大鼠骨髓间质干细胞体内诱导肝星状细胞的凋亡

背景:骨髓间质干细胞治疗肝纤维化的疗效己得到很多实验的证实,但其机制仍不明确.目的:实验观察骨髓间质干细胞移植后肝星状细胞的凋亡情况,初步探讨骨髓间质干细胞治疗肝纤维化的机制.方法:连续8周皮下注射CCl_4诱导大鼠肝纤维化.造模成功后,20只大鼠随机分为实验组及对照组,每组10只.实验组经尾静脉注射骨髓间充质干细胞,对照组经尾静脉注射DMEM培养液.于移植前,移植后第3,7天分别处死大鼠,取其肝脏行羟脯氨酸的检测,苏木精-伊红染色及masson染色,免疫组织化学检测α-SMA及α-SMA+TUNEL双染反映肝星状细胞活化及其凋亡情况.结果与结论:造模8周后,大鼠肝脏羟脯氨酸含最明显升高,病理呈进展性肝纤维化表现.移植7 d后,实验组大鼠肝脏羟脯氨酸含量明显降低,肝纤维化有所缓解,而对照组的肝纤维化程度继续加重.免疫组织化学显示,CCl_4注射8周后,α-SMA阳性细胞大量增生,移植后第7天,实验组α-SMA阳件细胞明显少于对照组(P＜0.05).移植后第3天,实验组肝星状细胞凋亡明显较对照组增加(P＜0.05).结果提示,骨髓间质干细胞移植有治疗肝纤维化的作用.骨髓间质干细胞诱导肝星状细胞凋亡可能是其治疗肝纤维化的主要机制之一.     

骨髓间充质干细胞与肝星状细胞共培养后凋亡相关基因的改变

背景：前期研究证实骨髓间充质干细胞可在体外促进肝星状细胞凋亡、抑制其活性,但其作用机制尚未明确。目的：通过基因芯片技术,筛选出骨髓间充质干细胞调控肝星状细胞凋亡过程中可能参与的凋亡相关基因。方法：将分离提纯的人骨髓间质干细胞与肝星状细胞在6孔 Transwel 板上建立上下共培养体系,单独培养人骨髓间质干细胞作为对照组,培养72 h。基因芯片分析单独培养组与共培养组骨髓间充质干细胞凋亡相关基因的改变情况,找出与调控肝星状细胞密切相关的凋亡基因。结果与结论：采用SABiosciences第2代功能分类基因芯片产品进行凋亡基因筛查发现,共培养后骨髓间质干细胞中显著上调的凋亡基因有：AKT1,PIK3R2,DAPK1,DHCR24,NOTCH2,BDNF等。结合前期研究结果,推测NOTCH有可能在骨髓间充质干细胞调控肝星状细胞过程中起关键作用。     

骨髓间质干细胞抑制大鼠肝纤维化形成的可能性受体肝内干细胞存活时间、肝星状细胞活化程度及生存分析的7周观察

目的观察在体外培养条件下,具有强大的增殖和分化为肝细胞能力的骨髓间质干细胞输注治疗肝纤维化模型大鼠对其肝纤维化形成的影响及肝功能和生存分析,并对治疗组、空白对照组和病理对照组7周内的相关情况予以对照比较.方法实验于2003-08/2004-10在中山大学基础医学院病理学于病理生理实验室完成.①动物分组选用雄性6周龄Wistar大鼠5只为供体,供分离骨髓间质干细胞;雌性6周龄Wistar大鼠60只,其中50只被造成肝纤维化模型,在首次用二甲基亚硝胺处理后的第10天,将造模大鼠随机分为2组骨髓间质干细胞治疗组10只(为受体),于治疗39 d后结束实验,取材分析病理对照组40只.另10只作为空白对照组(仅静脉注射生理盐水).②肝纤维化模型制作在实验的当天,给予10g/L二甲基亚硝胺溶液(生理盐水配置)1 mL/kg,腹腔注射,每周连续3次,共6周.③骨髓间质干细胞治疗组每只大鼠输注3×106个骨髓间质干细胞;病理对照组使用等体积生理盐水代替骨髓间质干细胞.④动物的一般生活状态每天观察饮食、活动、二便、体质量、皮毛、呼吸情况等.⑤肝脏的组织细胞形态结构将肝组织以苏木精-伊红染色后观察.⑥肝星形细胞及其活化程度检测前者检测肝脏α-平滑肌肌动蛋白含量,用免疫组织化学染色法,后者以德国IBAS2.5图像分析软件半定量分析.⑦肝脏胶原分布的相对含量检测采用Masson三色染色法,从而反映肝纤维化程度.⑧肝脏羟脯氨酸含量测定采用氯胺T法.⑨血清总胆红素和谷丙转氨酶水平检测采用全自动生化分析仪.⑩血清层粘蛋白和透明质酸水平测定采用放射免疫法.11雄性大鼠骨髓间质干细胞在雌性大鼠肝内的Y染色体性别决定区基因的表达检测采用聚合酶链式反应.12统计学分析两组样本均数比较采用t检验;多组样本均数比较采用方差分析,两两比较采用q检验;生存分析采用K,plan-Meier法.结果雌性大鼠60只进入结果分析.①实验动物生存状况造模6周后,骨髓间质干细胞治疗组生存率为80%,而病理对照组生存率为10%,空白对照组生存率为100%,说明骨髓间质干细胞治疗可能通过阻止肝纤维化发展,从改而善大鼠的生存率.②肝脏组织学显示,骨髓间质干细胞治疗组的肝脏结构明显改善,炎症减轻、假小叶结构减少或消散.相反,病理对照组出现广泛的肝脏结构重塑,包括增厚的纤维间隔形成和明显的桥接坏死.半定量分析胶原染色,骨髓间质干细胞治疗组较病理对照组显著减低(8.12±1.98,15.71±2.13,t=6.11,P＜0.05).③肝脏星状细胞活化的标志α-平滑肌激动蛋白的阳性表达空白对照组仅见血管壁有少量α-平滑肌激动蛋白的阳性表达,而病理对照组和骨髓间质干细胞治疗组可见在纤维间隔、肝窦和汇管区内明显表达.半定量分析α-平滑肌激动蛋白的阳性染色,骨髓间质干细胞治疗组较病理对照组显著减低(11.06±2.03,18.50±3.87,t=4.47,P＜0.05).④Y染色体性别决定区基因的表达经雄性Wistar大鼠(供体)骨髓间质干细胞治疗39 d的雌性大鼠,肝脏DNA经聚合酶链式反应检测结果显示,Y染色体性别决定区基因的表达阳性,而空白对照组和病理对照组则无此阳性信号.说明骨髓间质干细胞移植后,能够在受体肝内存活5周以上.⑤反映肝脏纤维化程度的肝脏羟脯氨酸含量及血清层黏蛋白和透明质酸水平骨髓间质干细胞治疗组明显高于空白对照组(P＜0 05)但明显低于病理对照组(P＜0.05),说明骨髓间质干细胞治疗后能够减少肝脏胶原蛋白的含量,从而减少肝纤维化的形成,使肝纤维化得到控制.⑥反映肝功能的血清总胆红素、谷丙转氨酶水平骨髓间质干细胞治疗组明显低于病理对照组(P＜0.05),接近空白对照组.说明了骨髓间质干细胞治疗有助于改善肝功能状态.结论①二甲基亚硝胺能成功诱导大鼠肝纤维化模型的建立.②骨髓间质干细胞可改善肝纤维化大鼠的生存状况和肝功能.③骨髓间质干细胞能够减少肝脏胶原蛋白的产生,抑制肝纤维化形成.④肝纤维化发生发展过程中活化态的肝星状细胞数量减少可能是骨髓间质干细胞抑制肝纤维化形成的原因之一.⑤雌性大鼠肝脏内存在雄性供体Y染色体性别决定区基因的信号说明骨髓间质干细胞能够在受体肝内存活5周以上.     

骨髓间充质干细胞对四氯化碳诱发大鼠肝纤维化的治疗作用的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)对四氯化碳诱发大鼠肝纤维化的治疗作用及其对大鼠肝星状细胞凋亡的影响。方法将清洁级Sprague-Dawley大鼠分4组,A组(正常对照组)、B组(模型组)、C组(骨髓间充质干细胞移植组)、D组(水飞蓟素对照组)。另取sprague-Dawley大鼠制备骨髓间充质干细胞。除A组外,均皮下注射四氯化碳8周,完成后C组给予移植诱导后的骨髓间充质干细胞,D组给予水飞蓟素干预后化学发光法检测4组大鼠血清肝纤维化和肝功能指标,大鼠肝脏作组织病理学检查,分离各组大鼠肝星状细胞,流式细胞仪检测活化的肝星状细胞凋亡的变化。结果各组大鼠纤维化及肝功能结果:A、C、D组数据与B组对应数据比较,A组P<0.01,其余2组P<0.05。结论骨髓间充质干细胞能够显著改善四氯化碳所诱发的大鼠肝纤维化并能使肝星状细胞凋亡增加。     

骨髓间质干细胞抑制大鼠肝纤维化形成的可能性：受体肝内干细胞存活时间、肝星状细胞活化程度及生存分析的7周观察

目的：观察在体外培养条件下，具有强大的增殖和分化为肝细胞能力的骨髓间质干细胞输注治疗肝纤维化模型大鼠对其肝纤维化形成的影响及肝功能和生存分析，并对治疗组、空白对照组和病理对照组7周内的相关情况予以对照比较。方法：实验于2003-08／2004-10在中山大学基础医学院病理学于病理生理实验室完成。①动物分组：选用雄性6周龄Wistar大鼠5只为供体，供分离骨髓间质干细胞；雌性6周龄Wistar大鼠60只，其中50只被造成肝纤维化模型，在首次用二甲基亚硝胺处理后的第10天，将造模大鼠随机分为2组：骨髓间质干细胞治疗组10只(为受体)，于治疗39d后结束实验，取材分析病理对照组40只。另10只作为空白对照组(仅静脉注射生理盐水)。②肝纤维化模型制作：在实验的当天，给予10g／L二甲基亚硝胺溶液(生理盐水配置)1mL／kg，腹腔注射，每周连续3次，共6周。③骨髓间质干细胞治疗组：每只大鼠输注3&;#215;106个骨髓间质干细胞；病理对照组：使用等体积生理盐水代替骨髓间质干细胞。④动物的一般生活状态：每天观察饮食、活动、二便、体质量、皮毛、呼吸情况等。⑤肝脏的组织细胞形态结构：将肝组织以苏木精-伊红染色后观察。⑥肝星形细胞及其活化程度检测：前者检测肝脏α-平滑肌肌动蛋白含量，用免疫组织化学染色法，后者以德国IBAS2．5图像分析软件半定量分析。⑦肝脏胶原分布的相对含量检测：采用Masson三色染色法，从而反映肝纤维化程度。⑧肝脏羟脯氨酸含量测定：采用氯胺T法。⑨血清总胆红素和谷丙转氨酶水平检测：采用全自动生化分析仪。⑩血清层粘蛋白和透明质酸水平测定：采用放射免疫法。（11）雄性大鼠骨髓间质干细胞在雌性大鼠肝内的Y染色体性别决定区基因的表达检测：采用聚合酶链式反应。（12）统计学分析：两组样本均数比较采用t检验；多组样本均数比较采用方差分析，两两比较采用q检验；生存分析采用Kaplan-Meier法。结果：雌性大鼠60只进入结果分析。①实验动物生存状况：造模6周后，骨髓间质于细胞治疗组生存率为80％，而病理对照组生存率为10％，空白对照组生存率为100％，说明骨髓间质干细胞治疗可能通过阻止肝纤维化发展，从改而善大鼠的生存率。②肝脏组织学显示，骨髓间质干细胞治疗组的肝脏结构明显改善，炎症减轻、假小叶结构减少或消散。相反，病理对照组出现广泛的肝脏结构重塑，包括增厚的纤维间隔形成和明显的桥接坏死。半定量分析胶原染色，骨髓间质干细胞治疗组较病理对照组显著减低(8．12&;#177;1．98．15．71&;#177;2．13，t=6．11，P&;lt;0．05)。③肝脏星状细胞活化的标志α-平滑肌激动蛋白的阳性表达：空白对照组仅见血管壁有少量α-平滑肌激动蛋白的阳性表达，而病理对照组和骨髓间质干细胞治疗组可见在纤维间隔、肝窦和汇管区内明显表达。半定量分析α-平滑肌激动蛋白的阳性染色，骨髓间质干细胞治疗组较病理对照组显著减低(11．06&;#177;2．03，18．50&;#177;3．87，t=4．47，P&;lt;0．05)。④Y染色体性别决定区基因的表达：经雄性Wistar大鼠(供体)骨髓间质干细胞治疗39d的雌性大鼠，肝脏DNA经聚合酶链式反应检测结果显示，Y染色体性别决定区基因的表达阳性，而空白对照组和病理对照组则无此阳性信号。说明骨髓间质干细胞移植后，能够在受体肝内存活5周以上。⑤反映肝脏纤维化程度的肝脏羟脯氨酸含量及血清层黏蛋白和透明质酸水平：骨髓间质干细胞治疗组明显高于空白对照组(P&;lt;0．05)但明显低于病理对照组(P&;lt;0．05)，说明骨髓间质干细胞治疗后能够减少肝脏胶原蛋白的含量，从而减少肝纤维化的形成，使肝纤维化得到控制。⑥反映肝功能的血清总胆红素、谷丙转氨酶水平：骨髓间质干细胞治疗组明显低于病理对照组(P&;lt;0．05)，接近空白对照组。说明了骨髓间质干细胞治疗有助于改善肝功能状态。结论：①二甲基亚硝胺能成功诱导大鼠肝纤维化模型的建立。②骨髓间质干细胞可改善肝纤维化大鼠的生存状况和肝功能。③骨髓间质干细胞能够减少肝脏胶原蛋白的产生，抑制肝纤维化形成。④肝纤维化发生发展过程中活化态的肝星状细胞数量减少可能是骨髓间质干细胞抑制肝纤维化形成的原因之一。⑤雌性大鼠肝脏内存在雄性供体Y染色体性别决定区基因的信号说明骨髓间质干细胞能够在受体肝内存活5周以上。     

人脐带间质干细胞培养上清液可下调肝星状细胞转化生长因子β的表达

背景：人脐带间质干细胞有望成为治疗肝纤维化新的种子细胞,但目前相关的体外实验报道较少。目的：探讨人脐带间质干细胞培养液上清对大鼠肝星状细胞纤维化形成生物学活性的影响及可能的作用靶点。方法：将肝星状细胞以1.0×108L-1接种于六孔板内,无血清培养24h后,加入2mL脐带间质干细胞培养液上清处理肝星状细胞,设为实验组;对照组为加入等量完全培养基处理肝星状细胞;RT-PCR法检测肝星状细胞内转化生长因子β1、collagen-α1、TIMP-2 mRNA表达;Western blot法检测肝星状细胞内转化生长因子β1蛋白表达。结果与结论：实验组中肝星状细胞内转化生长因子β1、collagen-α1、TIMP-2 mRNA表达较对照组明显下调,且随处理时间的延长,mRNA表达的下调程度亦随之增强（实验组72h〉实验组48h〉对照组）;实验组肝星状细胞内转化生长因子β1蛋白表达较对照组下调,同时具有时间依赖性（对照组〉实验组48h〉实验组72h,P〈0.05）。提示脐带间质干细胞可抑制肝星状细胞纤维化形成的生物学活性,并可能是通过针对转化生长因子β靶点及其下游基因产物起作用。     

骨髓充质干细胞调控尿激酶型纤溶酶原激活物表达及其对大鼠肝星状细胞凋亡的影响

背景:骨髓间充质干细胞主要通过旁分泌及激活肝细胞生长因子促进肝星状细胞凋亡。目的:观察骨髓间充质干细胞对尿激酶型纤溶酶原激活物合成的调控及肝细胞生长因子活性的影响,探讨其诱导肝星状细胞凋亡的机制。方法:实验分为5组:①共培养组:大鼠骨髓间充质干细胞与肝星状细胞建立上下双层细胞共培养体系。②肝星状细胞单独培养组。③纤维原细胞对照组。④UK122干预组:在骨髓间充质干细胞与肝星状细胞共培养6h前加入尿激酶型纤溶酶原激活物特异性抑制剂UK122。⑤骨髓间充质干细胞空白对照组。结果与结论:共培养组尿激酶型纤溶酶原激活物mRNA表达较肝星状细胞单独培养明显增加(P<0.01)。与肝星状细胞单独培养相比,共培养组的肝星状细胞在与骨髓间充质干细胞共培养24h后表现明显增殖抑制(P<0.01),且呈现时间依赖性;骨髓间充质干细胞与肝星状细胞共培养后,活性肝细胞生长因子的蛋白表达及肝星状细胞凋亡增加(P<0.01)。UK122干预后活性肝细胞生长因子表达及肝星状细胞凋亡减少(P<0.01)。提示骨髓间充质干细胞通过促进分泌尿激酶型纤溶酶原激活物,增加活性肝细胞生长因子表达,促进肝星状细胞凋亡。     

干扰素α-2a与肝纤维化大鼠肝星状细胞的凋亡

背景：干扰素α-2a改善肝纤维化的机制直到目前仍尚未阐明。目的：进一步验证干扰素α-2a对C14诱导大鼠肝纤维化模型中肝星状细胞凋亡的影响。方法：建立CC14诱导肝纤维化模型,健康SD雌性大鼠50只,采用随机对照原则将SD大鼠分成5组,即生理盐水对照组、纤维化模型组、6×10^4U／kg干扰素α-2a干预组、12×10^4U／kg干扰素α-2a干预组及6×10^4U／kg干扰素α-2a对照组。造模8周时取肝组织标本,分别进行肝纤维化指标检测;RT-PCR分析肝组织bcl-2、bax的表达;免疫组织化学染色用a平滑肌肌动蛋白对活化的肝星状细胞进行标记。结果与结论：肝组织病理形态显示CC14诱导肝纤维化成功建立,表现为纤维化模型组汇管区周围纤维化明显,有芒状纤维和纤维间隔形成,各干扰素α-2a干预组肝纤维化有不同程度缓解。纤维化模型组有大量a平滑肌肌动蛋白阳性表达,6×10^4U／kg干扰素α-2a干预组a平滑肌肌动蛋白阳性表达较纤维化模型组减少,12×10^4U／kg干扰素α-2a干预组更少,6×10^4U／kg干扰素α-2a对照组未见a平滑肌肌动蛋白阳性表达。结果提示干扰素α-2a能下调CC14诱导肝纤维化bcl-2的表达,及上调bax的表达。提示干扰素α-2a阻断CC14诱导肝纤维化机制存在通过调节bcl-2、bax的表达,诱导肝星状细胞凋亡途径,该调节作用可能与干扰素α-2a剂量相关。     

骨髓间充质干细胞体外调控肝星状细胞死亡受体5的表达

背景:肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体可以通过上调死亡受体5蛋白的表达诱导大鼠肝星状细胞凋亡。目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞对肝星状细胞死亡受体5和Caspase-3蛋白表达的影响,探讨骨髓间充质干细胞诱导肝星状细胞凋亡及其机制。方法:贴壁筛选法培养、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代使用;大鼠原代肝星状细胞和肝纤维原细胞系冻融后传代使用。应用6孔培养板,建立上下双层细胞共培养体系,常规培养。将细胞分为4组:①空白对照组:肝星状细胞和骨髓间充质干细胞分别单独培养。②阴性对照组:肝纤维原细胞与肝星状细胞共培养(模拟星状细胞体内生长环境)。③骨髓间充质干细胞与肝星状细胞共培养组。④实验组:1.5mg/LTRAIL多克隆抗体与骨髓间充质干细胞作用6h后,不换液,再与肝星状细胞共培养。结果与结论:在共培养组中肝星状细胞的增殖降低,凋亡增加,且肝星状细胞死亡受体5、Caspase-3蛋白的表达均显著升高,并呈时间依赖性,且与其他组比较差异有显著性意义(P<0.01)。实验组Caspase-3和死亡受体5蛋白的表达在共培养的各个时间段均低于共培养组,与共培养组比较差异有显著性意义(P<0.01)。提示骨髓间充质干细胞与肝星状细胞共培养能抑制肝星状细胞的增殖,促进肝星状细胞的凋亡,其机制可能为骨髓间充质干细胞旁分泌肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体通过上调Caspase-3和死亡受体5蛋白的表达实现的。     

骨髓间质干细胞培养液上清对肝星状细胞增殖及纤维化的影响

背景:利用骨髓间质干细胞治疗肝纤维化的研究取得了一定的效果,但研究其培养液上清治疗肝纤维化的并不多。目的:观察大鼠骨髓间质干细胞培养液上清抑制肝星状细胞增殖及活化的可能性。方法:实验组1,2将骨髓间质干细胞培养液上清加入6孔板内处理肝星状细胞,分别为2mL培养液上清/孔,1mL培养液上清+1mL完全培养基/孔;对照组为肝星状细胞单独培养(2mL完全培养基/孔)。流式细胞仪分析细胞周期并观察抑制效果,RT-PCR检测肝星状细胞内转化生长因子β、金属蛋白酶抑制因子2、胶原蛋白ⅠmRNA的表达情况。结果与结论:加入骨髓间质干细胞培养液上清后,实验组1中的肝星状细胞增殖与对照组相比受到抑制,且抑制率随处理时间的延长而增多(处理72h>处理48h>处理24h,P<0.05);实验组的肝星状细胞内转化生长因子β、金属蛋白酶抑制因子2、胶原蛋白ⅠmRNA的表达较对照组均下调,且下调程度随培养液上清增多而增大(实验组1>实验组2>对照组)。     

骨髓间充质干细胞在膀胱脱细胞基质上的生长及分化

背景:传统方法多采用平滑肌细胞和移行上皮细胞构建组织工程膀胱,并进行支架材料的双面种植,但由于平滑肌细胞取材培养困难,且体外传代有限,双面种植较为困难.目的:实验拟验证以骨髓间充质干细胞及膀胱脱细胞基质构建组织工程膀胱的可行性.设计:基础实验研究.单位:中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心.材料:实验于2006-03/2007-05在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心完成.实验室级别为卫生部部属医院开放实验室.1月龄SD大鼠,雌雄不限,体质量80～100g,由中山大学实验动物中心提供.新鲜猪膀胱取自南方医科大学动物实验中心.方法:采用全骨髓培养连续贴壁法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,并应用流式细胞仪检测其表面抗原.采用去污剂洗涤法制备猪膀胱脱细胞基质,并测定其纯度及特性.将第3代骨髓间充质干细胞接种到膀胱脱细胞基质上,以添加25 ng/L血管内皮生长因子(VEGF165)的培养液进行体外、体内复合培养,检测其相容性.体内实验以细胞单独培养为对照,体外实验以未植入细胞的材料为对照,并模拟合适的微环境诱导骨髓间充质干细胞生长分化,分别在4,8周后取出动物体内的复合材料行组织切片检查,并进行免疫组织化学角蛋白染色,检测上皮细胞再生情况.主要观察指标:骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质的生物相容性.结果:①采用全骨髓法成功培养出骨髓间充质干细胞,行流式细胞仪检测细胞表面抗原显示,传代第3代细胞CD29阳性细胞为99.43%.②制备的膀胱脱细胞基质具有良好的生物特性,镜下见均质状态的基质和细丝状的胶原纤维.体内外相容性实验表明骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质具有良好的相容性,细胞生长状态良好.③4周后组织切片检查可见组织中较多炎症细胞浸润,胶原及弹性纤维排列紧密,免疫组织化学角蛋白染色见有薄层、不连续的单层上皮生长,8周后可见组织中已无明显炎症细胞浸润反应,胶原及弹性纤维排列紧密,免疫组织化学角蛋白染色见有薄层、连续的多层上皮生长.结论:骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质具有良好的生物相容性,并且在体内与周围组织有良好的生物相容性,可以作为构建组织工程膀胱的材料.     

体外共培养大鼠骨髓间充质干细胞对肝星状细胞增殖的影响:CyclinD1与P27表达调控

背景:在肝纤维化发生发展过程中,肝星状细胞起着关键作用.研究证实骨髓间充质干细胞移植可作为治疗肝纤维化的方法,但其逆转肝纤维化的机制不明.目的:探讨体外共培养条件下,大鼠骨髓间充质干细胞对肝星状细胞增殖的调控机制.方法:实验组在半透膜上接种大鼠骨髓间充质干细胞,在6孔塑料培养板上接种肝星状细胞,建立上下双层细胞共培养体系;对照组将大鼠骨髓间充质干细胞更换为成纤维细胞;空白组仅行肝星状细胞单独培养.WST-8法检测肝星状细胞生长抑制率,流式细胞仪分析细胞周期,RT-PCR检测肝星状细胞CyclinD1和P27 mRNA的表达,Western blot检测肝星状细胞CyclinD1和P27蛋白的表达.结果与结论:与空白组、对照组比较,实验组共培养24,48,72 h肝星状细胞牛长抑制率均显著升高(P＜0.01):共培养72 h G_0/G_1期细胞显著增加(P＜0.01),S期细胞显著减少(P＜0.01),可阻滞肝星状细胞由G_0/G_1期向S期转换.共培养24 h,实验组CyclinD1 mRNA及蛋白表达开始下调,至72 h时表达量显著低于对照组、空白组(P＜0.01);共培养全过程中各组p27mRNA的表达无明显差异(P＞0.05),共培养24 h时实验组p27蛋白表达较对照组、空白组均显著上调(P＜0.01).结果证实大鼠骨髓间充质干细胞能够抑制肝星状细胞的增殖,其机制可能是通过下调CyclinD1表达,上调P27蛋白表达,使细胞周期停滞于G_0/G_1期实现的.     

人骨髓间充质干细胞培养上清与肝星状细胞相关酶的分泌

背景：研究证实骨髓间充质干细胞移植治疗能改善甚至逆转肝纤维化,但其具体机制尚不清楚。目的：检测人骨髓问充质干细胞培养上清对肝星状细胞中基质金属蛋白酶2及组织抑制基质金属蛋白酶1表达的影响。方法;采用密度梯度离心法分离人骨髓间充质干细胞,收集原代培养7d的骨髓问充质千细胞培养上清,加入肝星状细胞中培养作为实验组,并设置单独肝星状细胞组、单独骨髓间充质干细胞组为对照。培养24,48h后,检测各组细胞上清中基质金属蛋白酶2蛋白与组织抑制基质金属蛋白酶1蛋白的表达。结果与结论：与单独肝星状细胞组、单独骨髓问充质于细胞组比较,实验组培养24,48h后肝星状细胞基质金属蛋白酶2及组织抑制基质金属蛋白酶1表达减少（P〈0．05或P〈0．01）。表明骨髓间充质干细胞培养上清抑制肝星状细胞中基质金属蛋白酶2、组织抑制基质会属蛋白酶1的表达。     

人骨髓干细胞异体内诱导分化为肝细胞的实验

背景:如何获取来源丰富的高质量人源性肝细胞是生物人工肝和肝细胞移植共同面临的问题。骨髓干细胞在适当条件下可分化为肝细胞,为获取肝细胞提供了新的思路。目的:探讨人骨髓干细胞在大鼠体内诱导分化为肝细胞的方法,为解决临床肝脏移植和生物人工肝来源提供新的思路。设计:随机对照实验。单位:南方医科大学珠江医院普通外科。材料:实验于2004-05/2005-02在南方医科大学珠江医院中心实验室完成。选取雄性清洁级SD大鼠40只,随机分为5组:单纯模型组、造模 人骨髓干细胞移植14d组、造模 人骨髓干细胞移植28d组、造模 CL-1细胞(人肝细胞系)移植14d组、造模 CL-1细胞(人肝细胞系)移植28d组,8只/组。方法:①5组均建立2-乙酰氨基芴 四氯化碳 环磷酰胺肝损伤模型。②利用治疗性肝再生策略,将人骨髓干细胞移植到大鼠肝脏内诱导分化为肝细胞。造模 人骨髓干细胞移植14d组移植人骨髓干细胞后观察14d,造模 人骨髓干细胞移植28d组移植人骨髓干细胞后观察28d,造模 CL-1细胞移植14d组移植CL-1细胞后观察14d,造模 CL-1细胞移植28d组移植CL-1细胞后观察28d,单纯模型组未进行细胞移植。③各组在正常状态下以及移植前后进行血清标本的采集与肝功能检测。应用免疫组化、聚合酶链反应法、实时荧光定量反转录聚合酶链反应技术检测各组大鼠肝脏内人白蛋白的mRNA的表达。主要观察指标:①人骨髓干细胞移植对大鼠肝功能转氨酶及总胆红素含量的影响。②各组大鼠病理切片肝细胞形态检查结果。③各组大鼠肝脏中人主要组织相容性抗原-Ⅰ类阳性率。④各组大鼠肝脏中大鼠Sox11序列、人Alu-sx序列、人白蛋白mRNA基因的表达。结果:实验选用40只大鼠,全部进入结果分析。①人骨髓干细胞移植对大鼠肝功能转氨酶及总胆红素含量的影响:各细胞移植组在正常状态以及细胞移植前与单纯模型组基本相似(P>0.05);与正常状态比较,细胞移植前各组均显著增高(P<0.01);与细胞移植前比较,各细胞移植组在细胞移植后均显著降低(P<0.01),但仍高于正常状态下的转氨酶、总胆红素含量(P<0.01)。②各组大鼠病理切片肝细胞形态检查结果:正常情况下肝脏病理切片显示肝细胞排列成条索状,围绕中央静脉成放射状排列,汇管区无炎性细胞浸润;单纯模型组呈大片状坏死表现;人骨髓干细胞移植组可见一些坏死后增生性改变;CL-1细胞移植组可见卵圆细胞以及小胆管增生。③各组大鼠肝脏中人主要组织相容性抗原-Ⅰ类阳性率:单纯模型组为0,造模 人骨髓干细胞移植14d组为(13.03±0.18)%,造模 人骨髓干细胞移植28d组为(9.47±0.46)%,造模 CL-1细胞移植14d组为(10.27±0.50)%,造模 CL-1细胞移植28d组为(9.84±0.23)%。④各组大鼠肝脏中基因序列聚合酶链反应检测结果:单纯模型组大鼠肝脏中只检测到大鼠Sox11序列;而人骨髓干细胞移植、CL-1细胞移植各时间组均可检测到人Alu-sx序列和大鼠Sox11序列。⑤各组大鼠肝脏组织实时荧光定量反转录聚合酶链反应检测结果:单纯模型组大鼠肝脏组织中未检测到人白蛋白mRNA基因表达,人骨髓干细胞移植、CL-1细胞移植各时间组以及阳性对照均可检测到人白蛋白mRNA基因表达。结论:人骨髓干细胞移植能促进肝损伤大鼠的肝功能恢复,人源性细胞在肝损伤大鼠肝脏中的替代率约10%,提示人骨髓干细胞在异体内均可转化为肝细胞并可实现部分替代。     

上皮型钙粘蛋白基因稳定转染小鼠胚胎干细胞及对分化细胞黏附能力的影响

背景:在胚胎期,上皮型钙粘蛋白的表达对于肝组织的形成有决定作用.目的:将上皮型钙粘蛋白基因转染小鼠胚胎干细胞,观察其对分化细胞间黏附能力变化的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-12/2008-12在中山大学附属第一医院外科实验室完成.材料:清洁级BALB/c系孕13 d小鼠由中山大学实验动物中心提供.BAL8/c系小鼠胚胎干细胞由中山大学眼科中心黄冰教授建系和保存.含CMV启动子的真核表达质粒pEGFP-N1由中山大学医学院吕志跃博士惠赠.方法:取BALB/c小鼠新鲜肝脏组织,提取总RNA,反转录合成cDNA.以合成的cDNA为模板,进行PCR扩增目的片段,将其和pEGFP-N1双酶切后连接构建pEGFP-上皮型钙粘蛋白,转染小鼠胚胎干细胞并进行体外分化.主要观察指标:RT-PCR及免疫细胞化学检测上皮型钙粘蛋白在分化系统中的动态表达,同时观察分化细胞间黏附能力的变化.结果:基因转染的胚胎干细胞分化后1-17 d稳定表达上皮型钙粘蛋白,而普通胚胎干细胞分化后上皮型钙粘蛋白的表达则逐渐降低.稳定表达上皮型钙粘蛋白的分化细胞间黏附能力明显增强,并在19 d时仍能保持致密的细胞连接和多层生长状态,普通胚胎干细胞则由拟胚体结构逐渐分化为松散的细胞群落.结论:稳定表达上皮型钙粘蛋白的胚胎干细胞分化后,细胞间黏附能力明显增强,并保持多层细胞生长状态.     

胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植对宿主肝功能的影响及安全性评估

背景：体外诱导胚胎干细胞分化为肝细胞已有不少成功的报道，但其体内移植后能否有效整合入宿主肝板、在肝内能否进一步生长分化并表达肝细胞功能以及成瘤的风险等情况目前还不清楚。 目的：应用治疗性肝再生模型进行胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植．观察其在肝组织替代、体内的生长分化及成瘤性情况。 设计：随机对照动物实验。 单位：中山大学附属第二医院小儿外科。 材料：选用BALB／c小鼠24只为受体，鼠龄6～8周，体质量20～352，雌雄不拘购自广州市实验动物中心。实验所用胚胎干细胞源性肝干细胞由作者所在课题组诱导胚胎干细胞分化而成。小鼠胚胎干细胞株E14由本院干细胞中心提供。 方法：实验于2006-07／2007-06在中山大学附属第二医院干细胞研究中心完成。将24只小鼠随机分为2组：肝再生模型＋干细胞移植组和肝切除＋干细胞移植组，每组12只。前组分两次按50mg／kg剂量腹腔内注射倒千里光碱（retrorsine），间隔2周，第2次注射4周后行70％肝部分切除制造肝损伤；然后经门静脉分别移植1×10^5羟基荧光素乙酰乙酸（CFDA-SE）荧光标记的细胞入小鼠肝内进行胚胎干细胞源性肝干细胞移植。后组在行70％肝部分切除制造肝损伤模型后进行胚胎干细胞源性肝干细胞移植。 主要观察指标：荧光显微镜下观察移植细胞组受体鼠肝脏内分布、整合与体内生长分化情况。2周后行白蛋白荧光免疫组化（双荧光染色）、血清白蛋白水平检测其功能状况。将胚胎干细胞源性肝干细胞注入治疗性肝再生小鼠肝内，将未分化的胚胎干细胞移植入小鼠腋区皮下作为对照，观察胚胎干细胞源性肝干细胞体内成瘤情况。 结果：①肝干细胞在受体鼠肝内生长情况：CFDASE标记的胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植1周，受体小鼠肝实质内可见散     

胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植对宿主肝功能的影响及安全性评估

背景:体外诱导胚胎干细胞分化为肝细胞已有不少成功的报道,但其体内移植后能否有效整合入宿主肝板、在肝内能否进一步生长分化并表达肝细胞功能以及成瘤的风险等情况目前还不清楚.目的:应用治疗性肝再生模型进行胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植, 观察其在肝组织替代、体内的生长分化及成瘤性情况.设计:随机对照动物实验.单位:中山大学附属第二医院小儿外科.材料:选用BALB/c小鼠24只为受体,鼠龄6～8周,体质量20～ 35 g,雌雄不拘购自广州市实验动物中心.实验所用胚胎干细胞源性肝干细胞由作者所在课题组诱导胚胎干细胞分化而成.小鼠胚胎干细胞株E14由本院干细胞中心提供.方法:实验于2006-07/2007-06在中山大学附属第二医院干细胞研究中心完成.将24只小鼠随机分为2组:肝再生模型 干细胞移植组和肝切除 干细胞移植组,每组12只.前组分两次按50 mg/kg剂量腹腔内注射倒千里光碱(retrorsine) ,间隔2周,第2次注射4周后行70%肝部分切除制造肝损伤;然后经门静脉分别移植1×105羟基荧光素乙酰乙酸(CFDA-SE)荧光标记的细胞入小鼠肝内进行胚胎干细胞源性肝干细胞移植.后组在行70%肝部分切除制造肝损伤模型后进行胚胎干细胞源性肝干细胞移植.主要观察指标:荧光显微镜下观察移植细胞组受体鼠肝脏内分布、整合与体内生长分化情况.2周后行白蛋白荧光免疫组化(双荧光染色)、血清白蛋白水平检测其功能状况.将胚胎干细胞源性肝干细胞注入治疗性肝再生小鼠肝内,将未分化的胚胎干细胞移植入小鼠腋区皮下作为对照,观察胚胎干细胞源性肝干细胞体内成瘤情况.结果:①肝干细胞在受体鼠肝内生长情况:CFDA SE标记的胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植1周,受体小鼠肝实质内可见散在绿色荧光分布.2周后,肝实质内绿色荧光分布区域明显扩大,且可见类似肝索样结构排列.②肝功能:共焦白蛋白荧光免疫组化(双荧光染色)结果表明,受体小鼠肝组织内可见标记细胞表达白蛋白阳性信号(呈黄色荧光),肝再生模型 干细胞移植组和肝切除 干细胞移植组血清白蛋白水平则无明显差异(P > 0.05).③肝干细胞移植安全性:6周内未见畸胎瘤形成,而将未分化的胚胎干细胞移植入小鼠腋区皮下6周后则可见畸胎瘤形成.结论:胚胎干细胞源性肝干细胞移植入治疗性肝再生模型小鼠肝内后可有效在肝内能进一步生长分化并部分表达肝细胞功能;且此移植安全性较好.