人α-突触核蛋白基因慢病毒稳定转染PC12细胞系的建立及其凋亡检测

目的 构建及鉴定人野生型和突变型α-突触核蛋白(SNCA和SNCAmu)基因慢病毒表达载体,并观察在体外大鼠嗜铬细胞瘤细胞中的表达。方法 在引物合成后采用PCR技术扩增目的基因,并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒[pGC-FU,含绿色荧光蛋白(GFP)基因]中,构建SNCA基因慢病毒载体表达质粒(pGC-FU-SNCA-GFP)和SNCAmu基因慢病毒载体表达质粒(pGC-FU-SNCAmu-GFP),通过酶切、测序验证后,将pGC-FU-SNCA-GFP、pGC-FU-SNCAmu-GFP质粒和包装质粒pHelperi.0、pHelper2.0共同转染大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞),获得稳定转染。结果 通过检测标签蛋白GFP和目的蛋白,进一步验证pGC-FU-SNCA-GFP和pGC-FU-SNCAmu-GFP在靶细胞中的表达。通过噻唑蓝比色法检测稳定转染后细胞凋亡水平,稳定表达SNCA组(OE组)、SNCAmu组(OEm组)、不加慢病毒质粒的空白对照组(CON组)和加pGC-FU-GFP空载体对照组(NC组)共4组细胞,病毒转染后不同时间(1、2、3、4、5d)细胞增殖变缓(F =4.534、196.285、411.829、1282.049、3135.559,均P＜0.05)。碘化丙锭单染法检测细胞周期,CON组、NC组、OE组和OEm组G1期、G2期和M期细胞百分比差异有统计学意义(F= 885.79、45.03、207.11,均P＜0.05),其中G1期细胞百分比(％)较高(CON组：59.10±0.35、NC组：68.24±0.60、OE组：71.73 ±0.11、OEm组：74.66±0.35)。结论 人SNCA和SNCAmu基因转染到PC12细胞中,成功建立稳定表达的细胞系,并且对细胞凋亡水平和细胞周期有一定程度的改变。     

稳定过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-突触核蛋白单克隆SH-SY5Y细胞株的建立

目的利用分子克隆技术构建含人野生型(WT)及致病突变A30P(G88C)、A53T(G157A)α-突触核蛋白基因(α-synuclein gene,SNCA)的重组真核表达载体pLentiVENUS-YFP-SNCA,通过慢病毒转染的方法获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-synuclein单克隆SH-SY5Y细胞株。方法提取红白血病细胞K562细胞总RNA,以RT-PCR法扩增SNCA,SNCA与克隆载体PMD-19T的体外连接(T-A克隆)后进行基因测序,将测序正确者以限制性内切酶酶切后与真核表达载体pLentiVENUS连接,建立野生型重组真核表达载体。取正常SNCA与克隆载体连接体,利用单核苷酸差异引物定点突变法构建SNCA的两个突变型A30P、A53T,经基因测序、酶切与真核表达载体pLentiVENUS连接,建立突变型的重组真核表达载体。以磷酸钙沉淀法转染293T细胞制备的慢病毒转染SH-SY5Y细胞,利用流式细胞仪BD AriaⅢ进行96孔板单细胞分选以获得稳定过表达人野生型及致病突变型A30P、A53Tα-突触核蛋白的单克隆细胞株,并通过倒置荧光显微镜、蛋白免疫印迹、逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriotion-polymerase chain reaction,Rt-PCR)、鉴定各单克隆SHSY5Y细胞株是否过表达。结果 Rt-PCR及电泳结果显示所获得目的基因,基因测序结果正确;重组真核表达载体pLentiVENUS-SNCA经限制性内切酶酶切和基因测序证明构建成功。倒置荧光显微镜显示除对照组(未转染组)外,空载体转染组及载体与SNCA重组后转染组均有荧光蛋白表达;但蛋白免疫印迹结果显示载体与正常或突变的SNCA重组后转染组的蛋白含量高于空载体组。RT-PCR结果显示载体与正常或突变的SNCA重组后转染组的细胞RNA表达量高于空载体组。结论利用分子克隆技术和慢病毒转染技术成功建立过表达α-突触核蛋白的WT及A53T、A30P突变型SH-SY5Y单克隆细胞株。     

NT-3基因过表达慢病毒载体的构建和包装及鉴定

目的构建神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)基因慢病毒载体,检测其在大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)中的表达。方法体外扩增NT-3,将NT-3全长载体GV287-GFP与扩增出的NT-3用AgeI进行酶切,将NT-3全长序列克隆入GV-287-GFP,转化大肠杆菌DHS a感受态细胞,筛选出阳性克隆进行基因测序。重组GV287-EGFP质粒、pHelper 1.0质粒和pHelper 2.0质粒三质粒共转染至包装细胞293T,培养48 h后收集细胞上清液,将病毒浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度,并检测慢病毒载体在MSCs的转染效率。荧光显微镜观察转染是否成功,RT-PCR和Western blot检测MSCs细胞中NT-3蛋白的表达。结果测序结果和Western blot检测均证明NT-3慢病毒载体构建正确,且在细胞中正确表达。与辅助质粒共包装细胞获得慢病毒颗粒,并成功感染MSCs细胞。包装慢病毒、浓缩病毒悬液的滴度为2×109/ml慢病毒浓缩液。结论成功构建了稳定高效表达NT-3基因的慢病毒载体。     

Beclin1 基因慢病毒表达载体的构建和鉴定*☆

背景：Beclin1基因是哺乳动物的自噬调控基因。 目的：实验拟构建Beclin1 基因慢病毒过表达载体。 方法：聚合酶链反应扩增目的基因Beclin1 后插入慢病毒表达载体pLenex中,构建重组载体pLenex-Beclin1。使用聚合酶链反应、双酶切和DNA的测序方法对其进行鉴定,并与辅助包装质粒共感染293T细胞。慢病毒颗粒转染非小细胞肺癌A549细胞后,用蛋白质印迹法检测Beclin1 基因的过表达效率。 结果与结论：聚合酶链反应鉴定结果显示扩增的阳性片段已插入pLenex载体,聚合酶链反应、双酶切和DNA测序结果表明,重组慢病毒载体pLenex-Beclin1 的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染A549细胞后,细胞内Beclin1蛋白高效表达。结果证实,实验成功构建了Beclin1 基因慢病毒过表达载体。     

大鼠GAD65基因慢病毒载体的构建及其在MSCs中的表达

目的构建谷氨酸脱羧酶65(glutamic acid decarboxylase 65,GAD65)重组慢病毒表达载体,感染间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)并进行鉴定。方法 PCR法扩增GAD65基因,构建LV5-GFP-GAD65慢病毒载体;与包装质粒共转染293T细胞包装病毒;将慢病毒感染大鼠MSCs,荧光显微镜鉴定转染率,Western blot检测GAD65的表达。结果双酶切及测序结果表明LV5-GFP-GAD65慢病毒载体构建成功;包装病毒产生的病毒液滴度为5×107TU/ml;慢病毒感染大鼠MSCs的转染率高于90%,Western blot结果显示GAD65蛋白表达比对照组明显升高。结论 GAD65重组慢病毒载体构建成功,包装得到高浓度病毒液,感染大鼠MSCs能稳定过表达GAD65蛋白,为进一步探索侧脑室注射基因化的MSCs治疗癫痫奠定实验基础。     

LRIG1基因过表达慢病毒载体的构建和鉴定

目的探讨构建人类富含亮氨酸重复和免疫球蛋白样结构域1(LRIG1)基因过表达慢病毒表达载体并转染胶质瘤细胞系U87细胞的技术方法,为研究LRIG1的功能提供帮助。方法用EcoRⅠ及BamHⅠ双酶切LRIG1基因和plvxDsRed-monomer-n1慢病毒载体,琼脂糖凝电泳回收LRIG1片段和载体片段;通过T4连接酶将LRIG1基因连接至慢病毒载体上;按Lenti-XHT慢病毒包装试剂盒说明包装慢病毒;用EcoRⅠ及BamHⅠ双酶切法鉴定重组慢病毒载体;然后用plvxDsRed-monomer-n1和plvxDsRed-monomer-n1-3×flagLRIG1分别转染293T细胞和胶质瘤细胞系U87细胞,荧光定量PCR和western blot检测LRIG1 m RNA和蛋白表达。结果 U87细胞感染病毒载体后经嘌呤霉素筛选显示细胞红色荧光较空载体感染细胞减弱;实时PCR结果显示LRIG1 m RNA过表达组较对照明显升高;提取感染后细胞蛋白,Western blot鉴定flag标签蛋白表达成功。结论 LRIG1基因慢病毒表达载体能感染胶质瘤细胞系U87细胞,可使外源基因获得稳定表达。     

人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒表达载体的构建

外源性端粒酶反转录酶的表达可重建端粒酶活性,诱导细胞永生化。 目的：采用慢病毒载体作为基因转移载体,克隆人端粒酶反转录酶的编码区全序列,同时选用绿色荧光蛋白作为目的基因表达标志物,构建人端粒酶反转录酶慢病毒表达载体。 设计、时间及地点：开放性实验,单一样本观察,于2007-06/2008-03 在暨南大学生物工程研究所及暨南大学附属第一医院中心实验室完成。 材料：pBABE-puro-hTERT质粒由Robert Weinberg教授惠赠,质粒pDONR221,pLenti6/V5-DEST,ccdB Survival,Stbl3及293FT细胞由暨南大学生物工程研究所提供。 方法：以pBABE-puro-hTERT质粒为模板聚合酶链反应法获取目的基因人端粒酶反转录酶（包含酶切位点BglⅡ、HindⅢ）,通过BP反应克隆至pDONR221,以质粒pEGFP-N1为模板,以聚合酶链反应法获取目的基因增强型绿色荧光蛋白(包含酶切位点Hind Ⅲ,Bg Ⅲ),通过酶切及连接反应形成pDONR221-hTERT-EGFP。采用LR重组酶将pDONR221-hTERT-EGFP和pLenti6/V5-DEST进行重组反应,形成pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP。将pLenti6/V5-DEST- hTERT-EGFP与包装质粒混合,利用脂质体共转染293FT细胞。 主要观察指标：通过酶切、聚合酶链式反应及测序验证重组质粒pDONR221-hTERT-EGFP和pLenti6/V5-DEST- hTERT-EGFP是否构建成功。包装重组慢病毒,应用荧光显微镜观察报告基因绿色荧光蛋白在293FT细胞中的表达情况。 结果：测序发现慢病毒入门载体pDONR221包含目的基因hTERT 1 547位点存在点突变(原碱基A变成G）,通过定点突变技术成功诱变并鉴定慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP成功构建。转染后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光。 结论：实验成功构建了人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白融合基因的慢病毒表达载体,为人端粒酶反转录酶稳定转染提供快速、简洁的方法。     

构建携带重组人胰岛素基因慢病毒表达载体及其病毒包装

背景：腺病毒载体作为脂肪组织工程转基因载体,在应用中存在转导细胞免疫排斥及炎症反应等问题。应用慢病毒作为载体转染干细胞尤其是应用含胰岛素基因的慢病毒载体转染干细胞可避免腺病毒载体的诸多问题。 目的：实验拟构建含有人重组胰岛素(insulin)与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并进行病毒颗粒包装。 方法：应用聚合酶链反应方法获得目的基因,在目的基因上、下游分别加上BamHⅠ,AscⅠ两个酶切位点,进行T载体克隆,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选获得重组质粒。用限制性内切酶酶切,将目的基因片段和pLenti6.3-IRES-EGFP载体连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选获得慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并进行测序。抽提慢病毒载体,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度。 结果与结论：通过聚合酶链反应获得长度为347 bp带有BamHⅠ和AscⅠ序列的目的基因。pMD18-T 载体和慢病毒表达载体pLenti6.3-IRES-EGFP连接,慢病毒表达载体pLenti6.3 -insulin-IRES-EGFP构建与预期相匹配,成功包装慢病毒颗粒。     

Nesprin基因RNAi慢病毒载体的构建*

背景：Nesprin蛋白缺失将影响细胞骨架组织和动态平衡,引起细胞骨架刚性丧失或导致细胞过早成熟老化,其对间充质干细胞的作用如何？ 目的：构建Nesprin蛋白siRNA慢病毒载体,并转染骨髓间充质干细胞。 方法：针对Nesprin靶基因序列设计并合成4对miRNA oligo,将4种miRNA干扰质粒转入大鼠血管平滑肌细胞,筛选最有效干扰序列;将最佳干扰序列和pDONR221载体进行重组反应,获得含干扰序列的入门载体,再将入门载体和慢病毒表达目的载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应,获得含干扰序列的慢病毒表达载体,转染包装细胞293T细胞,包装慢病毒,以293T细胞GFP蛋白水平测定病毒滴度。慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞。 结果与结论：测序证实合成的4对miRNA oligo正确,RT-PCR和western-blot筛选出最佳干扰miRNA质粒为SR-3,成功构建了Nesprin siRNA的慢病毒载体LV-siNesprin。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的活性滴度为106 TU/mL。慢病毒成功了转染骨髓间充质干细胞细胞。     

hTfR报告基因慢病毒载体构建及其在神经干细胞的表达研究

目的 探讨人转铁蛋白受体(hTfR)基因慢病毒载体构建方法及其在神经干细胞(NSCs)中的表达情况,为NSCs的MR分子成像提供实验基础. 方法 利用聚合酶链反应技术(PCR)扩增hTfR基因,并克隆到pLenti6.3载体,构建出慢病毒表达载体pLentiI6.3-hTfR-IRES-EGFP.利用Lipofectin2000试剂将PLP1、PLP2、PLP-VSVG和pLenti6.3-hTfR-IRES-EGFP共转染293T细胞进行慢病毒包装,48 h后收集病毒上清,体外感染NSCs.细胞流式筛选稳定表达hTfR的细胞,通过实时定量PCR和Western boltting检测hTfR的表达,细胞免疫荧光技术对过表达的hTfR进行亚细胞的定位. 结果 成功构建hTfR基因慢病毒表达载体,包装的慢病毒颗粒成功感染NSCs.实时定量PCR和Western boltting鉴定出hTfR在NSCs中过表达,hTfR基因表达相对值为2.275±0.281.细胞免疫荧光检测到过表达的hTfR主要在细胞膜上表达.NSCs分化后,hTfR在胶质细胞和神经元中稳定表达. 结论 本研究所用方法能成功构建hTfR慢病毒表达载体并筛选出稳定表达hTfR的NSCs系,为下一步活体内移植NSCs行MR分子成像实验研究奠定了基础.     

miR-221基因干扰慢病毒载体的构建及其有效靶序列的筛选与表达检测

目的 构建携带人miR-221 基因的miRNA 干扰慢病毒载体并寻找其有效靶序列,为胶质瘤的研究提供一种新的方法.方法 合成含干扰序列的双链DNA oligo 直接连入酶切后的RNA 干扰载体上.将产物转入细菌感受态细胞,对长出的克隆进行PCR 鉴定,阳性克隆即为目的 基因RNA 干扰慢病毒载体质粒.再将目的 基因与目的 载体分别进行双酶切,纯化酶切产物后进行定向连接,其产物转入细菌感受态细胞,再对PCR 鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,比对正确即为融合蛋白过表达质粒载体,然后将两种质粒共转染入293T 细胞,用western bolt 法检测其有效敲减靶序列.结果 重组质粒经测序鉴定证明各转录模板完整、正确插入到相应质粒中,共转染后发现编号为PscSI576 的靶点干扰效果最好.结论 本实验成功构建了人miR-221 基因的RNA 干扰慢病毒载体,并找到了有效的干扰靶序列.     

人EGFL7基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建人类表皮生长因子域7（EGFL7）基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体。方法将靶向EGFL7基因的短发夹结构RNA（shRNA）表达序列连接到包含U6启动子及绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的慢病毒载体pGCL-GFP中,获得重组质粒,命名为pGCL-GFP-vshEGFL7,经多聚酶链反应（PCR）和测序鉴定后,与慢病毒包装质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0通过lipofectamine 2000共转染至包装细胞293T,包装产生病毒液,测定其滴度。结果PCR扩增和测序结果证实EGFL7shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为4.8×107TU/ml。结论成功构建人EGFL7基因shRNA慢病毒载体。     

表达VASH1基因的人脑胶质瘤U-87MG细胞对化疗药物敏感性的变化

目的 探讨表达人血管生成抑制因子１（VASH1）的人脑胶质瘤U-87MG细胞对化疗药物的敏感性变化。方法 构建针对VASH1的慢病毒载体pGCL-GFP-VASH1,经测序鉴定后转染293T细胞,筛选出适合浓度的慢病毒转染人脑胶质瘤U-87MG细胞,荧光显微镜下检测转染效率;通过RT-PCR和Western blot分析U-87MG细胞VASH1 mRNA和蛋白表达水平;用CCK-8法检测U-87MG细胞在化疗药物顺铂和替莫唑胺作用下的存活率。流式细胞仪检测U-87MG细胞凋亡。结果 成功构建pGCL-GFP-VASH1慢病毒载体,并成功转染U-87MG细胞,转染率达70％以上;RT-PCR和Western blot结果证实转染VASH1慢病毒载体的U-87MG细胞表达VASH1 mRNA和蛋白。在顺铂或替莫唑胺作用下,表达VASH1的U-87MG细胞存活率均较未表达VASH1的U-87MG细胞明显降低（P<0.01）,而且U-87MG细胞凋亡率明显增加（P<0.01）。结论 VASH1慢病毒载体转染U-87MG细胞可使其稳定表达VASH1,并提高人脑胶质瘤U-87MG细胞对化疗药物敏感性、增加细胞凋亡率。     

慢病毒载体介导的截短肌营养不良蛋白cDNA的表达

目的 探讨慢病毒载体介导的截短肌营养不良蛋白cDNA表达的可行性。方法 将PCR克隆所构建的三个截短的肌营养不良蛋白cDNA插入到慢病毒载体，再将此载体转染至293Ad^3＋细胞中包装为重组病毒。用重组病毒感染培养的鼠成肌细胞，通过蛋白免疫印迹检测鼠成肌细胞中截短肌营养不良蛋白cDNA的表达。结果 用PCR克隆所构建的三个截短肌营养不良蛋白cDNA通过慢病毒载体导入鼠成肌细胞后均可表达出特异产物。结论 慢病毒载体可介导截短肌营养不良蛋白cDNA的表达，截短肌营养不良蛋白cDNA和慢病毒载体分别有望作为基因治疗Duchenne肌营养不良的目的基因和载体。     

携带大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因重组慢病毒载体的构建及体外表达检测

目的 构建携带大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因重组慢病毒载体,并检测其体外表达目的 基因的能力.方法 应用基因克隆技术将大鼠BDNF基因克隆人慢病毒载体pFUW中,经过PCR、酶切和测序鉴定后,与包装质粒共转染293T细胞,制备并收集携带BDNF基因的慢病毒,重组病毒感染体外培养Hela细胞,利用实时定量PCR、蛋白质免疫印迹方法检测BDNF的表达情况,观察病毒转染效果.结果 PCR、酶切和测序鉴定,成功克隆了pFUW-BDNF重组子.所包装的重组慢病毒对Hela细胞的感染效率>90%,实时定量PCR、蛋白质免疫印迹方法可以检测到重组慢病毒感染Hela细胞后能高水平表达BDNF.结论 成功构建了携带BDNF基因慢重组病毒载体,并可在体外高水平表达其所携带的目的 基因,为将其进一步应用于神经系统损伤性疾病的治疗研究奠定了方法学某础.

Abstract：

Objective To construct lentiviral vector encoding the SD rat brain derived neurotrophic factor (BDNF) gene and examine its ability to express the BDNF gene in vitro. Methods The specific BDNF sequence was cloned into the plasmid of pFUW to construct the BDNF expression plasmid pFUW-BDNF. The recombinant plasmids were identified by DNA sequencing and restriction digestion. Then the packaging cell lines (293T cell) were cotransfected with the pFUW-BDNF together with the plasmids pLP1, pLP2 and pLP/VSVG by phosphate-calcium deposit method. The recombinant lentiviral vector was used to infecte the Hela cell, the expression of BDNF was detected by real-time quantitative PCR and western blot. Results The results showed the recombinant lentiviral vector carrying BDNF gene was constructed successfully and its infection efficiency in hela cell was above 90%. The recombinant lentiviral vector could up-regulated the expression of the BDNF gene. Conclusions The lentiviral vector carrying BDNF gene can enhance the expression of BDNF gene significantly,which lays the basis for its application in the treatment of the neurodamaged disease.     

Expression of truncated dystrophin cDNAs mediated by a lentiviral vector

Background: The success of Duchenne muscular dystrophy gene therapy requires promising tools for gene delivery and mini-gene cassettes that can express therapeutic levels of a functional protein. Aims: To explore the expression feasibility of truncated dystrophin cDNAs mediated by a lentiviral vector derived from feline immunodeficiency virus. Materials and Methods: Three truncated dystrophin cDNAs were constructed by PCR cloning, then these cDNAs were inserted into lentiviral vectors. Recombinant lentiviruses were generated by transient transfection of lentiviral vector constructs into 293Ad 5+ cells. Cultured myoblasts were then infected with recombinant lentiviruses. Expression of truncated dystrophin cDNAs was detected by Western blot analysis. Results: Mediated by lentiviral vectors, three cDNAs constructed by PCR cloning expressed relative truncated dystrophins in cultured myoblasts. Conclusions: Truncated dystrophin cDNAs can express themselves successfully mediated by feline immunodeficiency virus vectors. It offers the possibility of an approach utilizing truncated dystrophin cDNAs and lentiviral vectors toward gene therapy of Duchenne muscular dystrophy.