软骨细胞外基质/壳聚糖复合多孔支架和骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨

[目的]探讨软骨细胞外基质和壳聚糖制备复合多孔支架,同时并对小鼠骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨的可行性进行观察.[方法]以猪关节软骨细胞外基质和壳聚糖为原料,采用冷冻干燥法制备软骨细胞外基质/壳聚糖复合多孔支架.通过扣描电镜观察材料内部结构及孔径大小,液体位移法测定材料的孔隙率,MTT方法检测支架浸提液毒性.将小鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离培养并用TGF-β1成软骨诱导后,与材料复合培养,扫描电镜观察细胞在材料上的生长粘附情况.[结果]软骨细胞外基质/壳聚精复合支架具有疏松多孔结构,孔径大小(159±36)μm,孔隙率为90.5%±2.3%,复合支架中的软骨细胞外基质成分甲苯胺蓝染色、番红O染色均呈阳性,MTT结果显示支架无细胞毒性.诱导的骨髓间充质干细胞在支架表面生长良好.[结论]软骨细胞外基质/壳聚糖复合材料具有合适的孔径和孔隙率,生物相容性良好,是组织工程软骨的良好支架载体.     

胶原/羟基磷灰石骨软骨一体化支架的生物学特性研究

[目的]对体外条件下胶原/羟基磷灰石一体化复合材料的生物学特性进行评价,探讨其作为骨软骨组织工程支架的可行性。[方法]以胶原和羟基磷灰石为原料,研制出由胶原逐层过渡到羟基磷灰石为主的一体化支架材料,其软骨层主要成分为胶原,骨层主要成分为羟基磷灰石。通过扫描电镜观察材料内部结构及孔径大小,液体位移法测定材料的孔隙率。将材料与兔骨髓基质细胞复合培养,MTT法测定细胞的生长曲线,扫描电镜观察细胞在材料上的生长粘附情况。[结果]胶原/羟基磷灰石一体化复合支架具有疏松多孔结构,其中软骨层孔径大小(90±15)μm,骨层孔径大小(120±20)μm,孔隙率(75±5.0)%。细胞在材料上生长良好。[结论]胶原/羟基磷灰石一体化复合材料具有适宜的孔隙结构和良好的生物相容性,可用作骨软骨组织工程支架材料。     

组织工程化骨膜的构建及其在体外的成骨活性检测

[目的]利用兔骨髓间充质干细胞与猪小肠粘膜下层复合构建组织工程骨膜,体外观察其生物学特性并检测成骨活性,为将来体内移植提供实验依据。[方法]以猪小肠粘膜下层基质作为支架材料,与新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)或体外成骨诱导培养后的BMSCs,采用沉淀法复合构建两种组织工程化骨膜(M2及M1),用MTT法检测种子细胞在支架材料上的生长情况;扫描电镜(SEM)观察种子细胞在支架材料上的生长、粘附状态;通过ELISA检测碱性磷酸酶活性和骨钙素分泌水平。[结果]种子细胞在SIS上生长良好,M2及M1在含有成骨诱导剂的培养基中培养可分泌一定量骨钙素(11 d达峰值),并表达碱性磷酸酶活性(7 d达峰值)。而且,Ml所分泌骨钙素的量与碱性磷酸酶活性高于M2,差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]利用兔骨髓间充质干细胞与猪小肠粘膜下层复合构建组织工程化骨膜能够保持较稳定的生物活性,种子细胞能良好地在支架上附着、生长增殖,并稳定地分泌一定量的骨钙素和碱性磷酸酶,在体外表达较强的成骨活性。     

软骨细胞外基质源性取向支架与骨髓基质干细胞体外软骨组织工程的初步研究

目的 制备关节软骨细胞外基质源性取向支架,观察其对体外培养的骨髓基质干细胞分布排列的影响,探索其用于修复关节软骨缺损的可行性.方法 收集天然猪关节软骨,在PBS溶液中超微湿法粉碎关节软骨,利用差速离心收集细胞外基质悬液;低温超速离心收集沉淀,制备成2%～3%悬液;采用定向结晶与冷冻干燥技术制备取向支架,应用紫外交联及碳化二亚胺交联.光学显微镜及扫描电镜观察支架的形态结构,冰冻切片后组织化学染色对支架进行定性分析;生物力学方法检测支架的力学特性.分离培养兔骨髓基质干细胞,PKH26标记,接种到支架上体外软骨诱导培养,倒置荧光显微镜及扫描电镜观察培养3 d内种子细胞在支架内的黏附、分布及排列方式.结果 制备的支架材料具有垂直取向排列的孔道结构,软骨细胞外基质特异性染色阳性,纵向压缩弹性模量为(2.02±0.02)MPa,横向压缩弹性模量为(0.264±0.16)MPa,具有各向异性的力学特点.体外培养显示骨髓基质干细胞广泛均匀地分布在支架内部,并且在支架材料表层呈平行排列,深层呈柱状排列,类似于天然软骨组织中细胞的排列方式.结论 以关节软骨细胞外基质材料制备的取向性组织工程支架,在生化组成和结构上仿生天然关节软骨细胞外基质,是一种较为理想的软骨组织工程支架.     

骨髓间充质细胞与速固化磷酸钙支架共培养的实验研究

[目的]观察人骨髓间充质干细胞在速固化磷酸钙骨水泥支架中的增殖和生长情况。[方法]将速固化壳聚糖-磷酸钙骨水泥支架材料预先成形。采用全骨髓法分离人骨髓间充质细胞并在体外对细胞进行培养和扩增。72h首次换液,细胞融合80%传代,取第3代细胞用于实验。将细胞与磷酸钙骨水泥支架复合培养,分别利用四甲基偶氮唑蓝MTT法及扫描电镜等检测细胞在材料中的增殖和生长情况。[结果]用酶标仪检测OD值提示共培养后,支架内的细胞数量逐渐增加。扫描电镜结果显示支架材料内部为多孔结构,孔内见有细胞生长,细胞表面可见分泌颗粒。[结论]速固化壳聚糖-磷酸钙骨水泥对人骨髓间充质干细胞有较好的细胞相容性,细胞可在材料内黏附和增殖,是理想的骨组织工程支架材料。     

骨髓间充质干细胞复合组织工程化脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤

目的：体外培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs），复合组织工程化脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤，为进一步临床应用奠定基础。方法：将SD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增后，以生长状态良好的骨髓间充质干细胞接种于制备好的组织工程化脱细胞真皮支架上，进行体外联合培养，构建组织工程皮肤。观察细胞生长情况及组织工程皮肤结构。结果：体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞生长良好，传代扩增容易，组织工程化脱细胞真皮基质去细胞完全，骨髓间充质干细胞在脱细胞真皮基质中生长良好，可体外构建组织工程皮肤。结论：利用体外扩增培养的骨髓间充质干细胞及制备的组织工程化脱细胞真皮基质可以体外联合构建组织工程皮肤。     

脱蛋白骨复合纤维蛋白胶构建骨组织工程支架的体外实验研究

[目的]探讨复合纤维蛋白胶的脱蛋白骨与单纯脱蛋白骨作为骨髓基质干细胞（MSCs）支架材料的差异，为骨组织工程提供合适的复合支架材料。[方法]实验组使用复合纤维蛋白胶的脱蛋白骨与MSCs复合培养，对照组用单纯脱蛋白骨与MSCs复合培养，取不同时间点进行光学显微镜观察、扫描电镜观察、细胞DNA含量检测及钙结节染色比较两组细胞的情况。[结果]实验组骨髓基质干细胞在黏附能力与分泌情况明显优于对照组，细胞DNA检测表明实验组细胞增殖明显优于对照组（P〈0．05）。[结论]复合纤维蛋白胶的脱蛋白骨比单纯脱蛋白骨更适合细胞生长，可作为MSCs的载体应用于骨组织工程的构建。     

壳聚糖-藻酸盐多通道支架材料细胞相容性研究

[目的]通过体外细胞毒性试验,细胞与支架材料复合培养实验和体内植入试验,评价壳聚糖-藻酸盐支架材料的细胞相容性。[方法]通过冷冻干燥法制备具有纵行、平行排列通道的壳聚糖-藻酸盐支架材料。将大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow derived stromalcell,BMSCs)与其浸提液培养,采用MTT法检测培养1、3、5d时支架材料的细胞毒性。在体外将BMSCs与壳聚糖-藻酸盐支架材料复合培养3、5、7d后行扫描电镜检测,并将其植入急性脊髓半横断损伤模型中,6周后行免疫荧光检测BMSCs在材料中的生长与分化情况。[结果]MTT法检测示壳聚糖-藻酸盐支架材料的细胞毒性为0-1级。扫描电镜观察细胞在支架材料复合培养3d后即可粘附于支架材料表面,细胞呈一定方向排列。术后6周,Neurofilament200、NSE免疫荧光检测证实,支架材料内有大量BMSCs存活,部分向神经元样细胞分化。[结论]壳聚糖-藻酸盐支架具有良好的细胞相容性,有望成为一种较理想的神经组织工程支架材料。     

具有缓释rhBMP-2作用的仿生骨支架的构建及其体外生物活性评价

[目的]构建纳米羟基磷灰石/明胶/纤维蛋白胶/rhBMP-2三维多孔隙仿生型支架,体外研究其控制rh-BMP-2释放及其对人骨髓基质干细胞(hBMSCs)增殖、黏附及分化的影响。[方法]利用二次冷冻干燥法制备nHA/明胶/FS/rhBMP-2复合支架,电镜观察支架内部结构及孔隙率。ELISA法测定rhBMP-2体外释放情况;通过电镜观察、DNA、碱性磷酸酶(ALP)含量测定及免疫组化观察细胞在材料表面黏附、增殖及成骨分化情况。[结果]电镜观察显示支架材料具备三维孔隙性结构,孔径约为164.48μm±31.2μm,孔隙率为87.9%±2.01%;细胞在材料表面均匀黏附,生长状态良好,并有基质分泌。rhBMP-2从支架内部缓慢释放达40 d左右;细胞与材料共培养5 d,其DNA与碱性磷酸酶含量显著性增高,与空白对照组相比具有统计学差异(P<0.01);与材料共培养7 d,细胞骨钙素、Ⅰ型胶原免疫组化染色呈强阳性,共培养14 d时四环素荧光显示钙结节形成。[结论]制备的支架材料具备与自然骨相似的三维孔隙性结构及组分,同时缓释rhBMP-2,促进BMSCs黏附、增殖及成骨分化的能力。     

一体化层状梯度修复体用于骨软骨组织工程的实验研究

[目的]探索胶原／壳聚糖／纳米β-磷酸三钙一体化层状梯度修复体在组织工程中用作骨软骨缺损修复的可行性。[方法]以Ⅰ型胶原、壳聚糖、纳米β-磷酸三钙（β-TCP）为基本原料，采用无毒交联并通过冷冻干燥法成型；扫描电镜观察，测定支架材料的孔径、孔隙率以及交通孔情况；分离扩增兔骨髓间充质干细胞（BMSC），将BMSC接种于材料上，扫描电镜观察细胞在材料上的黏附状态，MTT法测定细胞在材料上的生长曲线；以软骨诱导液体外诱导细胞-支架复合物向软骨分化，2周后植入自体股部肌袋，6周取材，HE、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化效果。[结果]材料疏松多孔，孔径大于100μm，孔隙率大于95％。细胞在材料上黏附状态良好，并且增殖迅速。BMSC-材料复合体经体外三维诱导后可在自体异位向软骨分化。[结论]Ⅰ型胶原／壳聚糖／纳米TCP一体化层状梯度修复体具有良好的孔隙结构和生物相容性，有望成为一种新型的组织工程支架材料用于骨软骨缺损修复。     

In vitro differentiation of chick embryo bone marrow stromal cells into cartilaginous and bone-like tissues

Bone marrow stromal cells, progenitor cells involved in repair of bone and cartilage, can potentially provide a source for autologous skeletal tissue engineering. We investigated which factors were required to induce in vitro differentiation of avian bone marrow stromal cells into three-dimensional cartilaginous and bone-like tissues. Bone marrow stromal cells from embryonic chicks were expanded in monolayers, seeded onto biodegradable polyglycolic acid scaffolds, and cultured for 4 weeks in orbitally mixed Petri dishes. Cell-polymer constructs developed an organized extracellular matrix containing glycosaminoglycans and collagen, whereas control bone marrow stromal cell pellet cultures were smaller and consisted predominantly of fibrous tissue. Bone marrow stromal cells expanded with fibroblast growth factor-2 and seeded onto polymer scaffolds formed highly homogeneous three-dimensional tissues that contained cartilage-specific molecular markers and had biochemical compositions comparable with avian epiphyseal cartilage. When cell-polymer constructs were cultured in the presence of beta-glycerophosphate and dexamethasone, the extracellular matrix mineralized and bone-specific proteins were expressed. Our work shows that cell expansion in the presence of fibroblast growth factor-2 and cultivation on a three-dimensional polymer scaffold allows differentiation of chick bone marrow stromal cells into three-dimensional cartilaginous tissues. In the in vitro system studied, the same population could be selectively induced to regenerate either cartilaginous or bonelike tissue.     

种植骨髓基质细胞的骨组织工程学研究

目的 观察骨髓基质细胞在多孔状的人工骨块上三维立体培养后的生长情况及其复合植入体内后的成骨能力。方法 利用组织工程学方法,将骨髓基质细胞种植于羟基磷灰石人工骨块上,立体培养２周,用扫描电镜观察细胞在体外的生长情况;将上述细胞人工骨复合体自体异位植入体内,取材观察其植入体内后的成骨情况。结果 细胞在人工骨块上能立体培养成活,细胞多生长于周边的孔隙表面,尤其以贴近培养瓶底的那一边较多,骨块的中心部位未     

Optimization of bone tissue engineering in goats: a peroperative seeding method using cryopreserved cells and localized bone formation in calcium phosphate scaffolds

BACKGROUND: Bone tissue engineering by combining cultured bone marrow stromal cells with a porous scaffold is a promising alternative for the autologous bone graft. Drawbacks of the technique include the delay necessary for cell culture and the complicated logistics. We investigated methods to bypass these drawbacks. Furthermore, we investigated the localization of bone formation inside the scaffold. METHODS: Bone marrow stromal cells from seven goats were culture expanded and cryopreserved. One week before surgery, some of the cells were thawed, cultured, and seeded on porous calcium phosphate scaffolds. The constructs were cultured for another week until implantation. The remaining cryopreserved cells were thawed just before implantation and peroperatively resuspended in plasma before combining with the scaffold. Scaffolds impregnated with fresh bone marrow, devitalized cultured constructs, and empty scaffolds served as controls. All samples were implanted in the back muscles of the goats for 9 weeks. RESULTS: Histologic examination showed minimal (<1%) bone in the empty and devitalized scaffolds, 4.2 +/- 5.1 bone area percent in the bone marrow samples, and significantly more bone in both the cultured and peroperatively seeded constructs (11.7 +/- 2.5 and 14.0 +/- 2.0%). The peripheral 350 microm of the implants contained significantly less bone. CONCLUSION: Peroperative preparation of osteogenic constructs with cryopreserved cells is feasible. These constructs yield substantially more bone than the scaffolds alone or scaffolds impregnated with fresh bone marrow. Bone deposition is much less on the scaffold periphery.     

3D打印PLA-HA复合材料与骨髓基质细胞的相容性研究

目的 探讨骨髓基质细胞与3D打印聚乳酸-羟基磷灰石(Three-dimensional printed polylactic acid-hydroxyapatite,3D printed PLA-HA)复合支架材料的相容性,为骨组织工程选择合适的支架材料提供理论依据。方法将标记绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的骨髓基质细胞分别与3D打印PLA-HA复合材料和β-磷酸三钙(betatricalcium phosphate,β-TCP)材料体外复合培养,采用荧光显微镜观察细胞在支架材料上的生长黏附情况,并通过扫描电镜观察细胞在支架中的形态变化;CCK8(Cell Counting Kit8)法检测细胞于不同时间点在材料上的黏附率以及增殖情况;碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性测定法检测3 d、7 d、14 d的碱性磷酸酶活性变化。结果 骨髓基质细胞能够在3D打印PLA-HA复合材料和β-TCP材料上黏附生长;β-TCP组细胞黏附率高于3D打印PLA-HA组(P<0.05),但3D打印PLA-HA组在12 h细胞黏附率可达到60%以上;细胞增殖实验显示,3D打印PLA-HA组在体外培养第4天和第7天的细胞增殖量(OD值)均高于β-TCP组与对照组(P<0.05);3D打印PLA-HA组以及β-TCP组在第3天、第7天和第14天的ALP含量均高于对照组,且3D打印PLA-HA组第7天ALP含量较β-TCP组增多(P<0.05)。结论 3D打印PLA-HA复合材料具有良好的细胞相容性,可作为骨组织工程的支架材料。     

骨髓基质成骨细胞复合支架材料构建组织工程性肌骨瓣的实验研究

目的探索用羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)的支架材料与成骨细胞复合构成组织工程性肌骨瓣修复骨缺损的能力。方法自2004年12月至2005年5月,于新西兰大耳白兔髂后上棘抽取骨髓基质干细胞并诱导分化为成骨细胞,然后与HA/TCP结合,共培养2周,通过相差显微镜、扫描电镜观察体外细胞生长情况,最后将复合物埋入兔的背阔肌下构成组织工程性肌骨瓣。术后6周进行大体解剖观察,HE染色,研究组织工程性肌骨瓣的生长情况。结果扫描电镜显示支架材料表面和孔隙内均有成骨细胞生长,有良好的增殖活动性和稳定细胞表型,材料中心区未见细胞生长,植入体内6周后取材见内植物有新骨形成,多位于内植物表面,可见成骨细胞、骨细胞、髓腔样结构、板层样骨基质等正常骨组织结构。结论骨髓来源的成骨细胞可用作骨组织工程的种子细胞,此种组织工程性肌骨瓣生长良好,可成功构建组织工程化骨。     

BMP-2基因转染的人骨髓基质干细胞复合PLA/PCL支架体外构建组织工程骨

目的　用人骨形态发生蛋白 2腺病毒表达载体 (Ad -BMP - 2 )转染的人骨髓基质干细胞 (hBMSC) ,复合PLA/PCL(聚乳酸 /聚己内酯 )生物降解支架体外构建组织工程骨。方法　用Ad -BMP - 2转染体外培养的成人BMSC ,免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹方法检测细胞BMP - 2的表达 ,并通过流式细胞仪和ALP活性检测分析其对细胞增殖、分化的影响。然后将转染后细胞接种到PLA/PCL支架上 ,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果　转染后 ,hBMP - 2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达 ;S期细胞比例和ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀 ,伸展良好。结论　Ad-BMP - 2可高效转染hBMSC ,且促进细胞增殖及成骨转化。转染后细胞在PLA/PCL上生长良好 ,BMP - 2基因治疗的组织工程骨构建成功     

兔骨髓基质细胞的分离培养

目的 为骨组织工程寻找一种理想的种子细胞。方法 采取兔骨髓组织，应用梯度离心获取骨髓基质细胞，体外培养传代，通过光镜、透射电镜及成骨特性的鉴定，观察细胞的形态、生长特点及成骨特性。结果 培养的骨髓基质细胞形态多为三角形或梭形，生长增殖迅速，具有成骨能力，易于定向分化为成骨细胞。结论 自骨髓获得的骨髓基质细胞具有明显的增殖能力和成骨活性，可以做为骨组织工程中比较理想的种子细胞。     

转染BMP-2基因的兔BMSCs种植PLA/PCL支架体外构建组织工程骨

目的:用腺病毒载体将人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因导入兔骨髓基质干细胞(BMSCs),种植PLA/PCL(聚乳酸/聚己内酯)支架体外构建组织工程骨.方法:蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达,流式细胞仪和ALP活性检测分析基因转染对细胞增殖分化的影响.然后将转染后细胞接种到PLA/PCL支架上,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况.结果:转染后,BMSCs表达BMP-2,S期细胞比例和ALP活性明显增高.扫描电镜见转染细胞分布均匀,伸展良好.结论:BMP-2基因转染BMSCs,可促进细胞增殖分化.转染后细胞在PLA/PCL支架上生长良好,BMP-2基因治疗的组织工程骨构建成功.     

人骨髓基质细胞接种珊瑚构建组织工程骨

目的：观察体外培养的人骨髓基质细胞与珊瑚复合物植入体内后的成骨能力。方法：穿刺抽吸入髂骨区骨髓基质细胞，体外培养扩增、诱导，将其与珊瑚复合后植入裸鼠体内，以单纯珊瑚作为对照。术后4、8周取材，通过大体、组织学、扫描电镜观察植入物体内成骨情况。结果：术后4周，复合物中有少量新骨形成；术后8周，复合物中出现大量成熟骨组织。而对照组无骨组织形成。结论：人骨髓基质细胞复合珊瑚在无免疫动物体内具有成骨能力，穿刺抽吸的人骨髓基质细胞可作为骨组织工程的种子细胞。