CD154反义RNA诱导Jurkat细胞的凋亡

目的 探讨CD154反义RNA诱导Jurkat细胞凋亡的作用。方法 应用RT－PCR扩增人CD154膜外段基因，以及T－A克隆技术和亚克隆技术构建CD154反义RNA的真核表达载体，并将其转染入Jurkat细胞中。应用电镜及流式细胞仪（FCM）检测观察Jurkat细胞的凋亡指标。结果 电镜观察CD154反义RNA转染的Jurkat细胞内可见凋亡小体，并且FCM检测显示一明显的凋亡峰。结论 CD154反义RNA可诱导Jurkat细胞凋亡。     

Jurkat细胞TCR基因重排对 BV CDR3的影响

目的探讨Jurkat细胞TCRBD2-BJ2基因重排对TCRβ链可变区互补决定区3（BV CDR3）可能产生的影响，为深入研究TCR基因重排奠定实验基础。方法RT-PCR扩增TCR BV26个亚家族CDR3区，结合TCR基因扫描（GeneScan）和基因测序技术，监测Jurkat细胞在增殖传代过程中以及在T细胞激活剂和超抗原SEA等刺激诱导后TCR BV CDR3谱系漂移及长度和序列变化。结果表达TCR BV8家族的单克隆细胞株Jurkat，在增殖传代过程中，以及经刺激诱导48或72h后，未监测到有TCR BV8以外的新的BV亚家族出现，BV8 CDR3长度和一级核苷酸序列也未发生变化。结论Jurkat细胞发生的TCR基因重排可能不引起TCR BV CDR3改变，因而对TCR BV CDR3区抗原识别特异性（即抗原特异性漂移）并未产生影响，但并不排除TCR发生改变的可能性。     

沉默BIRC7基因的Jurkat稳定细胞系建立

【目的】通过RNA干扰技术（RNAi）建立稳定性BIRC7基因沉默的Jurkat实验细胞模型。【方法】应用pSilencer4．1-CMVneo构建BIRC7shRNA表达载体，采用脂质体将载体导人Jurkat细胞，利用G418筛选出稳定表达shRNA细胞后，行RT-PCR和Westernblot等技术检测细胞BIRC7表达水平。【结果】成功筛选出分别携带二种重组shRNA表达的Jurkat细胞系。与对照组细胞相比，转染BIRC7 shRNA的细胞BIRC7 mRNA表达下降约〉70％，BIRC7蛋白表达减少〉60％。生长曲线显示生长速度减慢，细胞倍增时间延长，细胞凋亡率增加。【结论】稳定转染重组BIRC7 shRNA表达载体能有效干扰BIRC7基因表达，表明RNAi技术可以成为研究BIRC7基因功能的有效工具。BIRC7有可能成为T-淋巴母细胞性白血病／淋巴瘤治疗的潜在新靶点。     

胰腺十二指肠同源框基因PDX-1的体外扩增

目的 提取大鼠胰岛细胞瘤细胞株的RNA，以其中的mRNA为模板，扩增胰腺十二指肠同源框-1（Pancreatic Duodenal Homeobox-1）编码基因，并测定核苷酸序列，为进一步克隆及表达PDX-1cDNA奠定基础。方法 采用TIZOL方法进行RNA提取；通过RT-PCR方法扩增大鼠PDX-1cRNA；琼脂糖凝胶电泳检测后进行序列测定。结果 从大鼠胰岛细胞瘤细胞中提取了RNA，以其中的mRNA为模板扩增出大鼠PDX-1基因。经琼脂糖凝胶电泳鉴定为目的片断，经序列测定与Genebank公布的序列一致。结论 在国内首次成功的克隆了PDX-1基因。扩增时在5’端以限制性酶切住点进行限制，对进一步进行其克隆、表达研究以及对其生物学功能进行研究奠定了基础。     

类视网膜母细胞瘤结合蛋白8基因的PCR检测

目的通过检测类视网膜母细胞瘤结合蛋白8（Similar to retinoblastoma binding protein 8,STRBP8）在人食管上皮细胞癌变过程中的差异表达,为寻找食管癌特异性标志物和研究食管癌的发病机制提供新线索。方法从GenBank中获取STRBP8的基因序列,并根据其CDS区设计相应的引物;利用TRIZOL法提取食管癌细胞总RNA,通过RT-PCR对目的基因进行扩增。结果本实验从食管癌细胞中成功扩增出STRBP8的特定目的基因。结论 STRBP8在食管癌细胞中存在表达。     

在不同应激状态下MDM2基因对Jurkat细胞的作用

【目的】探讨MDM2基因在不同应激状态下对T细胞性白血病细胞株Jurkat增殖、凋亡和基因表达的影响。【方法】采用RNA干扰下调白血病细胞株Jurkat MDM2基因表达后，用Western blot、流式细胞术等方法检测Jurkat细胞在不同应激状态下的变化。【结果】无应激状态下，MDM2基因表达下降后，Jurkat细胞增殖减慢，细胞周期表现一定程度的G1-s阻滞；E2F1表达明显降低超过78％，p65表达下调超过58％；细胞损伤后，MDM2表达下调可导致细胞损伤修复减慢，增强紫外线和甲氨喋呤诱导凋亡作用，导致甲氨喋呤作用下Rb和Bax基因的表达相对增加。【结论】在不同应激状态下，MDM2基因表达下降广泛影响Jurkat细胞的增殖、凋亡和基因表达等生物学特性，提示MDM2基因有可能作为T细胞性白血病治疗的潜在新靶点。     

沉默BIRC7基因的Jurkat稳定细胞系建立

 【目的】 通过RNA干扰技术(RNAi)建立稳定性BIRC7基因沉默的Jurkat实验细胞模型。 【方法】应用pSilencer 4.1-CMV neo 构建BIRC7 shRNA 表达载体，采用脂质体将载体导入Jurkat 细胞，利用G418筛选出稳定表达shRNA 细胞后，行RT-PCR 和Western blot 等技术检测细胞BIRC7表达水平。 【结果】成功筛选出分别携带二种重组shRNA表达的Jurkat细胞系。与对照组细胞相比，转染BIRC7 shRNA的细胞BIRC7 mRNA表达下降约＞70％，BIRC7蛋白表达减少＞60％。生长曲线显示生长速度减慢，细胞倍增时间延长。细胞凋亡率增加。【结论】稳定转染重组BIRC7 shRNA表达载体能有效干扰BIRC7基因表达，表明RNAi技术可以成为研究BIRC7基因功能的有效工具。BIRC7有可能成为白血病治疗的潜在新靶点。     

毛细管电泳测定micro RNA346基因多态性的方法研究

目的建立micro RNA346基因多态性的毛细管电泳（CE）测定方法。方法采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取血清样品基因组DNA，PCR扩增micro RNA346目的基因，BciT130Ⅰ限制性内切酶酶切，产物用CE测定。对CE筛分介质质量浓度、分离电压等参数进行了优化。在优化的条件下（筛分介质质量浓度为10 g/L分离电压为12 kV)，分别测定类风湿性关节炎患者和正常人血清样品micro RNA346酶切产物，并对其进行基因分型。结果在优化的CE实验条件下（筛分介质质量浓度为10 g/L，分离电压为12 kV，25 min内可完成micro RNA346基因酶切产物检测。方法日内相对标准偏差（RSD）为0.43%～0.63%，日间RSD为1.49%～1.56%。用该法测定了96份类风湿性关节炎患者样品和43份正常人样品，结果均为micro RNA346 Ⅰ型，未发现micro RNA346 Ⅱ型。结论本研究建立的方法操作简单，具有高效、快速、样品用量少、自动化程度高等优点，适用于micro RNA类小分子RNA基因多态性的测定。     

恶性疟原虫新的PDZ包含蛋白编码区基因的分离与克隆

目的：分离、克隆一种新的恶性疟原虫PDZ结构域包含蛋白（PfPCP）编码区基因,并初步研究其红内期表达。方法：分析恶性疟原虫基因组3号染色体数据库,设计特异的引物,利用RT－PCR从恶性疟原虫海南株红内期mRNA扩增PfPCP编码区基因;利用生物信息学相关软件分析所扩增的基因;利用Western印迹法分析PfPCP在红内期的表达。结果：从恶性疟原虫mRNA扩增到的PfPCP编码区基因长度为2076bp cDNA克隆,编码蛋白长为691氨基酸,具有典型的PDZ结构域。Western印迹显示,该基因在红内期裂殖体期特异性表达。结论：获得新的恶性疟原虫PfPCP编码区基因,该基因在恶性疟原虫红内期裂殖体期特异性表达。     

PSD-95结构域PDZ1与腺病毒穿梭载体重组体的构建

目的 构建突触后致密物质-95（PSD-95）结构域PDZ1腺病毒重组体.方法 以异硫酸氢胍-酚-氯仿一步法提取的总RNA为模板,采用反转录PCR（RT-PCR）法获得PDZ1的cDNA;与腺病毒穿梭载体用T4 DNA连接酶连接;连接产物转化大肠杆菌JM109进行筛选、序列测定.结果 ①提取到未降解的总RNA;②经RT-PCR得到了PDZ1的cDNA;③酶切鉴定能观察到PDZ1和pAdTrack-CMV两条带;④PDZ1测序图谱与文献报道完全一致.结论 获得了含目的基因PDZ1的腺病毒穿梭载体重组体.     

抑制CD147表达对Jurkat T淋巴细胞集落形成的影响

目的研究小干扰RNA抑制CD147基因对Jurkat T淋巴细胞集落形成的影响。方法将CD147特异的siRNA,经LipofectamineTM2000转染Jurkat细胞48 h后,用半定量RT-PCR检测CD147 mRNA水平的变化,Western blot和流式细胞术（FCM）分别检测总蛋白和细胞表面蛋白水平的变化。通过荧光倒置显微镜比较特异性抑制CD147表达后Jurkat细胞集落形成的变化。结果与对照组相比siRNA干扰组细胞CD147 mRNA和蛋白水平的表达均降低,抑制率分别为（38.57±1.55）%和（47.4±1.47）%,细胞表面CD147的平均荧光强度（MFI）下降（50.5±4.7）%（P〈0.05）。随着CD147被抑制,siRNA干扰组细胞集落形成明显少于对照组（P〈0.05）。结论通过siRNA能抑制Jurkat细胞CD147的表达,随着CD147表达下降细胞集落的形成减少,提示CD147可能在炎症细胞粘附聚集中起到一定作用。     

在不同应激状态下MDM2基因对Jurkat细胞的作用

[目的]探讨MDM2基因在不同应激状态下对T细胞性白血病细胞株Jurkat增殖、凋亡和基因表达的影响.[方法]采用RNA干扰下调白血病细胞株Jurkat MDM2基因表达后,用Western blot、流式细胞术等方法检测Jurkat细胞在不同应激状态下的变化.[结果]无应激状态下,MDM2基因表达下降后,Jurkat细胞增殖减慢,细胞周期表现一定程度的G1-S阻滞;E2F1表达明显降低超过78%,p65表达下调超过58%;细胞损伤后,MDM2表达下调可导致细胞损伤修复减慢,增强紫外线和甲氨喋呤诱导凋亡作用,导致甲氨喋呤作用下Rb和Bax基因的表达相对增加.[结论]在不同应激状态下,MDM2基因表达下降广泛影响Jurkat细胞的增殖、凋亡和基因表达等生物学特性,提示MDM2基因有可能作为T细胞性白血病治疗的潜在新靶点.     

人连接蛋白Connexin26基因的克隆、表达及初步鉴定

目的研究含人连接蛋白Connexin26（Cx26）基因的真核表达载体构建及其在非洲猴肾细胞（COS-7）中获得稳定、高效表达的方法。方法提取人外周血淋巴细胞RNA,经逆转录制备成cDNA,设计特异性引物,用PCR方法从cDNA中扩增Cx26基因,将其定向插入真核表达载体pCI-neo中获得pCI-Cx26重组子-采用酶切法和测序法鉴定。用脂质体将pCI-Cx26转染COS-7细胞,经G418筛选,获得阳性克隆。用RT-PCR和SDS-PAGE检测对表达产物进行检测。结果从人外周血RNA制备而成的cDNA中可扩增出预期大小的Cx26基因片段,pCI-Cx26经双酶切测序证实构建成功。RT-PCR和SDS-PAGE检测到pCI-Cx26在COS-7细胞中获得稳定、高效表达。结论本研究成功构建了人连接蛋白Cx26基因重组真核表达载体pCI-Cx26：pCI-Cx26脂质体转染COS-7细胞,可见Cx26基因在COS-7细胞中获得稳定、高效的表达。该结果为今后进行pCI-Cx26基因治疗Cx26基因突变引起的遗传性耳聋的研究奠定了实验基础。     

肾细胞癌中FHIT基因的研究

目的：探讨肾细胞癌中ＦＨＩＴ基因的改变及意义。方法：用ＲＴ－ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交法检测肾细胞癌及其细胞系中ＦＨＩＴ基因转录本,并观察其基因组的改变。结果：约８．３％（２／２４）肾细胞癌有异常转录本;其中一株细胞系ｃＤＮＡ在用外引物扩增时,只有一个变小的ＦＨＩＴ基因异常转录本;用内引物扩增时,ＦＨＩＴ基因转录本完全缺失。约２０％（５／２４）肾细胞癌ＦＨＩＴ基因区域的基因组ＤＮＡ出现重排。     

禽脑脊髓炎病毒VP3基因的克隆与序列测定

目的 对VP3进行克隆和测序，为禽脑脊髓炎病毒（AEV）的分子诊断以及更深一层次的分子和基因工程研究打下基础。方法利用RT-PCR技术，从AEVVR株感染的SPF鸡胚脑及内脏器官组织中提取病毒RNA并扩增出VP3目的基因，而后克隆到pMD18-T载体中，鉴定后进行序列测定。结果AEV VR株VP3基因全长735bp，共编码245个氨基酸，与AEV-1143标准毒株相应片段的核苷酸和氨基酸同源性分别为93％和97％；并将其与其他小RNA病毒进行了比较。结论本研究通过RT-PCR技术从体外成功扩增AEVVan-Roekel株VP3蛋白基因，并对其进行克隆、测序。     

构建单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因真核表达载体

从单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV－Ⅱ）Sav株感染的Hep-2细胞培养液和细胞裂解液中提取HSV－Ⅱ基因组DNSA，以此为模板，用PCR方法获取胸苷激酶（TK）基因，将获取的DNA片段克隆入真核表达载体pcDNA3中，筛选阳性克隆测序，结果表明：本研究获取的HSV－Ⅱ－TK基因全部编码区为1128bp，编码376个氨基酸，结果表明：本研究扩增出HSV－ⅡTK基因的全部编码区序列，并成功构建真核表达载体pcDNA3／TK.     

在mRNA水平验证SGLT2基因剪切突变的新方法

目的：由于实验技术的限制,在以往SGLT2基因突变筛查过程中未能对剪切突变在mRNA水平进行验证,因此本研究拟建立一种方便的验证SGLT2基因剪切突变的方法。方法：收集家族性肾性糖尿患者临床及家系资料,55名健康献血员作为对照。聚合酶链反应（PCR）扩增SGLT2基因14个外显子及其周围内含子区和启动子区,PCR产物直接测序法筛选突变。发现可能的剪切突变后,本研究用EB病毒转染B淋巴细胞的方法建立肾性糖尿患者的永生细胞系,提取永生细胞总RNA,应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增SGLT2编码的mRNA,经PCR扩增后直接测序的方法分析和验证剪切突变,从而确证剪切突变对mRNA的影响。结果：在家族性肾性糖尿患者中,发现了2个剪切突变位点（IVS 1-16 C〉A,IVS 11＋1 G〉C）,通过本研究建立的验证SGLT2基因剪切突变的方法,在SGLT2基因mRNA水平验证了剪切突变对mRNA的影响（IVS 1-16 C〉A：外显子3缺失,11＋1 G〉C：外显子11缺失）。结论：本研究解决了SGLT2基因mRNA在外周血有核细胞中表达量少造成mRNA获取困难的问题,建立了一种方便的验证SGLT2基因剪切突变的方法,为进一步探讨FRG的分子致病机制奠定了基础。     

人端粒酶RNA基因荧光原位杂交检测在宫颈细胞学检查中的应用

子宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤。广泛开展防癌筛查能够大大降低宫颈癌的发病率和病死率，但目前国际上通用的宫预脱落细胞形态学检查敏感性较低，人乳头状瘤病毒（HPV）检测特异性不高，均难以满足临床需要。人类染色体端粒酶RNA基因（hTERC）扩增与宫颈癌的发生存在密切关系，     

人纤维介素基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建人纤维介素（hfgl 2）基因的真核表达载体，并在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中表达。方法：提取人外周血单个核细胞的总RNA，逆转录得到cDNA，以其为模板，PCR扩增hfgl 2 cDNA片段，将目的片段通过T载体过渡克隆至表达载体pcDNA3．1，将重组质粒转染CHO细胞并制作细胞爬片，对爬片进行免疫组化染色，显微镜下观察并摄片。结果：扩增出1．3kb的目的片段，并将其克隆至pcDNA3．1，经酶切鉴定和测序鉴定无误；重组质粒转染CHO细胞，细胞爬片免疫组化染色可见细胞质中存在明显的阳性棕染。结论：成功构建hfgl 2基因的真核表达载体，为进一步探讨其功能学和干预研究奠定了基础。     

宫颈脱落细胞中人端粒酶RNA组分基因表达在宫颈病变中的临床价值

目的：研究宫颈脱落细胞中人端粒酶RNA组分（hTERC）基因的表达,探讨其在宫颈上皮内瘤变（CIN）及鳞状上皮细胞癌（SCC）筛查与诊断中的价值。方法：采用宫颈液基细胞学（LCT）、高危型人乳头瘤病毒DNA（HC-Ⅱ）检测及组织病理学的检测,并以组织病理学为金标准,分级盲法使用荧光原位杂交（FISH）方法检测人端粒酶RNA（hTERC）基因的表达。结果：hTERC基因扩增在细胞病理学HSIL及以上病变组扩增率显著升高（P〈0.05）。hTERC基因的扩增率与组织病理学级别、HC-Ⅱ阳性率均显著正相关（均P〈0.01）。HC-Ⅱ阳性率与细胞学、组织病理学级别均显著正相关（均P〈0.01）。结论：在宫颈病变组织中可见hTERC基因的表达、扩增与宫颈细胞学和组织学异常以及HPV病毒感染正相关,hTERC基因的扩增与否可能作为判断有无宫颈高度病变及估计预后的指标之一。