非O157产志贺毒素大肠杆菌分离株亚碲酸钾抗性水平及抗性基因簇分析

目的 了解我国部分地区非O157产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)分离株的亚碲酸钾抗性水平、抗性基因簇及其关系.方法 使用平皿法检测亚碲酸钾抗性水平,采用PCR方法检测亚碲酸钾抗性基因簇.结果 在所检测的39株非O157 STEC中,仅有5株菌亚碲酸钾抗性水平介于128～512 μg/ml,同时携带亚碲酸钾抗性基因簇(terABCDE).另有2株菌的亚碲酸钾抗性水平为8 μg/ml,3株菌为2 μg/ml,其余29株菌均＜1 μg/ml,且这34株菌terABCDE均阴性.结论 大多数非O157 STEC分离株对亚碲酸钾敏感,在使用含亚碲酸钾的选择性培养基分离非O157 STEC时应慎重.     

黄连素和6种抗生素对大肠杆菌O157∶H7中国分离株产生志贺毒素的影响

目的：研究黄连素和6种常用抗生素对大肠杆菌O157：H7中国分离株产生志贺样毒素的影响。方法：利用志贺毒素对Vero细胞具有细胞毒性，并可使其释放乳酸脱氢酶（LDH）的原理，使用Vero细胞的细胞毒性检测试剂盒，检测培养基中的LDH的含量。结果：将大肠杆菌O157：H7在环丙沙星，氨苄西林，庆大霉素，链霉素，青霉素，红霉素的亚抑制浓度中培养后，可增加大肠杆菌O157：H7对Vero细胞的毒性，但不同菌株有差异，环丙沙星对大肠杆菌O157：H7的最小抑制浓度很低，但其对vero细胞毒性作用，随着药浓度的降低而增高，黄连素在试管内对大肠杆菌O157：H7没有抑制作用，和抗生素相比，黄连素对大肠杆菌O157：H7产生和释放志贺毒素比较小。结论：黄连素在试管内对大肠杆菌O157：H7的生长抑制作用不明显，其刺激大肠杆菌O157：H7产生和释放志贺毒素的作用较抗生素小。     

大肠杆菌O157：H7 OI115岛的多态性分析

目的研究大肠杆菌0157：H7测序菌株EDL933的OI115岛在肠杆菌科细菌中的分布。方法用PCR和杂交方法检测OI115岛的21个基因，同时进行该岛序列测定。结果OI115岛和SPI-1毒力岛的分布特点相似，具有种属局限性。仅在大肠杆菌中存在，在EPEC、CTEC、EAggEC均可检测到该岛的缺失形式，在沙门菌、志贺菌、耶尔森、摩根菌等其他肠杆菌科细菌中未发现该岛的存在。在不同类别的致泻性大肠杆菌中，Oi115岛也各有特点，共检测到该岛的3种存在形式。产生志贺毒素的大肠杆菌O157：H7菌株、2株EAggEC和2株不典型大肠杆菌均具有完整的OI115岛。在不产生志贺毒素的大肠杆菌O157中具有H5、H12、H29、H42、H11、H19、H26、H10、H21鞭毛型的菌株缺失了第3基因簇，具有H16鞭毛型的菌株第2、第3基因簇同时缺失。结论本研究发现，OI115岛在致泻性大肠杆菌中分布广泛，可能和病原菌的进化有关。     

大肠杆菌O157∶H7 OI115岛的多态性分析

目的研究大肠杆菌O157∶H7测序菌株EDL933的OI115岛在肠杆菌科细菌中的分布。方法用PCR和杂交方法检测OI115岛的21个基因,同时进行该岛序列测定。结果OI115岛和SPI-1毒力岛的分布特点相似,具有种属局限性。仅在大肠杆菌中存在,在EPEC、ETEC、EAggEC均可检测到该岛的缺失形式,在沙门菌、志贺菌、耶尔森、摩根菌等其他肠杆菌科细菌中未发现该岛的存在。在不同类别的致泻性大肠杆菌中,OI115岛也各有特点,共检测到该岛的3种存在形式。产生志贺毒素的大肠杆菌O157∶H7菌株、2株EAggEC和2株不典型大肠杆菌均具有完整的OI115岛。在不产生志贺毒素的大肠杆菌O157中具有H5、H12、H29、H42、H11、H19、H26、H10、H21鞭毛型的菌株缺失了第3基因簇,具有H16鞭毛型的菌株第2、第3基因簇同时缺失。结论本研究发现,OI115岛在致泻性大肠杆菌中分布广泛,可能和病原菌的进化有关。     

多重PCR-DHPLC技术检测肠出血性大肠杆菌O157:H7基因型的方法学研究

目的 开发肠出血性大肠杆菌O157:H7的多重PCR-变性高效液相色谱(DHPLC)检测方法 .方法 以编码大肠杆菌0157抗原的rfbE 基因、编码毒力因子的类志贺毒素(SLT)基因为目的 基因,选择2对引物,建立并优化了大肠杆菌O157:H7的多重PCR-DHPLC检测体系.扩增产物分别为224 bp和499 bp.结果 采用37株细菌验汪了该多重PCR具有良好的特异件.PCR榆测的灵敏度可达到4 CFU/ml.结论 实验证明,研究建立的多重PCR-DHPLC方法 可特异、灵敏地实现对大肠杆菌O157:H7的检测.     

EHEC O157:H7志贺样毒素Ⅱ(Stx2)的克隆表达与活性研究

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7志贺样毒素Ⅱ(Shiga like toxinⅡ,Stx2),并鉴定其生物学活性。方法采用PCR法自EHEC O157：H7基因组扩增志贺样毒素Ⅱ的编码基因stx2,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-11c(+)-six2,经测序鉴定后转化E．coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDS-PAGE、Western blot分析目的蛋白的表达。以EHEC O157：H7野生菌株作对照,通过对HeLa细胞的细胞毒作用及对小鼠攻毒实验,鉴定重组蛋白的生物学活性。结果扩增的stx2基因约1230bp；原核表达质粒pET-11c(+)-stx2经酶切和测序鉴定与预期序列一致；并在E．coli BL21 (DE3)中得到表达,蛋白表达率约25％；PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(M_r)约72×10~3；重组蛋白Stx2对HeLa细胞具有细胞毒作用,CD_(50)为35pg/ml；Stx2对小鼠致死剂量LD_(100)为10μg。结论成功克隆并表达了Stx2重组蛋白,为探讨O157：H7菌的感染机制及其防治研究奠定了一定的基础。     

多重实时荧光定量PCR检测肠出血性大肠杆菌O157:H7

目的 利用多重荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的定量方法.方法 选取肠出血性大肠杆菌O157:H7编码脂多糖基因(rfbE)和编码鞭毛抗原基因(fliC)作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan-MGB探针,探针的5'端分别用FAM和HEX进行荧光标记,3'端标记MGB.优化PCR扩增体系,对多重实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性评价,同时进行一定数量临床样本鉴定,与常规方法进行比较.结果 本研究所建立的多重实时荧光定量PCR方法可准确、特异地检测和鉴定肠出血性大肠杆菌O157:H7,能够有效甄别肠出血性大肠杆菌O157:H7与非H7菌株,其他菌株均无阳性结果;该方法的灵敏度可达到10 CFU/ml;定量检测的批间和批内变异系数均小于5%;对66例临床样本进行评价,结果显示15例肠出血性大肠杆菌O157:H7阳性,2例为肠出血性大肠杆菌O157:非H7阳性,其中16例与常规培养法结果符合,符合率达到98.49%.结论 本研究建立的检测肠出血性大肠杆菌O157:H7多重实时荧光定量PCR方法快速,结果准确、可靠,操作简便,为肠出血性大肠杆菌O157:H7的临床诊断、现场流行病学调查和食品安全监测提供了新的鉴定方法.     

EHEC O157:H7志贺样毒素Ⅱ结合亚单位Stx2B的基因克隆、表达与纯化

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157H7志贺样毒素B亚单位(Shiga liketoxin 2B,Stx2B),并对其初步纯化.方法设计引物采用PCR法自EHEC O157H7基因组扩增志贺样毒素B亚单位的编码基因stx2b,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-22b(+)-stx2b,经测序鉴定后转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,以Tricine-PAGE和Western blot分析目的蛋白的表达,并采用固相镍离子亲和层析纯化重组蛋白.结果扩增的stx2b基因约210 bp;原核表达质粒pET-22b(+)-stx2b经酶切和测序鉴定与预期序列一致;并在E.coli BL21(DE3)中得到高效可溶性表达,蛋白表达率约30%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约7×103;经固相镍离子亲和层析纯化后,蛋白纯度可达90.1%.结论EHEC O157H7志贺样毒素B亚单位的高效表达与初步纯化,有利于进一步的生物学性质研究.     

EHECO157∶H7志贺样毒素Ⅱ结合亚单位Stx2B的基因克隆、表达与纯化

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7志贺样毒素B亚单位(Shiga liketoxin2B,Stx2B),并对其初步纯化。方法设计引物采用PCR法自EHEC O157∶H7基因组扩增志贺样毒素B亚单位的编码基因stx2b,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-22b(+)-stx2b,经测序鉴定后转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,以Tricine-PAGE和Western blot分析目的蛋白的表达,并采用固相镍离子亲和层析纯化重组蛋白。结果扩增的stx2b基因约210bp;原核表达质粒pET-22b(+)-stx2b经酶切和测序鉴定与预期序列一致;并在E.coliBL21(DE3)中得到高效可溶性表达,蛋白表达率约30%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约7×103;经固相镍离子亲和层析纯化后,蛋白纯度可达90.1%。结论EHEC O157∶H7志贺样毒素B亚单位的高效表达与初步纯化,有利于进一步的生物学性质研究。     

EHEC O157:H7志贺毒素Ⅱ型A、B亚单位的表达及功能鉴定

目的 克隆、表达肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7志贺毒素(Shiga toxin,Stx)Ⅱ型A、B亚单位,并鉴定其免疫学功能.方法 从EHECO157:H7基因组中克隆编码Stx Ⅱ型A、B亚单位的基因,经测序、酶切后,导入表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌Topl0F',经诱导、纯化得到谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)-A和GST-B融合蛋白.分别用A、B亚单位融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得高免血清,观察A、B亚单位血清对小鼠进行毒素攻击的保护作用.结果 Stx Ⅱ型A、B亚单位的GST融合蛋白获得高效表达并纯化;A、B亚单位的高免血清可以保护小鼠对致死量毒素的攻击.结论 Stx Ⅱ型A、B亚单位蛋白可以作为EHEC O157:H7疫苗的候选分子,同时针对A、B亚单位蛋白的中和单抗可以对易感人群起到紧急保护作用.     

抗肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备抗肠出血性大肠杆菌O157:H7EspA单克隆抗体(mAb)。方法:以重组EspA蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术并且联合间接ELISA筛选只针对EspA的杂交瘤细胞株。以Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定mAb的Ig亚类,ELISA、Western blot及免疫荧光技术鉴定抗体的免疫学特性。结果:获得3株稳定分泌抗EspA杂交瘤细胞的mAb,Ig亚型分别为IgG1κ型、IgG2aκ型、IgG2bκ型。Western blot和免疫荧光分析表明,3株杂交瘤细胞制备的mAb腹水都能特异地结合重组EspA蛋白和识别O157:H7的EspA成分。结论:成功地制备了抗肠出血性大肠杆菌O157:H7EspA的mAb,并证明了该mAb的生物学活性,为深入研究肠出血性大肠杆菌O157:H7的致病机制提供新的手段。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7志贺毒素I型A亚基的表达与鉴定

目的表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7志贺毒素1型A亚基(Stx1A)重组蛋白并鉴定。方法从EHEC O157∶H7基因组中扩增编码Stx1A的基因,经测序无误后,克隆入表达载体pET-22b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),经诱导、纯化获得目的蛋白Stx1A,并对纯化的目的蛋白进行质谱鉴定。重组的Stx1A蛋白免疫BALB/c小鼠,观察小鼠抗血清与EHEC O157∶H7毒株特异性反应。结果 PCR扩增的Stx1A基因为945 bp,成功构建重组质粒pET22b(+)-Stx1a,重组蛋白在原核细胞中获得高效表达,通过AKTATM-His亲和层析柱获得纯化。质谱分析表明目的蛋白为Stx1A。Western blot显示鼠抗Stx1A血清可与EHEC O157∶H7毒株产生的天然毒素蛋白结合。结论成功克隆了EHEC O157∶H7 Stx1A基因,并获得重组表达,为后续研究奠定基础。     

志贺菌属编码赖氨酸的基因簇缺失情况分析

目的 探讨编码赖氨酸利用的cadABC基因簇的缺失在志贺菌中的普遍性。方法根据大肠杆菌K-12MG1655菌株的cadABC基因簇序列设计引物，使用PCR和核酸杂交试验检测。结果在志贺菌的4个群42个血清型43株菌中，均发生了cadABC基因簇的缺失。其中29(67．4％)株菌发生了cadABC基因簇的全部缺失，主要表现在A群和C群。A群的12个血清型中有10个发生了完全缺失，C群的18个血清型中有16个发生了完全缺失。其余13个血清型中的14株菌发生了部分缺失或重组。不完全缺失主要发生在B群，B群的11个血清型中的8个表现为部分缺失。D群的2个菌株和肠侵袭性大肠杆菌的2个菌株全部表现出部分缺失，但缺失的程度不同。结论在志贺菌属的4个群42个血清型中，全部发生了cadABC基因簇的缺失，表现为完全缺失和部分缺失。结果提示，志贺菌的进化可能和cadABC基因簇的缺失有关。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7特异性脂多糖抗原的制备

肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coil，EHEC）O157：H7是产Veto毒素的食源性肠道致病菌，可引起人类患血性腹泻、肾衰竭、尿毒综合征等症。本文应用热酚水法提取纯化了EHEC0157：H7脂多糖抗原及其O-特异性多糖（O-specific polysaocharide，O-SP）侧链。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7特异性脂多糖抗原的制备

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrha-gicEscherichia coli,EHEC)O157∶H7是产Vero毒素的食源性肠道致病菌,可引起人类患血性腹泻、肾衰竭、尿毒综合征等症。本文应用热酚水法提取纯化了EHEC O157∶H7脂多糖抗原及其O-特异性多糖(O-specific polysaccharide,O-SP)侧链。菌株为EHEC O157∶H7 EDL933株,(由中国疾病预防控制中心CDC馈赠)。LPS的制备:菌悬液反复冻融3次后,与等量90%苯酚共同加热至68℃后混合,剧烈搅拌30 min后,冰浴至2℃离心(4℃,3000g×20 min)。酚相加等体积无热原水重复洗涤2次,收集水相溶液装于透析袋中,流水透…     

应用酶联免疫吸附试验检测肠出血性大肠杆菌O157:H7

目的制备和纯化O157：H7抗原，免疫家兔和豚鼠，获得高效价的抗O157：H7免疫血清并进行纯化及酶标记。建立对O157：H7感染患者快速诊断方法，做到早期发现及时治疗，有效控制疫情的蔓延。方法ELISA双抗体夹心法检测O157：H7抗原。步骤：包被特异性抗体，加处理后的粪便等标本，然后加入抗O157：H7酶结合物，最后加入底物显色。结果本课题所研制的抗O157：H7酶结合物只对O157：H7呈阳性反应，而与其他相关细菌无交叉反应。结论应用酶联免疫吸附试验(即双抗体夹心法)对肠出血性大肠杆菌O157：H7抗原的检测较常规法实验程序简捷、快速、敏感。临床和现场验证结果表明，其方法具有灵敏度高，特异性强操作简单等特点，为肠出血性大肠杆菌O157：H7的鉴定及快速诊断提供了一种新的检测手段。     

嗜酸乳杆菌对链霉素处理小鼠感染大肠杆菌O157：H7的预防和治疗作用的观察

目的 观察嗜酸乳杆菌对小鼠感染大肠杆菌0157：H7的可能治疗作用。方法 使用口服链霉素处理的BALB／c小鼠为模型，在大肠杆菌0157：H788-2364感染前或后，在不同时间经口给以嗜酸乳杆菌LAI，观察试验小鼠的临床症状、肠道和肾脏的病理改变、排菌时间以及粪便中志贺毒素对Vero细胞的毒性作用等。结果 发现口服嗜酸乳杆菌可以明显降低感染了大肠杆菌0157：H7小鼠的死亡率，降低通过粪便排泄病原菌的时间，以及降低粪便标本对Vero细胞的毒性作用。结论 口服嗜酸乳杆菌对感染大肠杆菌O157：H7的小鼠有预防和治疗作用。     

肠产志贺样毒素的大肠杆菌菌株中小肠结肠炎耶 …

目的 了解肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠杆菌（ＥＳＩＥＣ）菌株中吉肠耻尔森菌ＨＰＩ和岛基因ｉｒｐ－２的存在情况。方法 使用菌落原位杂交、ＤＮＡ打点杂交和ＰＣＲ扩增方法。结果 用菌落原位杂交的方法发现在检测从各地收集原３７１株ＥＳＩＥＣ菌株中，６７株和ｉｒｐ－２基因探针杂交，占１８．０６％。在这６７株菌种中，６４株菌可使用ＰＣＲ方法扩增出ｉｒｐ－２基因，占９５．５％。鉴于在一部分肠侵袭性大肠杜菌（Ｅ     

2008-2010年江门市腹泻病原菌现状调查

目的了解江门市细菌性腹泻病原菌的种类和构成特点,为预防和临床治疗提供科学的参考依据。方法 2008年12月至2010年6月,采集监测点腹泻患者的粪便（或肛拭）,分离霍乱弧菌、志贺菌、沙门菌、出血大肠O157：H7、空肠弯曲菌、结肠耶尔森菌、副溶血性弧菌、变形杆菌等10种病原菌,采用传统分离培养法及BD PHOENZX SYSTEM全自动鉴定系统鉴定。结果 1260份标本共分离各类病原菌189株,检出率为15.00%,其中检出金黄色葡萄球菌61株,沙门菌52株,蜡样芽胞杆菌22株,变形杆菌24株,副溶血性弧菌24株,空肠弯曲菌2株,结肠耶尔森菌1株,志贺菌3株,霍乱、出血大肠O157：H7未检出。结论金黄色葡萄球菌、沙门菌是江门市细菌性腹泻的主要病原菌。     

大肠杆菌O120 O-抗原基因簇的破译及特异分子标识的鉴定

目的完成产志贺毒素大肠杆菌O120 OO-抗原基因簇的破译，筛选和鉴定检测用特异分子标识。方法利用鸟枪法进行O-抗原基因簇序列的测定，进行生物信息学方法分析发现基因并预测基因功能，利用PCR方法筛选针对大肠杆菌O120 O特异基因和特异引物，利用基因芯片方法筛选特异探针。结果O-抗原基因簇序列全长12485bp，共含有10个基因：dTDP-鼠李糖合成途径基因（rmlB、rmlD、rmlA和rmlC），O-抗原转运酶基因（uzx），O-抗原聚合酶基因（wzy），3个糖基转移酶基因和1个功能未确定的基因。另外筛选和鉴定了2个特异基因、4对特异引物和6条特异探针，在模拟样品的鉴定中得到验证。结论多种特异分子标识可从样品中特异地检测出大肠杆菌O120 O，具有快速、灵敏和准确进行分子分型的优点。