⅡ诱导组和苦碟子注射液组(给予AngⅡ刺激前1h先加用10%苦碟子注射液)。采用CCK-8法检测细胞存活率,以衰老相关β-半乳糖苷酶活性和细胞的增殖能力两种衰老标志物为主要观察指标。其中衰老相关β-半乳糖苷酶活性采用免疫化学染色方法,流式细胞术检测细胞周期来反应细胞的增殖能力;利用Western印迹法检测小凹蛋白-1(Caveolin-1,Cav-1)的表达。结果:与对照组比较,AngⅡ诱导组细胞存活率明显下降,β-gal阳性染色率明显增多,细胞周期多停滞于G0/G1期,S期细胞逐渐减少,Cav-1蛋白表达水平明显上调,表明AngⅡ成功诱导了HUVECs衰老,而给予苦碟子注射液干预后上述变化改善。结论:苦碟子注射液可以延缓AngⅡ诱导HUVECs衰老,其作用机制可能与下调Cav-1蛋白表达有关。     

改良酶消化联合植块法培养兔骨膜成骨细胞

背景:骨膜成骨细胞具有很强的增殖能力和分化成骨潜能,而且取材方便,但以往常规培养方法时间较长,如伺能够缩短培养时间,是骨膜源性成骨细胞成为理想种子细胞的关键之一.目的:应用改良酶消化法培养兔骨膜原代成骨细胞,观察其在喷砂钛片上的黏附及增殖情况.方法:切取雄性日本大耳白兔胫骨近端前内侧面骨膜0.5～1.0 cm~2:①常规方法:以0.25%胰蛋白酶在37℃消化30 min后,用0.1%Ⅰ型胶原酶在37℃消化30 min,不断振荡,弃掉胰蛋白酶后植入培养瓶,干涸培养2 h,加入含体积分数15%胎牛血清的DMEM完全培养基培养.②改良方法:将Ⅰ型胶原酶消化时间由30 min改为1 h.碱性磷酸酶染色、钙结节染色鉴定成骨细胞.将原代培养成骨细胞与喷砂钛片联合培养,采用扫描电镜、MTT法检测不同时间点成骨细胞在喷砂处理钛片上的黏附及增殖情况.结果与结论:培养第5天,改良法培养的骨膜成骨细胞从组织块周围爬出,第25天细胞汇聚成单层,细胞呈三角形或多角形;传代培养1个月后,可见细胞成复层生长,并有黑色钙结节生成,具有典型的成骨细胞形态特征,碱性磷酸酶染色、钙结节染色呈阳性.常规法培养的细胞爬满单层时间推迟12 d左右.在喷砂处理的钛片表面上成骨细胞立体感强,有伪足伸出,伪足嵌入小的孔洞内,细胞表面有基质分泌.两种方法培养的成骨细胞在钛片表面的黏附及增殖差异无显著性意义.提示改良消化法可明显缩短成骨细胞培养时间,对成骨细胞的黏附及增殖能力无影响.     

人脐带羊膜来源和骨髓来源间充质干细胞的免疫调控特征比较

本研究旨在比较人脐带羊膜来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)与骨髓来源MSC的免疫调控能力,为临床开展异基因造血干细胞移植提供实验依据。采用胶原酶消化法分离人脐带羊膜贴壁细胞,并从细胞形态、生长特性、细胞表型、多向分化能力进行鉴定。利用淋巴细胞转化实验和混合淋巴细胞反应比较人脐带羊膜来源MSC与人骨髓来源MSC的免疫调控能力的差异。结果表明,人脐带羊膜来源和骨髓来源的MSC具有相似的生物学特征,即细胞呈成纤维样形态生长,并具有强大的体外扩增能力;流式细胞仪检测细胞表型结果显示,脐带羊膜来源MSC高表达CD73、CD90、CD105,而骨髓来源MSC表面标志CD34、CD45以及参与免疫反应的细胞表面分子HLA-DR和CD86等为阴性。其诱导多向分化能力结果表明,两组细胞均可向成脂肪、成骨和成软骨分化。混合淋巴细胞反应和淋巴细胞转化实验证明,两组MSC均可抑制异体T细胞的增殖,且随MSC数量的增加,抑制效应逐渐增强;RT-PCR检测显示两组MSC表达相同的免疫相关因子。结论:人脐带羊膜来源的MSC可以替代成人骨髓MSC,可作为满足实验和临床需要的MSC重要来源。     

构建组织工程皮肤种子细胞的人血管内皮细胞的培养

目的探讨如何以简便快捷的方法获得大量生长状态良好的人血管内皮细胞,以作为构建含血管组织工程皮肤的种子细胞。方法以新生儿脐带静脉作为细胞来源,用消化法获得血管内皮细胞,用本实验室设计的方法对细胞进行纯化培养,倒置显微镜观察细胞形态,结合免疫组化检测(第Ⅷ因子)和透射电镜(Weibel-Palade小体)鉴定细胞来源。结果用本实验室的纯化方法获得的血管内皮细胞未见成纤维细胞污染,细胞增殖旺盛,处于良好的生长状态。结论结果表明本实验方法可以获得大量处于良好生长状态的高纯度血管内皮细胞,可以用于含血管组织工程皮肤的构建。     

烟曲霉感染对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的观察烟曲霉菌丝感染后人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的凋亡情况。方法建立烟曲霉菌丝感染HUVEC的体外模型。实验分3组:①空白对照组,细胞不予任何刺激;②烟曲霉菌丝组Ⅰ(浓度10~5CFU/mL);③烟曲霉菌丝组Ⅱ(浓度10~6 CFU/mL)。流式细胞术分别于2、4和8 h 3个时相点检测HUVEC凋亡率。结果与2 h比较,暴露于不同浓度烟曲霉菌丝的HUVEC凋亡率在4和8 h逐渐增加(P<0.05);与空白对照组相应时间点比较,烟曲霉菌丝组Ⅰ和烟曲霉菌丝组Ⅱ的HUVEC凋亡率均明显增加(P<0.01),且烟曲霉菌丝组Ⅱ高于烟曲霉菌丝组Ⅰ(P<0.05)。结论烟曲霉菌丝可诱导HUVEC凋亡;一定时间内,随HUVEC接触菌丝时间的延长,凋亡率增加;相同时间点,烟曲霉菌丝浓度越高,HUVEC凋亡率越高。