Bridge Sequence对M1GS核酶体外切割活性的影响

目的探讨B ridge Sequence(桥序列)对M1GS核酶体外切割活性的影响,从而为人工M1GS核酶的优化设计提供一定的理论依据。方法以含大肠杆菌核酶P催化单位(M1 RNA)基因的pFL117质粒作为模板,通过巧妙设计不同的下游引物,经PCR扩增、扩增产物克隆及克隆基因的体外转录,构建一组具有不同桥序列的人工M1GS核酶。进一步将所构建的上述人工M1GS核酶分别与同位素标记的底物RNA片段进行体外切割试验,并通过同位素扫描成像系统对各M1GS核酶的切割产物加以分析。结果成功构建了针对HCMV UL54mRNA T7靶位的、四种不同桥序列长度的M1GS核酶,其桥序列长度分别为0n、t6nt、20nt和88nt,并依次命名为M1GS-T7(0)、M1GS-T7(6)、M1GS-T7(20)和M1GS-T7(88)。经体外切割试验证实,M1GS-T7(88)的靶向切割活性最强,M1GS-T7(20)的切割活性相对较弱,而M1GS-T7(0)及M1GS-T7(6)则无明显的切割活性。结论人工M1GS核酶中桥序列的长度对于其体外切割活性具有重要影响,提示在人工M1GS核酶的优化设计时,桥序列的长度是不可忽视的因素之一。     

MALAT-1沉默对膀胱癌细胞增殖. 凋亡及caspase-3表达的影响

目的 检测MALAT-1在正常膀胱组织和膀胱癌组织间的表达差异,探讨MALAT-1沉默对膀胱癌细胞增殖.凋亡及caspase-3表达的影响。方法 RT-PCR检测膀胱癌组织及正常膀胱组织中MALAT-1基因的表达;CCK-8比色实验检测MALAT-1沉默和MALAT-1正常表达的膀胱癌EJ细胞的增殖;TUNEL免疫荧光法检测MALAT-1沉默和MALAT-1正常表达膀胱癌EJ细胞的凋亡;Western blot法检测MALAT-1沉默和MALAT-1正常表达的膀胱癌EJ细胞中caspase-3蛋白的表达。结果 膀胱癌组织中MALAT-1的表达显著高于正常膀胱上皮组织;MALAT-1沉默细胞的增殖能力显著弱于MALAT-1正常表达的细胞;MALAT-1沉默细胞的凋亡显著高于MALAT-1正常表达的细胞;MALAT-1沉默细胞caspase-3蛋白的表达显著高于MALAT-1正常表达的细胞。结论 MALAT-1在膀胱癌组织中的表达被激活,MALAT-1能促进膀胱癌细胞的增殖,抑制膀胱癌细胞的凋亡,这种抑制作用可能是通过直接调控caspase-3的表达而实现的。     

抗HPV16E7—ribozyme的体外制备与活性鉴定

通过体外转录结合乙醇沉淀，建立了体外大量制备ＨＰＶ１６Ｅ７Ｒｚ的方法，切割实验表明，ｒｉｌｂｏｚｙｍｅ可在体外准确和有效地切割Ｅ７ａｆｃｎＲＮＡ，形成８５ｎｔ和８６ｎｔ大小的切割产物，体外制备的ｒｉｂｏｚｙｍｅ的切割活性、Ｋｍ的ｋｃａｔ值民人工合成的相似。结果说明，体外制备的ｉｉｂｚｙｍｅ具有特殊的催化切割活性。     

低氧预适应对大鼠脑缺血再灌注神经细胞凋亡和Caspase-3活性的影响

目的探讨低氧预适应(8%O2,3h)对大鼠大脑中动脉缺血2h再灌注后12h神经细胞凋亡及Caspase-3活性的影响。方法低氧预适应后12h制作脑缺血再灌注模型,大鼠大脑中动脉阻塞2h,灌注损伤12h,用TUNEL法和荧光四肽底物法分别检测假手术组、缺血再灌注组和低氧预适应组的凋亡细胞百分率和Caspase-3活性水平。结果与缺血再灌注组比较,低氧预适应组和假手术组的凋亡细胞百分率和Caspase-3活性水平显著降低(P<0.05,P<0.01);低氧预适应组与假手术组比较,细胞凋亡率明显升高(P<0.01),Caspase-3水平反而降低(P<0.01)。结论低氧预适应可减少大脑中动脉缺血2h再灌注后Caspase-3活性,抑制神经细胞的凋亡。     

抗HPV16E7－ribozyme的体外制备与活性鉴定

通过体外转录结合乙醇沉淀，建立了体外大量制备抗ＨＰＶ１６Ｅ７－Ｒｚ的方法。切割实验表明，ｒｉｂｏｚｙｍｅ可在体外准确和有效地切割Ｅ７靶ＲＮＡ，形成８５ｎｔ和８６ｎｔ大小的切割产物。体外制备的ｒｉｂｏｚｙｍｅ的切割活性、Ｋｍ和ｋｃａｔ值与人工合成的相似。结果说明，体外制备的ｒｉ－ｂｏｚｙｍｅ具有特异的催化切割活性。     

大鼠海马神经元缺氧/复氧后caspase-3活性的变化

细胞凋亡过程是受基因调控的级联反应过程 ,其中caspase -3在此过程中起关键作用 ,它可促进脑部发育过程中的神经元死亡 ,在缺血性脑损伤中也起重要作用。本研究应用培养的海马神经元 ,观察在缺氧或缺氧再复氧后不同时间caspase -3活性的动态变化及caspase -3抑制剂预处理对其影响 ,研究caspase -3在体外培养的海马神经元缺氧 /复氧损伤中的作用及其抑制剂的干预效果 ,为缺血性脑损伤的在体针对性治疗提供一定的实验研究资料。取当天出生 (P1)的SD大鼠 ,分离海马神经元进行体外培养。诱导体外培养 10d的大鼠海马神经元缺氧 3h ,再复氧 12～ 48h ,并在缺氧前 1h用不同剂量的caspase -3抑制剂Ac -DEVD -CMK进行干预处理 ,同时用溶剂DMSO处理进行对照 ,应用MTT比色法测定细胞存活率 ,底物裂解法检测caspase -3样蛋白酶活性。用方差分析 (ANOVA)进行统计学分析处理。结果发现 ,缺氧 /复氧后大鼠海马神经元存活率逐渐降低 ,caspase -3活性明显增强 ,复氧2 4h达高峰 ;溶剂DMSO处理后神经元存活率及caspase -3活性与缺氧 /复氧神经元相比无显著性差异 ;用Ac -DEVD -CMK预处理的海马神经元caspase -3活性降低 ,细胞存活率增高 ,并呈剂量依赖性 ,但抑制caspase -3样蛋白酶的活性并不能完全逆转神经元的死亡。本研     

石花菜提取物对宫颈癌细胞凋亡及Caspase-3活性的影响

目的 探讨石花菜提取物对宫颈癌HeLa细胞凋亡及Caspase-3活性的影响.方法 不同浓度石花菜乙酸乙酯提取物与HeLa细胞孵育后,MTT法检测细胞活性,Hoechst检测细胞凋亡,以及比色法检测细胞内Caspase-3活性.结果 石花菜提取物以时间及剂量依赖性的方式抑制HeLa细胞的生长增殖,降低细胞活性.Hoechst33258染色可见石花菜提取物作用后细胞核出现固缩、边集等凋亡现象.经石花菜提取物孵育,细胞内Caspase-3活性也比对照组显著升高(P<0.05).结论 石花菜乙酸乙酯提取物可抑制宫颈癌HeLa细胞生长增殖,其机制可能是增强Caspase-3活性启动细胞凋亡,从而发挥其抗瘤作用.     

CD3AK细胞对白血病细胞的体外杀伤作用

ＣＤ３单克隆抗体（ＣＤ３ＭｃＡｂ）对Ｔ细胞具有强烈的丝裂原作用。本文显示将ＣＤ３ＭｃＡｂ联合ＩＬ－２激活的杀伤细胞（ＣＤ３ＡＫ）对人急性白血病新鲜细胞和Ｋ５６２细胞均有明显匀伤作用。正常人ＣＤ３Ａ铎各型急性白血病杀伤活无差别;正常人与白血病缓解期的ＣＤ３ＡＫ细胞杀伤力类同,且自体与异体亦无区别,但是,复发期ＣＤ３ＡＫ细胞杀瘤作用明显减弱。     

Caspase-3体外对PIAS1蛋白酶切作用的初步验证

目的观察凋亡相关蛋白Caspase-3体外对PIAS1蛋白的酶切作用,为后续研究奠定基础。方法以HEK293T细胞表达PIAS1蛋白,采用免疫共沉淀(Co-IP)实验观察其与Caspase-3间的结合作用;采用体外蛋白酶切实验检测Caspase-3对PIAS1的酶切作用。结果 Co-IP实验发现体外Caspase-3可与PIAS1蛋白结合;蛋白酶切实验发现PIAS1的酶切片段。结论 Caspase-3与PIAS1在体外具有相互作用,PIAS1体外可被Caspase-3酶切,为后续研究奠定了基础。     

扁平苔藓皮损区caspase-3的表达与意义

目的:探讨凋亡基因caspase-3在扁平苔藓(Lichen planus,Lp)病变中的作用。方法:采用免疫组化法对30例扁平苔藓皮损和30例正常皮肤组织凋亡相关蛋白caspase-3的表达情况进行检测。结果:扁平苔藓组caspase-3蛋白表达率高于正常对照组的表达率,差异有统计学意义(P&lt;0.01)。结论:caspase-3作为凋亡的最终效应分子,可能在扁平苔藓病变中起到重要作用。     

抗HBV C区G11饱和突变的发夹状核酶的体外制备

研究针对HBV C区的G11位饱和突变的发夹状核酶的体外制备，通过计算机设计针对HBV C区的发夹状核酶，合成G11位饱和突变的发夹状核酶基因片段，并把其克隆入自剪切核酶载体p1.5的3‘-cis-Rz或5‘-cis-Rz之间。^32P标记4种发夹状核酶的体外转录物，变性聚丙烯酰胺纯化回收获得4种核酶。利用该载体外制备大量目的发夹状核酶是完全可行的。     

核酶抑制N2a细胞血栓素合酶mRNA的表达

根据“锤头状结构”核酶的设计原理,以小鼠全长血栓素合酶（TXS）mRNA为靶系更,计算机预测其二级结构,设计核酶,并人工合成核酶对应的DNA片段,克隆入真核表达载体pEGFP-C1,经脂体转染N2a细胞,用原位杂交的方法检测TXSmRNA的表达水平。结果表明：针对小鼠TXSmRNA的核酶R15、R544、对内毒素刺激的N2a细胞TXSmRNA的表达具有显著的抑制作用,核酶R15、R544可望用于基因治疗,抑制病理条件下TXSmRNA的表达。     

高压氧对大鼠短暂全脑缺血半胱天冬酶-3的影响

为探讨高压氧 (HBO)对脑缺血半胱天冬酶 3 (简称caspase 3 )活性的影响 ,将 2 0 0～ 2 5 0 gSD大鼠分为缺血再灌注组 (I/R组 )、高压氧 (HBO)处理组及假手术组 ,以Pulsinelli等报道的四动脉阻断法建立脑缺血再灌注动物模型 ,缺血 2 0min,分别于再灌注 6、2 4、4 8及 96h取顶叶皮质匀浆 ,用显色法测定caspase 3活性。结果显示 :再灌注 6h ,HBO组及I/R组同假手术组相比 ,caspase 3活性无显著差异 (P >0 .0 5 ) ,但HBO显著高于I/R组 (P <0 .0 5 ) ;2 4h时间点HBO组及I/R组均高于假手术组 (P <0 .0 5 ) ,但前 2组之间无显著差异 ;4 8及 96h时间点HBO及I/R组虽高于假手术组 ,但差异无显著性意义 (P >0 .0 5 ) ,且此 2组间亦无显著差异 ,说明此时caspase 3已基本降至正常。提示全脑短暂性缺血再灌注后caspase 3被激活 ,缺血早期用HBO处理可促进其活化 ,而HBO处理多次后对凋亡的作用已不明显     

桥本甲状腺炎甲状腺组织TRAIL、Caspase-3的表达

目的 研究桥本甲状腺炎(HT)患者甲状腺组织中肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的表达及其在HT发病和病理改变中的意义. 方法 采用S-P免疫组织化学方法检测26例HT(HT组)和12例正常甲状腺组织(对照组)中TRAIL、caspase-3的表达情况. 结果 (1)TRAIL、caspase-3在HT组呈高表达,多见于浸润淋巴细胞旁的甲状腺滤泡上皮细胞;而浸润的淋巴细胞TRAIL染色阴性,caspase-3染色呈弱阳性.(2)TRAIL的表达阳性率在HT组明显高于对照组(72.92%vs 41.67%,P＜0.05),前者滤泡上皮细胞的表达强度明显高于后者[(0.051±0.016)vs (0.016±0.010),P＜0.05].(3)caspase-3的表达阳性率在HT组明显高于对照组(92.31%vs 33.33%,P＜0.01),滤泡上皮细胞的表达强度明显高于对照组[(0.065±0.025)vs(0.022±0.008),P＜0.05].(4)TRAIL与caspase-3的表达程度呈正相关 (rs=0.631,P=0.001). 结论 TRAIL与caspase-3可能共同参与HT的病理演变过程,通过表达TRAIL激活caspase-3而诱导甲状腺滤泡细胞凋亡,损伤甲状腺组织.     

RNase P体外靶定切割人巨细胞病毒UL54 mRNA片段研究

目的：观察大肠埃希菌RNase P催化亚基M1 RNA在细胞外水平上对人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）DNA聚合酶UL54 mRNA的切割效果,探讨核酶作为新型抗病毒制剂的应用前景。方法：针对HCMVUL54 mRNA设计特异性的外部引导序列（external guide sequences,EGSs）EGS-T6,观察其引导M1 RNA特异的细胞外切割活性。结果：在EGS-T6引导下,大肠埃希菌RNase P催化亚基M1 RNA在细胞外可特异地对靶mRNA进行有效切割。结论：EGS-T6具备引导M1 RNA对UL54 mRNA特异切割的能力,可发展成一种新型抗病毒制剂。     

不育症患者精液中Caspase 3和Caspase 8检测的临床意义

目的 探讨不育症患者精子和精浆中Caspase 3和Caspase 8与精液常规参数的关系,并推测其可能的临床意义.方法 收集来该院门诊和海南医学院生殖中心就诊的患者标本76份,其中生育组20份,弱精组19份,少弱精组20份,无精组17份.所有标本均进行精子计算机辅助精子分析(CASA),然后分离精子精浆,采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测精子和精浆中Caspase 3和Caspase 8的含量.结果 ①所有被检测样本的精子和精浆中都检测到了Caspase 3和Caspase 8.②精浆中Caspase 3的平均含量和Caspase 8的平均含量均高于精子,且有统计学意义[(Caspase 3:(9.00±9.20)pmol/L vs(6.36±5.81)pmol/L,P＜0.05;Caspase 8:(17.32±11.23)pmol/L vs(12.72±7.42)pmol/L,P＜0.05].③精子中Caspase 8的平均含量都分别与精子密度、活动性和A级呈负相关;精浆中Caspase 8的平均含量分别与精子的A级呈负相关;精浆中Caspase 8的平均含量与精子密度呈负相关,均有统计学意义.④与生育组相比,仅少弱精组精子中Caspase 8含量较高,且差异有统计学意义(P＜0.05).结论 精浆中也存在Caspase,精子和精浆中Caspase 8含量可以反映精子的质量,主要与精子活动性相关.     

鼻咽癌组织中Caspase-3的表达与放疗敏感性的关系

①目的 探讨鼻咽癌组织中Caspase-3的表达及其与放疗敏感性的关系.②方法 采用免疫组化方法检测52例放疗前鼻咽癌活检组织中Caspase-3的表达.③结果 5年以上复发组Caspase-3表达高于3年以下复发组,差异有显著性.④结论 Caspase-3在一定程度上是反映鼻咽癌放疗敏感性和预测鼻咽癌放疗效果的重要指标.     

丁苯酞对大鼠脑缺血再灌注神经元形态和Caspase-9mRNA表达的影响

目的观察丁苯酞（dl-3n-butylphtalide，NBP）对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法应用Ban—nister等人的颈动脉血管引流法建立大鼠脑缺血再灌注动物模型，采用Caspase-9mRNA原住杂交技术，DAB显色，光镜观察细胞桨呈棕黄色为阳性细胞。经图像分析阳性细胞的多少，观察丁苯酞对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护。结果丁苯酞治疗纽与模型对照组比较，阳性细胞平均教密度减小，平均灰度值增大，组间比较有明显差异（P〈O．05）。结论观察丁苯酞对大鼠脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用。