三种细胞因子组合诱导小鼠骨髓单个核细胞跨越分化肝细胞的研究

目的探索诱导小鼠骨髓来源单个核细胞向肝细胞分化的诱导条件。方法首先通过密度梯度离心的方法获得小鼠骨髓来源单个核细胞,用添加20 ng/ml HGF、10 ng/ml FGF-4、10 ng/ml OSM和10%NBS的IMDM培养液诱导这些细胞向肝细胞分化。结果小鼠单个核细胞在三种细胞因子的诱导下,随诱导时间延长逐渐体积增大、形态上向上皮样转变,胞浆丰富,出现双核或多核细胞;半定量RT-PCR的结果显示,AFP和CK19的表达量在诱导初期首先增加,并且在诱导后期逐渐减少。而CK18、ALB和TAT的表达与诱导时间呈线性关系;免疫荧光检测诱导3周后的细胞,AFP、CK19、CK18和ALB均为阳性表达;诱导3周的细胞PAS糖原合成反应呈阳性,说明已经具备糖元合成和储存这一个肝细胞的特征性功能。结论组合HGF、FGF-4和OSM三种细胞因子可以诱导小鼠单个核细胞向肝细胞分化。     

诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的实验研究

目的：探讨肝细胞生长因子（HGF）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）诱导骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）分化为肝样细胞的可行性。方法：经骨髓分离BM-MSCs并鉴定,将细胞按以下分组进行成肝诱导：G0组（阴性对照）、G1组（20ng·mL^-1 HGF）、G2组（20ng·mL^-1 HGF＋5ng·mL^-1 G-CSF）、G3组（20ng·mL^-1 HGF＋10ng·mL^-1 G-CSF）、G4组（20ng·mL^-1 HGF＋20ng·mL^-1 G-CSF）,PAS染色检测肝细胞合成糖原功能,利用RT-PCR检测分化肝细胞的甲胎蛋白（AFP）和白蛋白（ALB）表达。结果：G1～G4组BM-MSCs被诱导后呈现肝样细胞形态改变,以G3、G4明显,G0组细胞无类似变化。G1～G4组诱导第7、14天的细胞PAS染色阳性,G0组呈阴性染色;同一时间点,G1与G2、G3与G4比较,差异无统计学意义（P〉0.05）;而G3、G4与G2比较,G3、G4组阳性染色率较高（P〈0.05）。G1～G4组中,诱导AFP于第7天均表达AFP,第14天表达降低,第21天无表达（均P〈0.05）。ALB在第14天出现表达,第21天表达增多,呈上升趋势（P〈0.05）。G2与G1、G4与G3之同比较,AFP、ALB灰度比值差异无统计学意义（P〉0.05）;但G4、G3与G2比较,同一时间点间G4、G3表达水平较高（P〈0.05）。结论：应用HGF和G-CSF能诱导BM-MSCs向肝样细胞分化。但G-CSF需要达到合适浓度才能与HGF发挥协同作用。     

损伤肝脏条件培养液体外诱导小鼠骨髓单个核细胞分化为肝细胞的研究

目的探索小鼠骨髓单个核细胞（BMMNCs）体外诱导分化为肝细胞的可行性及方法。方法将四氯化碳注射的小鼠肝脏进行培养，收集上清液，用于诱导BMMNCs分化。观察细胞分化中的形态变化；在1、7、14、21d时，逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和免疫荧光反应检测甲胎蛋白（AFP）、细胞角蛋白18（CK18）、CK19、肝细胞核因子3β（HNF3β）、酪胺酸胺基转移酶（TAT）和白蛋白（ALB）基因的表达，过碘酸Schiff氏剂反应（PAS）检测细胞糖原合成。结果诱导组细胞呈肝细胞样变化；RT—PCR检测，第7天可见AFP、CK19基因表达，第14天AFP表达增强，第21天减弱；第14天可见ALB、CK18、HNF3β基因表达，且持续到第21天；第21天TAT表达。免疫荧光反应结果显示，第21天ALB、CK18、CK19、AFP表达呈阳性；同时PAS糖原合成反应也出现阳性。结论BMMNCs在损伤肝脏条件培养液诱导下可跨越分化为肝细胞，该方法的建立对分化机制研究有重要意义。     

骨髓间充质干细胞向肝样细胞的诱导及分化

背景:研究表明,在体外提供肝细胞及成纤维细胞生长因子等多种因子可诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化,但对其诱导的最佳环境还处于摸索阶段.目的:观察体外应用肝细胞生长因子和成纤维生长因子4等多种因子联合诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化能力.方法:采用全骨髓贴壁培养法分离、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,培养第3代时用肝细胞生长因子、成纤维生长因子4、胰岛素铁硒传递蛋白及地塞米松等联合诱导其向肝样细胞的分化.于诱导7,14,21 d后观察细胞形态变化,RT-PCR检测细胞白蛋白、甲胎蛋白、细胞角蛋白的mRNA表达;于诱导14,21 d行PAS糖原染色检测,并采用免疫细胞荧光法检测细胞白蛋白表达.结果与结论:随着诱导时间的延长,骨髓间充质干细胞表现为肝细胞样,并呈集落生长,肝细胞特异性标志物逐渐出现和成熟.细胞诱导至7 d出现甲胎蛋白mRNA表达,14 d表达增高,21 d时表达下降;14 d时细胞角蛋白18、白蛋白 mRNA和糖原出现表达,并随时间延长表达逐渐增加.细胞诱导14 d时,胞浆白蛋白出现表达,至21 d时表达增强.证实骨髓间充质干细胞在肝细胞生长因子、成纤维生长因子4等多种因子诱导作用下,具有强大的向肝细胞分化能力.     

骨髓间充质干细胞向肝样细胞的诱导及分化

背景：研究表明,在体外提供肝细胞及成纤维细胞生长因子等多种因子可诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化,但对其诱导的最佳环境还处于摸索阶段。目的：观察体外应用肝细胞生长因子和成纤维生长因子 4 等多种因子联合诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化能力。方法：采用全骨髓贴壁培养法分离、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,培养第 3 代时用肝细胞生长因子、成纤维生长因子 4、胰岛素铁硒传递蛋白及地塞米松等联合诱导其向肝样细胞的分化。于诱导 7,14,21 d 后观察细胞形态变化,RT-PCR 检测细胞白蛋白、甲胎蛋白、细胞角蛋白的 mRNA 表达;于诱导 14,21 d 行 PAS 糖原染色检测,并采用免疫细胞荧光法检测细胞白蛋白表达。结果与结论：随着诱导时间的延长,骨髓间充质干细胞表现为肝细胞样,并呈集落生长,肝细胞特异性标志物逐渐出现和成熟。细胞诱导至 7 d 出现甲胎蛋白 mRNA 表达,14 d 表达增高,21 d 时表达下降;14 d 时细胞角蛋白 18、白蛋白 mRNA和糖原出现表达,并随时间延长表达逐渐增加。细胞诱导 14 d 时,胞浆白蛋白出现表达,至 21 d 时表达增强。证实骨髓间充质干细胞在肝细胞生长因子、成纤维生长因子 4 等多种因子诱导作用下,具有强大的向肝细胞分化能力。     

不同浓度肝细胞生长因子及表皮细胞生长因子体外联合诱导兔骨髓间充质干细胞向肝细胞分化

背景：研究证实在多种微环境下可以将骨髓间充质干细胞诱导分化为成熟肝细胞,但诱导条件及诱导分化率尚无定论,选择合适的诱导剂及诱导剂浓度尤为重要。目的：观察肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子体外联合诱导兔骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的最适浓度。方法：不同浓度肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子联合诱导培养原代兔骨髓间充质干细胞,观察细胞形态学变化,并检测肝细胞表面标志物甲胎蛋白、白蛋白表达及肝细胞合成功能。结果与结论：随诱导时间延长,可观察到多极性的肝细胞样细胞。7d时甲胎蛋白表达阳性,14d达最大值后即开始下降（P〈0.05）,此后各浓度组间表达无差别（P〉0.05）。14d时白蛋白表达阳性,随时间延长,阳性细胞数递增（P〈0.05）,且细胞生长因子浓度越高,阳性细胞数越高（P〈0.05）。诱导早期（9～15d）白蛋白上清液中白蛋白水平与诱导剂浓度成正比（P〈0.05）。18d或21d达高峰后下降,此时各浓度组间含量无差别（P〉0.05）。结果显示高浓度的肝细胞生长因子及表皮细胞生长因子可提高骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化率,诱导剂最适浓度为肝细胞生长因子60μg/L、表皮细胞生长因子4.5mg/L。     

细胞移植对肝纤维化大鼠肝脏组织结构的影响

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenehymal stem cells,BMSCs）诱导分化的肝样细胞对肝纤维化的治疗作用。方法采用红细胞裂解法体外分离培养雄性sd大鼠的BMSCs并加入细胞因子（肝细胞生长因子,HGF）、酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）及制瘤素M（OSM）进行诱导,使BMSCs成为具有分泌AFP、清蛋白（ALB）等功能的肝样细胞,通过门静脉移植入肝纤维化模型大鼠体内后观察细胞的分布、分化情况及大鼠肝脏的光镜结构和超微结构的变化。结果肝纤维化模型大鼠经移植入诱导的肝样细胞后,肝细胞再生活跃,肝脏纤维组织明显减少,肝细胞超微结构基本恢复正常。结论肝样细胞移植对肝纤维化模型大鼠有明显的治疗作用。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞

目的:探讨肝细胞生长因子(hepatocyte growth ractor,HGF)作为诱导剂,体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,Mscs)分化为心肌细胞的作用.方法:分离培养大鼠MSCs,在第4代MSCs中添加HGF(20 ng/mL)对其进行诱导分化,观察细胞形态学的变化,采用荧光免疫组织化学及RT-PCR方法对分化细胞进行鉴定.结果:大鼠MSCs贴壁呈集落生长,有成纤维细胞样外观.诱导后细胞呈梭形,排列方向渐趋一致,有肌管样结构形成,未观察到转化细胞的自主搏动.Troponin T及Connexin43的表达呈阳性,并可见清晰肌小节.RT-PCR检测MLC-2A、MLC-2V、α-MHc、β-Actin mRNA表达阳性.结论:大鼠MSCs体外在HGF诱导下可定向分化为心肌样细胞.     

人脐带间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞及ERK1/2通路活化研究

目的探讨人脐带间充质干细胞(hucMSC)体外诱导分化为肝细胞样细胞(HLC)的机制。方法用组织块贴壁培养法分离、纯化和扩增hucMSC,观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志;经肝细胞生长因子(HGF)/碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)/抑瘤素M(OSM)联合诱导后,用RT-PCR、免疫荧光法检测肝细胞和hucMSC中特异基因AFP、ALB、TDO、CK18和ABCG2、CD44、OCT4及ALP、AFP、CK18蛋白的表达;用western blot检测经诱导后的hucMSC中ERK1/2信号通路活化情况。结果流式细胞术结果表明,分离培养的hucMSC表达干细胞特异性标志CD13、CD29、CD44,不表达造血干细胞标志CD34、CD45和HLA-DR;RT-PCR结果表明,诱导后的hucMSC ALB、AFP、TDO、CK18基因表达增强,ABCG2、CD44、OCT4表达降低;免疫荧光结果表明,hucMSC可在体外诱导分化为具有肝系细胞表型细胞,其ALP、AFP、CK18蛋白表达增强;western blot结果表明诱导后hucMSC的ERK1/2磷酸化水平增加。结论 hucMSC可在体外诱导分化为HLC,其机制可能与ERK1/2磷酸化相关。     

壳聚糖球形多孔微载体支持下培养的肝细胞功能及其代谢活性检测

背景：在肝细胞移植及生物型人工肝研究中,肝细胞培养仍然是其关键,如何方便地获取足够数量、活性较好、功能良好的肝细胞已经成为其首要问题。微载体培养技术作为一项体外高密度细胞培养技术,近年来已在肝细胞的体外培养中得到应用。目的：对壳聚糖球形多孔微载体培养的人肝细胞L-02进行定时的细胞功能和代谢活性检测。方法：对以自制的壳聚糖球形多孔微载体样本为支架培养的人肝细胞L-02进行定时的细胞功能检测（包括测定谷草转氨酶,谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶质量浓度）和代谢活性检测（包括检测培养基中白蛋白、尿素、葡萄糖含量）,其中实验组为壳聚糖球形多孔微载体支持下培养人肝细胞L-02,对照组为无壳聚糖球形多孔微载体支持下培养人肝细胞L-02,检测时间点为人肝细胞L-02培养的第1,2,3,4,5天。结果与结论：实验组和对照组测定的谷草转氨酶、谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶活性在前3d持续下降,第3天降到最低,而从第4天开始重新反弹上升;但白蛋白、尿素和葡萄糖水平在前3d持续上升,第3天升到最高值,而从第4天开始逐渐下降,实验组每天测定上述各项水平始终明显高于对照组（P〈0.05）,提示实验组中的人肝细胞L-02代谢活性较对照组增强。     

肝纤维化大鼠血清体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景：近年来临床运用骨髓间充质干细胞移植治疗晚期肝纤维化取得了较好疗效,但由于肝源稀少,骨髓干细胞体外分化为成熟肝细胞的技术仍然不成熟。目的：探讨骨髓间充质干细胞体外诱导其分化为肝细胞的可行性。方法：构建大鼠肝纤维化模型,分离、纯化并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞,制备正常及肝纤维化大鼠血清,取第3代骨髓间充质干细胞分组培养,分别加入以下培养基：DMEM＋体积分数10%胎牛血清;肝细胞生长培养基（HGM）＋体积分数5%胎牛血清;HGM＋5%正常大鼠血清;HGM＋5%肝纤维化大鼠血清;HGM＋5%肝纤维化大鼠血清＋25μg肝细胞生长因子。观察各组细胞形态变化,MTT法测定细胞生长曲线,采用Realtime-PCR检测甲胎蛋白和细胞角蛋白18的表达,溴甲酚绿法检测上清液中白蛋白水平,ELISA法检测培养上清液中转化生长因子β1表达。结果与结论：正常大鼠血清能促进骨髓间充质干细胞的增殖;肝纤维化大鼠血清对骨髓间充质干细胞促增殖作用最好,且能有效诱导其向肝细胞分化,联合使用肝细胞生长培养基能提高分化率。     

三种因子联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景:间充质干细胞的生物学特性及影响分化调控因子的研究认为,体外原代培养的间充质干细胞自然分化为肝细胞的比例较低,选择一种合适的诱导剂提高其分化为肝细胞的比例尤为必要.目的:以肝细胞生长因子、表皮生长因子及成纤维生长因子体外联合,验证其诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-08在潍坊医学院实验中心完成.材料:Sprague-Dawley大鼠40只,由潍坊医学院实验动物中心提供.方法:采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,取传至第3代细胞,设立2组:空白对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基;联合诱导组在此基础上,另加入10 μg/L成纤维生长因子、8 pg/L.肝细胞生长因子、8 μg/L表皮生长因子.主要观察指标:倒置显微镜观察诱导后细胞形态变化,免疫荧光染色观察甲胎蛋白及白蛋白的表达,PAS检测糖原的表达,靛青绿摄入情况,酶学检测谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的水平.结果:联合诱导组细胞呈多角形、卵圆形或圆形细胞的特征性改变,空白对照组骨髓间充质干细胞仍保持梭形或纺锤形.联合诱导组培养14 d可见白蛋白和甲胎蛋白免疫反应阳性细胞:诱导7 d时偶见PAS阳性细胞与靛青绿阳性细胞,随诱导时间延长,阳性细胞逐渐增多;诱导14 d时开始检测到谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的合成,21 d达高峰,之后下降.上述各指标空白对照组细胞均呈阴性.结论:成纤维生长因子、肝细胞生长因子与表皮生长因子体外联合应用,能够成功诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化.     

壳聚糖球形多孔微载体支持下培养的肝细胞功能及其代谢活性检测

背景:在肝细胞移植及生物型人工肝研究中,肝细胞培养仍然是其关键,如何方便地获取足够数量、活性较好、功能良好的肝细胞已经成为其首要问题。微载体培养技术作为一项体外高密度细胞培养技术,近年来已在肝细胞的体外培养中得到应用。目的:对壳聚糖球形多孔微载体培养的人肝细胞L-02进行定时的细胞功能和代谢活性检测。方法:对以自制的壳聚糖球形多孔微载体样本为支架培养的人肝细胞L-02进行定时的细胞功能检测(包括测定谷草转氨酶,谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶质量浓度)和代谢活性检测(包括检测培养基中白蛋白、尿素、葡萄糖含量),其中实验组为壳聚糖球形多孔微载体支持下培养人肝细胞L-02,对照组为无壳聚糖球形多孔微载体支持下培养人肝细胞L-02,检测时间点为人肝细胞L-02培养的第1,2,3,4,5天。结果与结论:实验组和对照组测定的谷草转氨酶、谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶活性在前3d持续下降,第3天降到最低,而从第4天开始重新反弹上升;但白蛋白、尿素和葡萄糖水平在前3d持续上升,第3天升到最高值,而从第4天开始逐渐下降,实验组每天测定上述各项水平始终明显高于对照组(P<0.05),提示实验组中的人肝细胞L-02代谢活性较对照组增强。     

肿瘤坏死因子α刺激骨髓间充质干细胞表达及分泌肝细胞生长因子

背景：有研究表明,肿瘤坏死因子α可以刺激骨髓间充质干细胞发挥免疫抑制功能,并促进骨髓间充质干细胞表达肝细胞生长因子。目的：观察肿瘤坏死因子α刺激大鼠骨髓间充质干细胞是否可以促进肝细胞生长因子的表达及分泌。方法：全骨髓贴壁法分离、纯化 SD 大鼠骨髓间充质干细胞,传代至第三四代使用。以 100 μg/L 肿瘤坏死因子α预刺激骨髓间充质干细胞 5 h 后弃去培养基,换上新鲜培养基作为实验组,以正常培养的骨髓间充质干细胞为空白组。采用倒置相差显微镜观察细胞形态;流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面标记物 CD29、CD34、CD44、CD45 的表达;RT-PCR 、Western blot 检测细胞肝细胞生长因子 mRNA 及蛋白表达;ELISA 测定细胞上清液中肝细胞生长因子水平。结果与结论：获得的骨髓间充质干细胞形态均一,呈典型的旋涡样生长。骨髓间充质干细胞表达 CD29＋99.45%,CD34-97.91%、CD44＋99.52%、CD45-98.42%;骨髓间充质干细胞中肝细胞生长因子 mRNA 及蛋白与上清液中肝细胞生长因子表达量呈时间依赖性增加,实验组肝细胞生长因子 mRNA 及蛋白与上清液中肝细胞生长因子的表达量明显高于空白组（P 〈 0.01）。说明肿瘤坏死因子α刺激骨髓间充质干细胞可以有效促进肝细胞生长因子的表达及分泌。     

脐带血单个核细胞体外培养分化为肝细胞的实验观察

目的探讨脐带血单个核细胞在体外定向分化为肝细胞的条件及能力,为建立脐血干细胞移植治疗慢性肝衰竭提供实验依据。方法采集脐带血分离单个核细胞后,在实验组加入成纤维细胞生长因子(FGF)及促肝细胞生长因子(HGF)、或FGF加胎肝上清液培养,对照组只加FGF培养,观察细胞生长分化状况,免疫组化检测两组人甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(Alb)。结果实验组可见类圆形及多边形细胞,呈类肝细胞形态,对照组大多为梭形细胞,未见多边形细胞;实验组细胞AFP、Alb免疫组化染色为阳性,对照组未见AFP,Alb阳性细胞。HGF的诱导分化效果优于胎肝上清液。结论脐带血单个细胞在HGF或胎肝上清液的诱导下可以定向分化为能分泌Alb及AFP的类肝细胞。